Extracto
El cáncer de vejiga (BCA) es una enfermedad común en todo el mundo y tiene una alta probabilidad de recurrencia después del diagnóstico y el tratamiento inicial. Como resultado, la vigilancia recurrente, que afecta principalmente a cistoscopías repetidas, es un componente crítico de la gestión de los pacientes diagnóstico post. Desde cistoscopia es invasiva, costosa y un posible impedimento para el cumplimiento del paciente con exámenes regulares de seguimiento, las nuevas tecnologías no invasivas para ayudar en la detección de cáncer de vejiga primario recurrente y /o están fuertemente necesario. En este estudio, se empleó la metabolómica basada espectrometría de masas para identificar las firmas bioquímicos en orina humana que diferencian cáncer de vejiga de los controles no cancerosas. Se midieron más de 1000 compuestos diferentes incluyendo 587 compuestos nombrados de identidad química conocida. la identificación de biomarcadores inicial se llevó a cabo usando un conjunto de muestras 332 sujetos de muestras de orina retrospectivos (cohorte 1), que incluye 66 muestras CaV positivos. Se seleccionó un conjunto de 25 biomarcadores candidatos sobre la base de la significación estadística, diferencia pliegue y la cobertura vía metabólica. Las 25 biomarcadores candidatos se ensayaron frente a un conjunto de muestras de orina independiente (cohorte 2) utilizando el análisis de los bosques al azar, con esfingomielina palmitoil, lactato, succinato de adenosina y proporcionando la capacidad de predicción más fuerte para diferenciar el cáncer de la cohorte 2 de orinas no cancerosas. Cohorte 2 metabolito de perfiles reveló metabolitos adicionales, incluyendo ácido araquidónico, que eran más altas en el cáncer de la cohorte 2 frente a los controles sin cáncer, pero estaban por debajo de los límites de cuantificación en la elaboración de perfiles de cohortes 1. Los metabolitos relacionados con el metabolismo de los lípidos pueden ser biomarcadores especialmente interesantes. Los resultados sugieren que los metabolitos de la orina, pueden proporcionar un muy necesario no invasiva adyuvante de diagnóstico para la cistoscopia para la detección de cáncer de vejiga y la gestión de la enfermedad recurrente
Visto:. Wittmann BM, Stirdivant SM, Mitchell MW, Wulff JE, JE McDunn , Li Z, et al. (2014) del cáncer de vejiga descubrimiento de biomarcadores Uso Global de Metabolómica perfil de orina. PLoS ONE 9 (12): e115870. doi: 10.1371 /journal.pone.0115870
Editor: Mohammad O. Hoque, Johns Hopkins University, Estados Unidos de América
Recibido: 23 de mayo de 2014; Aceptado: 27 Noviembre 2014; Publicado: December 26, 2014
Derechos de Autor © 2014 Wittmann et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Los fondos para la recogida de muestras y anotación fue apoyado por becas NIH 1R01-CA151489-01 (Bogdan Czerniak PI), y los NIH /CNRR 5 UL1 RR24982 -02 (YL co-investigador). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Metabolon adquirió muestras sobre el precio de base por ejemplo
Conflicto de intereses:. Los autores han leído la política de la revista y tienen los siguientes conflictos: BMW, SMS, MWM, JEM, ZL, BPN, y MVM RLW son empleados de Metabolon Cª.; YL colabora en estudios de investigación con Abbott, Cepheid y Edge Pacífico, pero no como un consultor o representante. Estos intereses en competencia no alteran la adherencia de los autores a todas las políticas de diario sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
En los EE.UU., el cáncer de vejiga es el 4
ª tipo de cáncer más común en los hombres y el
