Extracto
La autofagia es un proceso celular crítica necesaria para el mantenimiento de la homeostasis celular en estados de salud y enfermedad, pero los mecanismos moleculares y el impacto de la autofagia en el cáncer no se entiende completamente. Aquí, se encontró que Sox2, un factor de transcripción clave en la regulación de la "stemness" de las células madre embrionarias y células madre pluripotentes inducida, fuertemente inducidos fenómenos autofágicas, incluyendo la formación de vacuolas intracelular y la activación lisosomal en las células de cáncer de colon. La activación se produjo a través
ATG10
la expresión génica mediada por Sox2 y resultó en la inhibición de la proliferación celular y el crecimiento de colonias independiente del anclaje
ex vivo
y el crecimiento tumoral
in vivo.
Además, se encontró que Sox2-inducida por la autofagia reforzada por la senescencia celular hasta la regulación de los supresores de tumores o factores de senescencia, incluyendo p16
INK4a, p21 y p53 fosforilada (Ser15). En particular, desmontables de
ATG10 Hoteles en
Sox2
células de cáncer de colon que expresan restaurados propiedades celulares de cáncer. Tomados en conjunto, nuestros resultados demuestran que la regulación de la autofagia mediada por Sox2 es una estrategia novedoso mecanismo impulsado para tratar cánceres de colon humano
Visto:. Cho YY, Kim DJ, Lee SA, Jeong CH, Cho EJ, Kim MO, et al. (2013) La autofagia y la senescencia celular mediada por Sox2 reprimir malignidad de las células cancerosas. PLoS ONE 8 (2): e57172. doi: 10.1371 /journal.pone.0057172
Editor: Qiang Wang, el Cedars-Sinai Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 2 Octubre, 2012; Aceptado 18 de enero de 2013; Publicado: 25 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Cho et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación las Hormel y los Institutos nacionales de Salud subvenciones CA111536, CA120388, CA077646, R37CA081064 y ES016548, y por el Fondo de Investigación, M-2011-B0002-00025 de la Universidad Católica de Corea. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Las células cancerosas, pero no las células normales, adquieren la inmortalización escapando senescencia celular [1]. En comparación con las células normales, las células cancerosas por lo general requieren más nutrición para producir proteínas y enzimas para su proliferación más rápida, lo que resulta en dependencia nutricional de las células del cáncer [2]. La supervivencia es apoyado por los nutrientes obtenidos a través del suministro de sangre y por digestión auto de los orgánulos intracelulares en un proceso conocido como autofagia [3].
La autofagia es un proceso catabólico conservada en eucariotas que degrada las proteínas de larga vida, orgánulos , y el citoplasma mayor [4] a través del sistema lisosomal para mantener la homeostasis durante la inanición y el control del crecimiento normal [3]. La autofagia promueve la supervivencia celular mediante la purga de las células de orgánulos dañados, metabolitos tóxicos y patógenos intracelulares y mediante la generación de los bloques de construcción intracelulares necesarios para mantener las funciones vitales durante las condiciones de nutrientes limitados [5]. Sin embargo, la autofagia también podría comprender una estrategia importante para tratar el cáncer debido a la autofagia también puede promover la muerte celular a través de la excesiva auto-digestión y la degradación de los constituyentes celulares esenciales [5]. La autofagia es diferente de la apoptosis, un proceso que carece de autofagosomas y autolisosomas en las células que mueren [6]. En particular, el bloqueo de la autofagia al noquear beclin induce tumor desarrollo [7] y la inducción de la autofagia mediante tratamiento con compuestos naturales, tales como resveratrol, suprime la proliferación de células cancerosas y los tumores malignos [2]. La autofagia se informa, estrechamente relacionada con la senescencia celular y la inhibición de la autofagia retrasos senescencia celular en las células diploides humanas mitóticas [8]. Estas observaciones indican que la autofagia podría inducir senescencia en células de cáncer debido a la inhibición de la autofagia mejora las propiedades tumorigénicas de células MCF-7 [9]. Sin embargo, los mecanismos detallados no han sido claramente dilucidado.