ª tipo de cáncer más común en las mujeres 11 [1]. En los EE.UU. para el año 2012, se estimó que 73.000 nuevos casos serían diagnosticados y 15.000 personas podrían morir de la enfermedad [1]. Los pacientes con cáncer de vejiga con mayor frecuencia se presentan con hematuria [2]. El diagnóstico de cáncer de vejiga, en aquellos pacientes que se presentan con hematuria, implica principalmente cistoscopia junto con imágenes, la citología y la biopsia [3]. Cistoscopia y citología son los estándares actuales para el diagnóstico y la recidiva inicial, pero existen limitaciones. La cistoscopia puede fallar para visualizar ciertas áreas dentro de la vejiga y también puede que no detecte todos los cánceres, particularmente algunos casos de carcinoma in situ [4]. La citología tiene una alta especificidad y selectividad para tumores de alto grado, pero no consigue proporcionar un fuerte valor predictivo para los tumores de bajo grado [5]. Las opciones de tratamiento se basan en la puesta en escena y si hay invasión del tejido muscular. La mayoría de los cánceres de vejiga (75%) son los carcinomas uroteliales clasificados como no musculares cánceres de vejiga invasivo (CVNMI). En CVNMI, aproximadamente el 70% de los pacientes se presentan con ATP etapa, con un 20% y un 10% pT1 con carcinoma in situ (CIS) [6]. La tasa de recurrencia para CVNMI después de la resección del tumor es alta, con estimaciones que van de 35 a 80% [6], [7]. Debido al riesgo de recurrencia o progresión del tumor, las directrices establecidas recomiendan que los pacientes CVNMI ser monitorizados después del diagnóstico y el tratamiento inicial [8], [9]. Se recomienda un programa regular de cistoscopia para la vigilancia a una frecuencia de cada 3-6 meses durante 3 años y anualmente allí después de [10], [11]. Como resultado, el cáncer de vejiga se puede ver como una enfermedad crónica con seguimiento de toda la vida requerida. La vigilancia a largo plazo basándose en la cistoscopia, además de ser invasivo, tiene el potencial de reacciones adversas y puede implicar gastos considerables a largo plazo [12], [13]. Además, la aversión al paciente a la cistoscopia, podría disminuir la conformidad del paciente con las recomendaciones de vigilancia regulares [14]. Hay una fuerte necesidad clínica de una manera no invasiva, alternativa económica a la cistoscopia que ayudará en la detección de cánceres primarios, controlar la recidiva y ayudar a estratificar los pacientes como al riesgo de recidiva y progresión. Los recientes avances en la metabolómica han abierto la posibilidad de utilizar los metabolitos de orina como biomarcadores para el cáncer [15] - [18]. Un número de estudios han comparado las diferencias de metabolitos en los tumores de vejiga en relación con el tejido benigno y han identificado biomarcadores de cáncer de candidatos [19] - [23]. Un estudio también examinó las diferencias en los metabolitos de orina entre los pacientes que presentan cáncer de vejiga en relación con el cáncer de controles libres [19]. Estudios anteriores eran a menudo limitados en el número de metabolitos detectados con nombre y un metabolito de perfiles más amplio puede aportar nuevos biomarcadores candidatos y algoritmos predictivos. Presentamos aquí la elaboración de perfiles metabolómicos de orina de dos cohortes de pacientes con cáncer de vejiga y sus respectivos controles sin cáncer. Los datos sugieren múltiples biomarcadores de cáncer de vejiga candidato que puede ofrecer valor pronóstico en la identificación de muestras de orina positivas de cáncer.
Materiales y Métodos
Selección de pacientes
retrospectivo (cohorte 1) y prospectivo ( cohortes conjuntos de la muestra 2) de orina se obtuvieron a partir de un repositorio de orina aprobado por el IRB (IRB#CR00008160 /STU032011-187) de la Universidad de Texas Southwestern Medical Center (UTSW). Todos los sujetos fueron consintieron con los consentimientos escritos. Cohorte 1 de vejiga orinas positivas de cáncer eran de sujetos con cáncer primario o recurrente. muestras de orina espontánea se obtuvieron antes de la cistoscopia para los sujetos positivos de cáncer de vejiga cohorte 1, junto con historia de cáncer y hematuria controles. Cistoscopías se llevaron a cabo como parte de la vigilancia en curso o para la detección del cáncer y los resultados se utilizan para diagnosticar el estado actual del cáncer, ya sea presentes o ausentes. Cohorte 2 muestras de orina se obtuvieron de sujetos que presentan hematuria o de sujetos con una historia de la vigilancia de someterse a la enfermedad. orinas positivas de cáncer de vejiga en la cohorte 2 se obtuvieron de sujetos que presentan la enfermedad, ya sea primaria o recurrente. Metadatos respecto a la edad, el género, la raza, y la etapa del cáncer y el grado estaba disponible para ambas cohortes.
Metabolómica de perfiles
El espectrómetro de masas plataformas, la extracción y preparación de muestras, la configuración y las condiciones del instrumento, y los datos manejo se han descrito anteriormente en detalle [24]. En pocas palabras, los principales componentes del proceso se pueden resumir como sigue. La osmolalidad de cada muestra de orina se determina antes del procesamiento. Se añadió un cóctel de estándares de recuperación de las muestras de orina y alícuotas de 100 uL fueron extraídos en 500 uL de metanol. El extracto resultante se divide en tres fracciones de perfiles metabólicos y no directo al azar para el análisis. Cada muestra se secó bajo vacío para eliminar el disolvente orgánico. Las muestras se caracterizaron utilizando tres plataformas independientes: cromatografía líquida de ultra alto rendimiento /espectrometría de masas (UHPLC-MS /MS) en el modo de iones negativos, UHPLC-MS /MS en el modo de iones positivos y gases-espectrometría de cromatografía de masas (GC-MS ) después de sialilación. La reproducibilidad del protocolo de extracción se evaluó mediante la recuperación de los compuestos xenobióticos púas en cada muestra de orina antes de la extracción. Cohorte 1 orinas fueron analizados utilizando una plataforma consistente en un ACQUITY UHPLC (Waters Corporation, Milford, MA, EE.UU.) y un espectrómetro de masas Thermo Finnigan LTQ-(Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA. EE.UU.), mientras que la cohorte 2 era analizó usando una plataforma que consiste en un ACQUITY UHPLC y /espectrómetro de masas de masa exacta ThermoFisher Scientific Orbitrap Elite alta resolución (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA. EE.UU.). Los compuestos se identificaron por comparación con las entradas de biblioteca de estándares purificadas o entidades desconocidas recurrentes. La identificación de entidades químicas conocidas se basa en la comparación de las entradas de biblioteca metabolómicos de normas purificados basados en las propiedades cromatográficas y espectros de masas. Al escribir estas líneas, más de 4000 compuestos purificados estándar disponibles en el mercado habían sido adquiridos y registrados en el LIMS para su distribución a las plataformas tanto de la LC y GC para la determinación de sus características analíticas. Adicionales entidades (compuestos no identificados) fueron identificados en virtud de su carácter recurrente (tanto espectral de masas y cromatográficos). Estos compuestos tienen el potencial de ser identificado por la futura adquisición de un nivel coincidente purificada o por análisis estructural clásica.
El análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos se realizaron en la versión 2.14.2 R [25] . Prueba de Wilcoxon se utilizó para determinar la significación estadística de las diferencias de medias de metabolitos entre los grupos de comparación. Para todos los análisis, los valores que faltan (si los hay) se imputaron con el mínimo observado para ese compuesto en particular (se añadieron valores imputados tras cuadra-normalización). Los análisis estadísticos se realizaron en los datos transformados logarítmicamente naturales para reducir el efecto de los posibles valores atípicos en los datos. Además, los datos se normalizó a la muestra osmolalidad para compensar las diferencias en la concentración de la orina. azar forestal es una técnica de clasificación supervisada sobre la base de un conjunto de árboles de decisión [26] y se realizó en R versión 2.14.2. La agrupación jerárquica de cáncer de vejiga y perfiles de abundancia de orina de control se realizó en ArrayStudio versión 5.0 utilizando la unión completa y de correlación de Pearson como la métrica de similitud (OmicSoft, Raleigh, Carolina del Norte). Los cálculos de las AUC y las curvas ROC se realizaron con el paquete Proc en I [27]. El algoritmo multi-bioquímica, que se utiliza para generar las AUC y las curvas ROC, fue entrenado y probado de datos que se reajustarán a fin de que las medianas de ambas la cohorte-1 y de cohortes-2 negativos fueron igual a 1. El cambio de escala permite realizar pruebas en un algoritmo escala apropiada para los coeficientes empotrados derivados del conjunto de entrenamiento.