Además, el tamoxifeno, un antagonista del receptor de estrógeno en el tejido mamario, induce la autofagia en las células MCF-7 de cáncer de mama humano [10] mediada por metabolitos esfingolípidos [11] . En particular, el trióxido de arsénico, imatinib (Gleevec) y rapamicina son compuestos conocidos por inducir la muerte celular autofágica en muchas líneas celulares de cáncer humano [12], [13], [14]. Es importante destacar que, los cánceres de ovario, mama y de próstata están asociados con la pérdida de monoallelic beclin1 en los seres humanos. Por otra parte, la inducción de la autofagia por beclin sobreexpresión suprime el crecimiento independiente de anclaje colonia de células MCF-7 [15] y la proliferación mediante la inhibición negativo de p70S6 quinasa [16], [17].
Tanto clásica y modernizado reprogramación celular son procesos estresantes que activan la apoptosis y senescencia celular, que son los dos principales barreras para el desarrollo del cáncer y la reprogramación somática [18]. Las acciones de señalización mTOR en la vía de la reprogramación de células somáticas, la senescencia celular y la formación de la autofagia [18]. Por ejemplo, bien caracterizado inhibidores de mTOR y activadores de la autofagia, incluidos PP242, la rapamicina y el resveratrol, en particular, mejorar la velocidad y eficiencia de la generación de células iPS [19]. Sox2, un factor de transcripción que pertenece a la superfamilia de HMG (High Mobility Group), tiene un papel en la determinación del destino celular, la diferenciación y la proliferación [20]. También es un regulador clave de la madre embrionarias (ES) de células auto-renovación y reprogramación de células terminalmente diferenciadas a células iPS [21]. Aunque el potencial oncogénico de los factores de células madre, tales como Sox2, se ha planteado la hipótesis de que se basa en la similitud "stemness" entre las células madre y las células cancerosas, la función de Sox2 en células de cáncer no se entiende claramente. Por otra parte, estudios recientes han demostrado que el nivel de proteína Sox2 corresponde fuertemente con menos diferenciados carcinomas de mama similares a células basales [22], y la proteína Sox2 se encuentra con frecuencia a ser reguladas en los carcinomas gástricos [23]. Este tipo de estudios han causado más controversia con respecto a la función normal y potencial oncogénico de los factores de células madre. Aquí, proporcionamos evidencia que muestra que la expresión de Sox2 en células de cáncer induce la autofagia de las células cancerosas por hasta la regulación de
ATG10
la expresión génica y la inducción de la senescencia celular, lo que resulta en la reducción de la malignidad de las células cancerosas y la inhibición del crecimiento tumoral
ex vivo
y
in vivo
.
resultados
Expresión ectópica de
Sox2
induce la autofagia
Los estudios recientes indican que la expresión ectópica de
Sox2
por infección retroviral en células MCF-7 de cáncer de mama aumenta tanto el tamaño y el número de colonias formadas en agar blando [24]. Sin embargo, Sox2 es con frecuencia el regulado en cánceres gástricos e inhibe el crecimiento celular a través de la detención del ciclo celular y la apoptosis [23]. Por lo tanto, el papel de Sox2 en el cáncer es controversial. Para explorar el papel de Sox2 y otros factores iPS en el cáncer, expresamos ectópica estos factores en las células de cáncer colorrectal humano HCT116 y encontramos que Sox2, pero no Nanog, Lin28 o Oct4, formación de vacuolas grave inducida en el citoplasma, que es un marcador importante de macroautofagia [25] (Fig. 1A). Se encontró que más del 90% de las células infectadas forman vacuolas de tamaño diferentes en su citoplasma y transferencia y de ensayo inmunocitofluorescencia resultados Western indicó que todas las células expresaron la proteína Sox2 ectópico (Fig. 1B). Además, se confirmó que la formación de vacuolas grave coincidió con la activación ácida lisosomal en las células de cáncer de colon HCT116 (Fig. 1C). Es importante destacar que, Sox2 sobreexpresión inducida LC3 (también conocido como ATG8b) la formación de focos, que es un biomarcador clave de la autofagia (Fig. 1D). Estos resultados indicaron que la sobreexpresión Sox2 autofagia inducida.
(
A
) Comparación de los cambios morfológicos inducidos por la expresión ectópica de factores iPS.
(paneles superiores): perfil del HCT116 células fueron transducidas de forma individual con factores iPS, incluyendo Sox2, Nanog, Oct4 y Lin28. Las células se cultivaron durante 5 días y se observaron cambios en el microscopio de luz (X200).