resultados
poblaciones Asunto
perfiles metabólicos de orina se realizó en dos cohortes de sujetos. Cohorte 1 se utilizó como una identificación exploratoria /biomarcador conjunto para identificar productos bioquímicos cuyos niveles eran diferentes en las muestras de orina de orinas de cáncer de vejiga en relación con los niveles de controles de orina. Cohorte 2 se utilizó como un segundo descubrimiento establece y para poner a prueba el valor predictivo de biomarcadores candidatos seleccionados de entre el conjunto de datos de la cohorte 1, pero desde cohorte 2 muestras se analizaron en una plataforma de espectrometría de masas más sensibles, metabolitos que sólo se midieron en la cohorte 2 muestras eran también de interés. Cohorte 1 era un conjunto muestra de orina recogida retrospectiva de la Universidad de Texas Southwestern, mientras que la cohorte 2 muestras se recogieron de forma prospectiva en la misma institución. Un resumen de los datos demográficos del paciente para las dos cohortes se presenta en la Tabla 1. cohorte 1 que comprende 66 muestras de orina de pacientes con diagnóstico de BCa y 266 controles no-BCA. Orinas en la cohorte 1 se obtuvieron de los sujetos con enfermedad primaria o recurrente. Algunas diferencias en las composiciones globales de género y raza estaban presentes en la cohorte 1. Los controles no-BCA en la cohorte 1 se puede subdividir en tres poblaciones: 1) sujetos que presentan hematuria; 2) los sujetos con antecedentes de BCa, pero no la enfermedad actual y 3) los sujetos normales sin antecedentes de BCa. Cohorte 2 se compone de 29 muestras de orina de pacientes con diagnóstico de BCa y 79 controles no-BCA. Al igual que en la cohorte 1, hubo algunas diferencias de género y el equilibrio racial entre la BCa y controles no-BCA. Cohorte 2 orinas se obtuvieron de sujetos, ya sea con la enfermedad primaria o recurrente en una proporción idéntica a la de la cohorte 1 (59% recurrente: 41% primaria). También fue notable la diferencia de cohorte en el porcentaje de tumores de alto grado vs. BCa de bajo grado, con la cohorte 1 que tiene un porcentaje mucho mayor de BCa alto grado (79%) de la cohorte 2 (59%).
perfiles y análisis de Metabolómica
las muestras de orina fueron extraídos y perfiles metabólicos se realizó a través positivo (+) y negativo (-) LC-MS /MS y GC-MS, para obtener una amplia cobertura de los productos bioquímicos presente. MS picos se identificaron utilizando el software de integración /identificación de los picos de propiedad de Metabolon, mediante la comparación de los datos de pico de MS a la de una biblioteca de estándares purificadas o entidades desconocidas recurrentes. Tras la imputación de los valores mínimos observados, ingrese procedimientos de transformación y de normalización, se realizó un análisis estadístico para identificar diferencias estadísticamente significativas en los niveles de metabolitos entre los grupos de comparación. Perfilado de la cohorte 1 mide 499 con nombre y sin nombre 624 productos bioquímicos, mientras que el perfil de la cohorte 2 mide 587 con nombre y sin nombre 541 productos bioquímicos. Las listas de todos los metabolitos medidos nombrados en las dos cohortes se muestran en S1 & amp; Tablas S2. El aumento del número de compuestos nombrados medidos en la cohorte 2, en relación con la cohorte 1, en parte, refleja la mayor sensibilidad del instrumento MS masa exacta utilizada para la Cohorte 2 y una expansión de la biblioteca bioquímico en el período de tiempo entre perfiles de las cohortes 1 y 2 . se utilizó una muestra de prueba de Wilcoxon de dos a identificar diferencias estadísticamente significativas en los niveles de metabolitos en la cohorte 1 BCa orinas en relación con el control de la orina. Se realizó un análisis estadístico comparando orinas BCa a todos los grupos de control combinados; o la comparación de BCa a cada uno de los subgrupos de control. El número de diferencias estadísticamente significativas en los niveles de compuestos nombrados varió de 178 a la 233 a través de las diferentes comparaciones (Tabla 2). En general, el número de productos bioquímicos estadísticamente significativas no varió en gran medida cuando se comparan muestras BCa positivas para los diferentes grupos de control. Análisis de la cohorte 2 orinas CaV frente a los controles, usando una prueba de Wilcoxon, identificó 75 bioquímicos nombradas como se presentan diferencias estadísticamente significativas con 70 bioquímicos elevados y 5 bioquímicos más bajos en BCa orinas relación con el control orinas (Tabla 2). El menor número de diferencias estadísticamente significativas en la cohorte 2 con respecto a la cohorte 1 puede reflejar, en parte, los números de las muestras más bajos en la cohorte 2. El mayor porcentaje de tumores en etapas más altas en la cohorte 1 con respecto a la cohorte 2 puede tener también un impacto estadísticamente el número de observaron diferencias significativas.