(paneles inferiores): perfil se recogieron las células HCT116 a los 5 días después de la transducción con iPS factores y proteínas extraídas. Los niveles de proteína de la Sox2, Nanog, Lin28 y Oct4 se analizaron por transferencia Western con anticuerpos específicos tal como se indica. SS-actina se utilizó como un control interno para verificar la carga igual de proteínas. (
B Opiniones) HCT116 células que forman vacuolas en 5 días después de la transducción se observaron bajo microscopio de luz, contó y comparó. la sobreexpresión Sox2 se analizó por transferencia Western y ensayo de inmunocitofluorescencia (X200) utilizando anticuerpos específicos tal como se indica. SS-actina se utilizó como un control interno para verificar la carga igual de proteínas. Las células se visualizaron por microscopía de luz (L.M .; X200). (
C
) análisis por activación lisosomal. HCT116 células infectadas con el
simulacro
o
Sox2
se tiñeron mediante la adición de LysoTracker (50 nM) al medio de cultivo durante 5 min en un 37
o C, 5% de CO
2 incubadora. Las células fueron fijadas con 4% de formalina, se lavaron con PBS y se observó la activación lisosomal bajo un microscopio de fluorescencia (X200). (
D
) ensayo de inmunofluorescencia de LC3B (es decir, ATG8b). HCT116 células que expresan de forma estable
simulacro
o
Sox2
fueron sometidos a un ensayo de fluorescencia para detectar LC3B. Se observaron las células bajo un microscopio de fluorescencia (X200). Los núcleos se tiñeron con DAPI; LM indica microscopía de luz (X200).
Sox2 induce la autofagia en las células cancerosas, pero no en las células normales
Para investigar si Sox2 sobreexpresión puede inducir la formación de vacuolas en diferentes líneas celulares de cáncer de colon , transduced partículas virales lenti-Sox2 en las células normales del colon CCD-18Co y HCT116, HT29 y WiDr células de cáncer de colon humano. Se encontró que todas las líneas celulares de cáncer de colon vacuolas formadas en su citoplasma (Fig. 2A, las flechas). Sin embargo, aunque las células normales del colon CCD8-18Co mostraron una buena expresión de Sox2 después de la transducción con Lenti-Sox2, las células no forman vacuolas o muestran cambios morfológicos (2A Fig. B). Además, los resultados adicionales confirmaron que la formación de vacuolas y la activación lisosomal ácida se observaron en células de cáncer de colon HCT116, pero no en células de colon normales CCD-18Co (Fig. 2C). Además, la expresión ectópica de Sox2 en fibroblastos de ratón normal embrionarias (MEFs) o fibroblastos primarios humanos (NFDH y BJ) no causó la formación de vacuolas (datos no presentados), lo que demuestra que la formación de vacuolas inducida por Sox2 sobreexpresión en células HCT116 es de hecho de células de cáncer autofagia específico de.
(
Un
) CCD-18Co (CRL-1459) las células normales del colon y HCT116, las células de cáncer de colon HT29 y WiDr se cultivaron en el medio apropiado y transducidas con
Sox2
partículas virales. Las células se cultivaron con medio de crecimiento completo durante 5 días después de la transducción. Se observaron las células bajo un microscopio de luz. vacuolas celulares están marcados con una punta de flecha en el
Sox2
que expresan las células de cáncer de colon. (
B Opiniones) las células normales del colon CCD-18Co se cultivaron, transducidas con
simulacro
o
Sox2
partículas virales y se cultivaron con medio de crecimiento completo durante 5 días. Después las células se fijaron, permeabilizaron y se hibridaron con un anticuerpo específico Sox2 y luego con un anticuerpo secundario Alexa 568-conjugado, y se visualizaron con un microscopio de fluorescencia (X200). Los núcleos se tiñeron con DAPI. Las áreas de microscopía de luz son las áreas coincidentes con Sox2 y DAPI fluorescencia. El área de caja con baja potencia se magnifica para comparar la morfología entre HCT116-
simulacro
y -
Sox2
células que expresan. (
C
) la activación lisosomal, un marcador de autofagia, se comparó mediante la adición de LysoTracker-Rojo (50 nM) a los 5 días después de la transducción de CCD-18Co células normales del colon y cáncer colorrectal HCT116 células infectadas con el
simulacro
o
Sox2
. Se observaron las células bajo un microscopio de fluorescencia. LM indica la misma zona de la microscopía de luz correspondiente a la microscopía de fluorescencia (X200).
Objetivos Sox2 ATG10 para inducir la autofagia
Para explorar el mecanismo (s) de la autofagia inducida por Sox2, se utilizó por primera vez un análisis de microarrays de un total de 30,968 genes de ADNc aisladas de células infectadas con el
simulacro
o
Sox2
para identificar genes (s) blanco de Sox2 para inducir la autofagia. Los resultados revelaron 11.245 genes que fueron analizados utilizando el programa de análisis de microarrays significativo (SAM) de (http://www-stat.stanford.edu/~tibs/SAM). Se encontró que 2.153 Sox2 inducida podrían clasificarse como hasta reguladas y 1.575 genes se redujeron reguladas en las células HCT116 (Fig. 3A y el cuadro S1). Se utilizó la base de datos para anotación, y Visualización Integrada y Descubrimiento (v6.7 DAVID; http: //niaid.abcc.ncifcrf.gove) para clasificar aún más los genes de acuerdo con sus funciones biológicas o moleculares y encontró que los niveles de expresión de genes asociados con la autofagia , la proliferación y la regulación del ciclo celular se alteraron sustancialmente por la expresión ectópica de
Sox2.
expresión génica alterada incluidos los cambios en los genes de reparación de ADN, 33 genes de replicación de ADN, 25 genes relacionados con el crecimiento de células 20, 26 celular relacionada con el tamaño 191 genes, los genes relacionados con la transcripción y la señalización de la insulina 17 genes relacionados con la vía (Fig. 3A y cuadros S1, S2 y S3). Es importante destacar que,
Sox2
expresión inducida aumento de la expresión de
ATG10, ATG3, ATG4a, ATG4D
y los genes
ATG8b fotos: por aproximadamente 2-4 veces (Fig. 3A). Por el contrario,
Sox2
expresión se asoció con una disminución de la expresión de la
ATG12, ATG16L2
y
ATG9B
genes (Fig. 3A). Mediante la búsqueda en una base de datos que contiene el motivo de unión de consenso-Sox2 en la región promotora en el genoma [26], se encontró que el
ATG10
y
ATG12
promotores contienen un motivo de consenso de unión a nucleótido putativo Sox2 que alberga 63% de identidad (Tabla S4). Comparando nuestra microarrays y los resultados de búsqueda de base de datos, concluimos que ATG10 podría ser un objetivo de Sox2 en la inducción de la autofagia. Nuestros dependiente del ciclo RT-PCR resultados demostraron que el
ATG10
nivel de ARNm de
Sox2-
células transfectadas se incrementó en alrededor de 2,5 veces en comparación con
simulacro gratis (Fig. 3B ). En particular, los resultados de transferencia Western (Fig. 3C) y inmunocitofluorescencia contra ATG10 (Fig. 3D) indicaron que los niveles de proteína ATG10 y LC3 se incrementaron por la sobreexpresión de Sox2. Para determinar si el
ATG10
promotor se activa por Sox2, se construyeron dos
plásmidos que contienen luciferasa
reportero -1.522 a -1 (SAL
pGL3-ATG10-1522
) y - 711 a -1 (
pGL3-ATG10-711
) (figura 3E.) mediante la búsqueda y el análisis de la
ATG10
regiones promotoras, que contienen putativo Sox y SRY motivos de unión a -1327 y - 1473 desde el sitio de iniciación de la transcripción (Fig. 3E). Se encontró que el que la supresión de la región de unión putativo Sox2 suprimió significativamente la actividad de luciferasa (Fig. 3F). En particular,
ATG10
actividad promotora se incrementó por la sobreexpresión de Sox2 (Fig. 3G), lo que indica que induce Sox2
AT10
la expresión génica y hace que la autofagia.
(
Un
) microarrays.
Panel superior
, células de cáncer colorrectal HCT116 que expresan establemente
simulacro
o
Sox2
fueron sometidos a análisis de microarrays como se describe en "Materiales y Métodos". El color amarillo indica el número de genes que no mostró una diferencia significativa entre los
simulacro
y
Sox2
expresión. Los colores rojo y verde indican el número de genes hacia arriba o hacia abajo-regulados, respectivamente, en las células HCT116 que expresan establemente
Sox2
en comparación con las células que expresan el
simulacro de control
.