identificación de biomarcadores candidatos
se empleó una estrategia para usar la cohorte 1 para identificar biomarcadores candidatos y para clasificar la cohorte más interesante 1 biomarcadores para la previsibilidad BCa utilizando la cohorte 2 muestras fijadas. Un diagrama de flujo de trabajo de la estrategia utilizada para la prueba de biomarcador y la confirmación se muestra en la Fig. 1. La agrupación jerárquica se realizó en el conjunto de datos de cohortes 1, utilizando todas las muestras (332) y todos los productos bioquímicos con nombre, con exclusión de las drogas exógenas (total = 442). Los resultados de la agrupación jerárquica se presentan en la Fig. 2, con cierto grado de agrupamiento muestra BCa observado. Los resultados de la agrupación sugiere que las diferencias de metabolitos entre el cáncer y sin cáncer existen grupos y que estas diferencias tienen una capacidad para diferenciar las muestras de orina
Abreviaturas:. HX, BCa negativa, pero con la historia de BCa; Hema, presentando negativo BCa con hematuria.
Asunto diagnóstico BCA (recolección de orina post) se indica en la barra inferior. La agrupación se realizó a través de la vinculación completa y de correlación de Pearson como la similitud métricas. Comparando
Selección de candidatos de biomarcadores de los datos de cohortes 1 juego
Se aplicó una prueba de Wilcoxon para la cohorte 1 de perfiles de datos orinas de pacientes con BCa actual a partir de muestras de orina tres grupos de control distintos: 1) sujetos que presentan hematuria; 2) los sujetos con antecedentes de BCa pero no la enfermedad actual o 3) sujetos normales sin antecedentes de BCa. Además, se aplicó una prueba de Wilcoxon la comparación de muestras de orina BCA un grupo de control que consiste en todas las muestras de orina no-BCA combinados. Un mapa de calor y las estadísticas para todos los metabolitos medidos para las diferentes comparaciones 4 están contenidos en la Tabla S1. En conjunto, se identificaron 290 diferencias estadísticamente significativas en los niveles de metabolitos nombrados entre analiza el 3 por separado BCa /comparador, con 135 metabolitos que muestran diferencias estadísticamente significativas entre los tres BCa a comparaciones negativas de control (hematuria, la historia, normales; S1 Tabla). Para reducir el número total de diferencias de metabolitos hacia abajo para un conjunto más manejable de "mejores candidatos de biomarcadores", se aplicaron varios criterios de filtrado. Filtros incluyen: 1) metabolitos con BCa para controlar los niveles que fueron estadísticamente significativa en al menos 3 de 4 BCa para controlar las comparaciones de grupo; 2) las diferencias de metabolitos que exhiben el más bajo valor de p (p = 0.05 todos); 3) mayores diferencias de plegado entre BCa y controles; 4) medida en & gt; 50% de las muestras de orina; 5) fenotipo asociación del cáncer; 6) la cobertura de múltiples vías metabólicas; 7) sólo compuestos nombrados; 8) la exclusión de compuestos exógenos (por ejemplo, drogas) xenobióticos. La aplicación de estos criterios de selección hemos designado un panel de 25 biomarcadores candidatos para su posterior análisis. El conjunto de 25 biomarcadores candidatos se muestra en el mapa de calor de la figura. 3, junto con el rendimiento estadístico en cada uno de 3 BCa posible controlar comparaciones de grupos. También se muestra en la Fig. 3 es un análisis de subconjunto cáncer de vejiga comparando solamente no músculo cánceres de vejiga invasivos para el grupo de control de la historia. En la comparación de todas las muestras BCA cada uno de los grupos de control, todos los productos bioquímicos con la excepción de los aminoácidos de cadena ramificada (BCAA) leucina, isoleucina y valina muestran significación estadística p = 0.05 en todas las comparaciones de grupo 3 de control. 