Mesa Bottom Restaurant, resumen de los genes relacionados con la autofagia obtenidos a partir del análisis de microarrays. Arriba y abajo de la regulación se denotan en los valores Log2. (
B Opiniones) Expresión de
ATG10
inducida por Sox2. El ARN total (1 g) a partir de células HCT116 infectadas con el
simulacro
o
Sox2
fue transcrita inversa y
ATG10
fue amplificado por PCR y dependiente del ciclo del
ATG10
nivel de expresión se visualizó mediante electroforesis en gel de agarosa en el ciclo de 21
st. SS-actina se utilizó como un control interno para verificar la igualdad de utilización de ADNc para PCR. (
C
) Sobre regulación de ATG10 y LC3B los niveles de proteína inducidos por
Sox2
expresión. Las proteínas se extrajeron a partir de células HCT116 que expresan establemente
mock
o
Sox2
y las proteínas ATG10 y LC3B se visualizaron por transferencia Western utilizando anticuerpos específicos. SS-actina se utilizó como un control interno para verificar la carga igual de proteínas. (
D
) Confirmación del nivel de proteína Sox2 ATG10 inducida. células de cáncer colorrectal HCT116 fueron infectados con
simulacro
o
Sox2 Opiniones y cultivadas 5 días. Se fijaron las células, se hibridaron con un anticuerpo primario específico ATG10 y Alexa 488 anticuerpo secundario conjugado. Los niveles de proteína ATG10 se observaron por microscopía de fluorescencia. L. M. indica la misma zona de la microscopía de luz correspondiente a la microscopía de fluorescencia (X200). (
E
) La construcción de la
ATG10
promotor
luciferasa
plásmido reportero. Las secuencias de nucleótidos de la humana
ATG10
región promotora se descargaron de Ensemble (http://uswest.ensemble.org). El análisis supuesto promotor se realizó utilizando TFSEARCH (v1.3) (http://cbrc.jp/htbin/nph-tfsearch). El putativo de unión a secuencias de consenso SRY y SOx se indican en rojo y el sitio de unión de la polimerasa III es en caja. (
F
) El clon BAC (RP11-111B20) fue adquirido de Empire Genómica (Buffalo, Nueva York) y 1528 y 711 pb de la
ATG10
región promotora se amplificaron por PCR. El fragmento de PCR se recombina con los
Gráficos vectoriales pGL3 básico para construir pGL3-AT10-1582 y pGL3-ATG10-711
luciferasa
plásmidos informadores. El
pGL3-ATG10-luc
reportero plásmidos fueron confirmadas por secuenciación del ADN. El promotor
ATG10
luciferasa
plásmidos informadores,
pGL3-AT10-1582
y
pGL3-ATG10-71-
luc, se transfectaron transitoriamente en HCT116 células y la actividad de luciferasa de luciérnaga se analizó después de 24 h. La
phRL-SV40 renilla
plásmido informador de luciferasa fue co-transfectadas como control interno para verificar la igualdad de la transfección y la normalización de la actividad de luciferasa de luciérnaga (* p & lt; 0,001). (
G
) El
pGL3-ATG10-1528
plásmido indicador de luciferasa fue transitoriamente cotransfectadas con un
simulacro
o
Sox2
vector de expresión viral en HCT116 células y la actividad de luciferasa de luciérnaga se analizó después de 24 h. El
phRL-SV40 Renilla
plásmido indicador de luciferasa fue co-transfectadas como control interno para verificar la igualdad de transfección y la normalización de la actividad de la luciferasa de luciérnaga (* p & lt; 0,001).
Sox2- la autofagia inducida está mediada por la baja regulación de la vía de señalización Akt, pero no a través de la Clase III PI3-K Señalización
el ayuno o el agotamiento de los factores de crecimiento como la insulina induce la autofagia [27]. Nuestros resultados de microarrays demostraron que la expresión de genes asociados con la vía de señalización de la insulina fue suprimida (Tabla S3). Por lo tanto, se examinaron los cambios en los niveles de proteína asociada con la autofagia y la insulina de señalización por transferencia de Western. Se encontró que la Clase III PI3-K (Vps34p) y beclin no fueron cambiados, lo que indica que la PI3-K /beclin vía de señalización no está involucrado en la autofagia Sox2 inducida (Fig. 4A) de Clase III. Mediante la investigación de la vía de señalización PI3-K-Akt, se encontró que la fosforilación de Akt (Ser308) fue sustancialmente inhibida y los niveles de proteína total de Akt, mTOR y p70S6K disminuyeron en
Sox2
células infectadas en comparación con
simulacro
células infectadas (Fig. 4B). Para confirmar señalización relacionados con la inhibición de la vía de señalización PI3-K-Akt, analizamos GSK3α /ß y PTEN. Los resultados indicaron que la fosforilación de GSK3α /ß en Ser9 /Ser21 fue suprimido y los niveles de proteína /SS totales GSK3α se incrementaron ligeramente en
Sox2
células infectadas en comparación con
simulacros
infectados por células (Fig . 4C). En particular, se encontró que la fosforilación de PTEN también se incrementó (Fig. 4C), lo que resulta en la supresión de la señalización PI3-K por de-fosforilación [28]. Estos resultados indicaron que Sox2 altera la vía de señalización PI3-K-Akt a través GSK3α /ß y la señalización de PTEN, aunque la quinasa específica aguas arriba responsable de la fosforilación de PTEN no se conoce en este caso. Se han tratado las células HCT116 que expresan
Sox2
o
simulacro
con insulina o LY294002, un inhibidor de PI3-K. Los resultados indicaron que
Sox2
inducida por la formación de vacuolas fue marcadamente inhibida por el tratamiento con insulina (Fig. 4D
panel izquierdo
s, España E). Sin embargo, las células
mock
infectadas no muestran la formación de vacuolas, tratado o no con la insulina en condiciones normales de cultivo celular (10% FBS) o formación de vacuolas suprimida en condición inanición (0% de FBS) (Fig. 4D
paneles de la izquierda y medias, España e, F). También se encontró que
células con infección simulada mostraron una mayor formación de vacuolas después del tratamiento con LY294002, mientras que
Sox2 sobreexpresión
causó la formación de más vacuola inducida por el tratamiento LY294002 comparación con
simulacro gratis ( La Fig. 4D
panel de la derecha
s, España E, F). No se observaron fenómenos similares en condiciones de inanición (Fig. 4E, F). Tomados en conjunto, estos resultados indican que la baja regulación de la vía de la PI3-K-Akt por PTEN podría cooperar para inducir la autofagia asociado con la expresión de Sox2.
(
C-A
) Los niveles de proteína de la clase I moléculas de señalización incluyendo Akt, mTOR y p70S6K y clase III PI3-K moléculas de señalización que incluyen Vps34p y beclin fueron analizados en las células HCT116 que expresan establemente
simulacro
o
Sox2
. Las proteínas individuales se visualizaron por transferencia Western utilizando anticuerpos específicos. ß-actina se utilizó como un control interno para verificar la carga igual de proteínas. (
D
) Implicación de la señalización de la clase I PI3-K en la autofagia inducida por Sox2. (
D, paneles de la izquierda
) células HCT116 que expresan establemente
simulacro
o
Sox2
fueron tratados con insulina o LY294002 por debajo del 10% que contenía FBS condiciones a los 2 días después de la infección. formación de vacuolas se observó por microscopía de luz (X200). Las áreas enmarcadas se magnifican individual 2 veces más (
paneles inferiores para simuladas y Sox2
) para visualizar mejor las vacuolas.
(D, paneles de la derecha): perfil Las células fueron transducidas con
Sox2
partículas virales y cultivadas 2 días. El medio de cultivo celular fue reemplazado con 5a de McCoy sin suplementación FBS pero incluyendo 5 mg /ml de insulina o 5 g células LY294002 y luego se cultivaron durante 5 días. Se observaron las células bajo el microscopio de luz (X200). (
E
) La comparación cuantitativa de la formación de la autofagia inducida por la clase I de señalización PI3-K. La vacuola células de D y F de formación se contaron y se compara en un gráfico numerate (* p & lt; 0,001).