3-hidroxibutirato y gluconato fueron los más elevados en las orinas BCa, mientras que la pata de ganso y 3-hidroxifenilacetato y pyridoxate fueron más reducidas en BCa vs controles de orina. La mayoría de los candidatos de biomarcadores que alcanzaron significación estadística cuando todas las muestras CaV se compararon con los controles de historia también muestra diferencias estadísticamente significativas cuando sólo muestras NMBIC se compararon con los controles de historia. La diferenciación de los cánceres NMBIC es importante porque van a ser más frecuentes en los pacientes sometidos a vigilancia activa. Las 25 biomarcadores candidatos seleccionados a partir de los datos de cohortes 1 se utilizaron en un análisis de agrupamiento jerárquico de 1 muestras de cohortes. Se observó agrupamiento de muestras BCa y control, lo que indica que los niveles diferenciales de los 25 productos bioquímicos ofrecen algún grado de estratificación de la muestra de orina basado en el diagnóstico (Fig. 4).
Red rellenar las celdas indican metabolitos con niveles medios más altos en BCA orinas que en los controles no-BCA en importancia ap≤0.05. Las células verdes indican niveles más bajos en relación con el control BCa orinas en una significación p = 0.05. q-valores estadísticos y resultados de perfiles para todos los demás compuestos nombrados medidos en la cohorte 1 se presentan las muestras S1 Tabla posada.
diagnóstico BCa Asunto (recolección de orina post) se indica en la barra inferior. La agrupación se realizó a través de la vinculación completa y de correlación de Pearson como la similitud métricas.
biomarcadores cohorte 1 candidatos que mejor se diferencian cohorte 2 muestras
Un análisis al azar forestal se llevó a cabo utilizando la cohorte de 25 1 biomarcadores candidatos para estratificar el conjunto de muestras de cohortes 2 en sus grupos de cáncer y sin cáncer adecuadas. azar forestal es un método de conjunto sobre la base de los árboles de clasificación y el error fuera de la bolsa da una estimación de lo bien que podemos esperar para predecir el futuro de una muestra. El análisis al azar forestal proporciona una "importancia" rango de los productos bioquímicos. La importancia relativa de cada uno de los 25 metabolitos se muestra en la Fig. 5, con esfingomielina palmitoil los que tienen mayor poder discriminatorio (mayor disminución media valor de precisión). Las 6 principales metabolitos discriminatorias en el análisis al azar forestal constituidas 3 metabolitos que fueron mayores en las orinas BCa y 3 que eran más bajos en muestras BCa. Una comparación de los niveles relativos de estos 6 metabolitos en todas las muestras de orina de cáncer versus todos los controles no-cáncer en las dos cohortes se muestra en la Fig. 6. Las diferencias en los niveles relativos de cada uno de los 6 metabolitos fue estadísticamente significativa (p = 0.05) en ambas cohortes, con la excepción del succinato que alcanzó un valor de p de 0,053 en la comparación cohorte 2. Además, el subconjunto de muestras CVNMI BCA se comparó con todas las muestras de control y de 4 de los 6 metabolitos continuó para alcanzar significación estadística, a un nivel de p = 0.05, con fosfocolina y succinato siendo la excepción (Fig. 6). Fosfocolina y succinato fueron estadísticamente significativas a un nivel p≤0.1.