Sox2 inducida autofagia suprime la proliferación y el crecimiento de colonias independiente del anclaje mediante la inducción de senescencia celular en HCT116 las células
supresión de la actividad de PI3-K por PTEN tiene un papel importante en la proliferación celular y el desarrollo del cáncer en el colon [29], [30], [31]. inhibición de PI3-K por PTEN o wortmanina tiene un efecto inverso en comparación con el factor de necrosis tumoral α en el equilibrio entre las subunidades p50 y p65 del factor nuclear
k sobre B [31]. GM3, un gangliósido, el tratamiento aumenta dramáticamente la quinasa dependiente de ciclina (CDK) inhibidor (CKI) p21
WAF1 expresión a través de la acumulación de la proteína p53 por la inhibición PTEN mediada de la supervivencia PI3-K-Akt-MDM2 señalización en HCT116 células de cáncer de colon [29]. En el cáncer colorrectal humano, se ha observado una correlación negativa entre los niveles de proteína PTEN y la fosforilación de Akt [30]. Nuestros resultados indican que la baja regulación de la PI3-K-Akt señalización a través de PTEN podría estar involucrado en la autofagia inducida por Sox2 (Fig. 4). Nuestra proliferación celular y el ciclo celular análisis indicaron que
Sox2
infección en células HCT116 proliferación suprimidos mediante la inducción de la acumulación de células en G0 /G1 y sub-G1 y la reducción de las fases del ciclo celular en comparación con el S
mock
células infectadas (Fig. 5A). La atenuación de la proliferación celular se asocia con aproximadamente 90% de inhibición del crecimiento del cáncer independiente de anclaje en agar blando, un sello distintivo de las propiedades celulares de cáncer [32] (Fig. 5B). Para explorar la responsable de señalización para inducir la pérdida de las propiedades celulares de cáncer, tales como la supresión de la proliferación y el crecimiento en agar blando, se examinaron varios supresores tumorales con un papel conocido en la regulación del ciclo celular. Se observó un aumento en la fosforilación de p53 (Ser15) y aumenta en el total de los niveles de proteína de p16
INK4a y p21 (Fig. 5c), que son bien conocidos por estar fuertemente implicados en la senescencia celular [33]. A continuación, examinó la senescencia utilizando un ensayo SA-ß-galactosidasa y encontró que la expresión ectópica de
Sox2
mayor actividad ß-galactosidasa y el nivel de proteína (Fig. 5D,
la izquierda y centro) y paneles
suprimido Ki-67 nivel de proteína, un marcador de proliferación celular (Fig. 5D,
panel de la derecha
). Cabe destacar que más del 90% de las células que contienen vacuolas manchada ß-gal positiva (Fig. 5D,
gráfico
), Tomados en conjunto, estos resultados indican que la autofagia inducida por Sox2 provoca una pérdida de propiedades tumorales en células de cáncer colorrectal HCT116 .
(
Un
)
Panel izquierdo
, efecto de
Sox2
expresión en la proliferación celular. células HCT116 (2 × 10
3) que expresan establemente
mock
o
Sox2
se sembraron en placas de 96 pocillos y la proliferación se analizó por el ensayo de MTS en intervalos de 24 h hasta 96 h (*, p & lt; 0,001).
Oriente y paneles de la derecha
, efecto de
Sox2
expresión en la distribución del ciclo celular. Las células HCT116 (4 × 10
5) que expresan establemente
simulacro
o
Sox2
Se sembraron, culta y luego la distribución del ciclo celular (
panel del medio
) y sub la acumulación de G1 (
panel derecho
) se analizaron por FACS (*, p & lt; 0,001). (
B Opiniones) Efecto de
Sox2
expresión en el crecimiento de las colonias de anclaje independiente. Las células HCT116 (8 × 10
3) que expresan establemente
simulacro
o
Sox2
fueron sometidos a un ensayo de crecimiento de colonias en agar suave durante 5-7 días. Las colonias de células fue evaluado utilizando un programa Image-Pro Plus (v.6) el software informático (* p & lt; 0,001) y el microscopio. (
C
) perfilado proteína relacionada con la regulación del ciclo celular. Se extrajeron las proteínas de las células HCT116 que expresan establemente
simulacro
o
Sox2
y se sometieron a transferencia de Western para detectar el nivel de varias proteínas que se sabe están involucrados en la regulación del ciclo celular. SS-actina se utilizó como un control interno para verificar la carga igual de proteínas. (
D
) ensayo de la senescencia celular.
Panel izquierdo
, las células HCT116 que expresan establemente
simulacro
o
Sox2
se analizaron para determinar la senescencia usando un kit de tinción de la senescencia ß-galactosidasa. Se observaron las células bajo un microscopio de luz (X200).
Medio y
paneles de la derecha
, el nivel de proteína de la ß-galactosidasa o Ki-67 se detectó en las células HCT116 que expresan establemente
simulacro
o
Sox2
utilizando anticuerpos primarios específicos como se indica y un anticuerpo secundario conjugado con HRP. inmuno detección se realizó mediante el Sigma FASTTM 3,3'-diaminobencidina Terahyfrochloride con conjuntos de metal reforzador Tablet (sustrato de peroxidasa DAB). Los niveles de proteína se visualizaron utilizando un microscopio de luz (X200).
Gráfico
, indica una comparación de la población de células positivas ß-galactosidasa en las células HCT116 que expresan establemente
simulacro
o
Sox2 gratis (* p & lt; 0,001).
Desmontables de
ATG10
Restaura
Sox2
inducida por autofagia, senescencia celular y la proliferación celular
Nuestros resultados anteriores demostraron que
Sox2
mediada autofagia está mediada a través de
ATG10
expresión (Fig. 3). Para examinar si la caída de
autofagia ATG10
puede suprimir inducida por la sobreexpresión Sox2, seleccionamos un
PSH-ATG10-1755 Gráficos vectoriales desmontables (Fig. 6A). El
sh-ATG10
partículas virales fueron infectados en
Sox2
células -preinfected y expresión de Sox2 (Fig. 6B,
paneles superiores) y
desmontables de
ATG10 gratis (Fig. 6B,
paneles inferiores
) se confirmaron mediante un ensayo de inmunofluorescencia. Muy importante, las morfologías celulares de autofagia inducida por Sox2, incluyendo aplanamiento celular, tamaño nuclear y formación de vacuolas, se transforman íntegramente a los observados en
mock
infectados con células HCT116 (Fig. 6B, L. M.). Por otra parte, se confirmó que la recuperación morfológica se correspondía con la restauración de Ki-67, ß-galactosidasa, p16
niveles INK4a y la proteína p21 en el
simulacro
infectados con células HCT116 (Fig. 6C). En particular, se confirmó que desmontables de
ATG10 Hoteles en HCT116 que expresan establemente Sox2 recuperó la proliferación celular, que fue inhibida por la sobreexpresión Sox2, y el crecimiento fue incluso más rápido que el de las células HCT116 que expresan establemente
simulacro
control (Fig. 6D). Estos resultados indicaron que ATG10 juega un papel importante en la formación de la autofagia inducida por la expresión de Sox2 en células de cáncer colorrectal HCT116.
(
A
) Confirmación de la eficacia desmontables de ATG10. Desmontables de ATG10 utilizando
pLKO-shATG10
. El
pLKO-shATG10
partículas virales Lenti-desmontables fueron infectados en células HCT116 que expresan establemente
Sox2 Opiniones y células cultivadas durante 36 h. Las proteínas se extrajeron y eficiencia desmontables se determinó por Western blot utilizando un anticuerpo específico ATG10. SS-actina se utilizó como un control interno para verificar la carga igual de proteínas. (
B Opiniones) Los cambios morfológicos inducidos por
ATG10
caída en las células HCT116 que expresan de forma estable
Sox2
. HCT116-simulacro, se analizaron las células -Sox2 y -Sox2 /sh-ATG10 para los cambios morfológicos y los niveles de proteína de Sox2 (rojo) y ATG10 (verde) se determinaron mediante un ensayo de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos específicos. Se observaron las células bajo un microscopio de fluorescencia o la luz (X200). L. M. indica microscopía de luz. (
C
) Restauración de ciclo celular, la proliferación celular y marcadores de senescencia derribando
ATG10 Hoteles en células HCT116 que expresan establemente
Sox2
. HCT116-simulacro, las células -Sox2 y -Sox2 /sh-ATG10 se sembraron en un portaobjetos de 4 cámaras, fijo y permeabiliza. Marcadores de proliferación celular, la senescencia celular y la regulación del ciclo celular incluyen Ki-67, ß-galactosidasa, p16
INK4a y p21. Estos marcadores fueron analizados por inmunocitoquímica con anticuerpos específicos tal como se indica mediante el Sigma FASTTM 3,3'-diaminobencidina Terahyfrochloride con conjuntos de metal reforzador Tablet (sustrato de peroxidasa DAB). Se observaron las células bajo un microscopio de fluorescencia o la luz (X200). (
D
) Restauración de la proliferación derribando
ATG10 Hoteles en células HCT116 que expresan establemente
Sox2
.