Los metabolitos son ordenadas por rango por su puntuación media disminuir la precisión. Un valor más alto significa disminuir la exactitud indica un mayor valor predictivo. Los 6 puntos de datos representan en caja de mejor desempeño metabolitos que se resumen en la Fig. 6.
Las comparaciones son para todas las muestras de orina positivas frente a BCA BCA combinar controles negativos. células rojas y verdes oscuros oscuros representan veces las diferencias con p = 0.05. células de color verde claro con el texto azul representa p≤0.1. BLQ: por debajo del límite de cuantificación; NA:. No aplicable
biomarcadores candidatos adicionales observados en la cohorte 2 muestras de orina
perfiles metabólicos de la cohorte 2 muestras de orina se realizó con una masa preciso- MS-plataforma más sensibles, los cuales es capaz de medir los metabolitos de orina presentes en concentraciones más bajas. Un mapa de calor que contiene todos los metabolitos medidos nombradas en la cohorte 2 muestras se presentan en la Tabla S2. Araquidonato, espermidina, espermina y la citosina, no se midieron en la cohorte 1 orinas, pero fueron elevados en la cohorte 2 orinas CaV en p = 0.05 (Fig. 6). Araquidonato también fue elevada en orinas tumorales CVNMI a un nivel estadísticamente significativo, cuando las muestras eran CVNMI segregada y se analizaron por separado de las orinas tumorales MIBC (Fig. 6). Espermina, espermidina y citosina eran elevados en las orinas CVNMI también, pero no a niveles estadísticamente significativos. Estos cuatro metabolitos también pueden ser consideradas como biomarcadores candidatos, pero la confirmación requerirían una cohorte independiente que también había sido perfilada en el instrumento de masa exacta.
rendimiento de los algoritmos de múltiples análisis utilizando un conjunto de biomarcadores 6
Como ejemplo de ensayo de biomarcador potencial de rendimiento en un algoritmo de múltiples análisis, esfingomielina palmitoil, lactato, gluconato, adenosina, 2-methylbutyrylglycine y guandinoacetate fueron elegidos para el entrenamiento algoritmo utilizando el conjunto de datos de cohorte-1. Estos biomarcadores candidatos fueron elegidos en base a sus diferencias de plegado y valores de p en ambas cohortes 1 y de cohortes-2. El algoritmo derivado de la formación en el conjunto de datos de cohorte-1 fue probado en el conjunto de datos de cohorte-2. AUCs y curvas ROC tanto para el análisis de la formación y el equipo de prueba se muestran en la Fig. 7. Se obtuvieron valores de AUC comparables para las dos cohortes, con AUC = 0,81 para la Cohorte-1 y 0,78 para la Cohorte-2. valores de especificidad se mantuvo alta, hasta un límite de sensibilidad de alrededor de 0,5, en ambas cohortes. El rendimiento observado usando este algoritmo no inferir valor predictivo futuro, ya que los biomarcadores utilizados en el algoritmo se pre-seleccionado en base a su capacidad de diferenciación del tumor en ambas cohortes. Este ejemplo ilustra que es posible derivar un algoritmo que segrega tumor de orinas de control en ambas cohortes específicas.
Un algoritmo, utilizando la biomarcadores candidatos palmitoil esfingomielina, lactato, gluconato, adenosina, 2-methylbutyrylglycine y guanidinoacetato fue entrenado usando el conjunto de datos de cohorte-1 y ponerlas a prueba en el conjunto de datos de cohorte-2. con curvas ROC AUC se muestran para el conjunto de entrenamiento (A) y el equipo de prueba (B).
Discusión
El cáncer de vejiga es una causa importante de morbilidad y mortalidad con una alta tasa de recurrencia y la necesidad de una vigilancia seguimiento frecuente. Actualmente, vigilancia de la recidiva requiere cistoscopia sobre una base semi-rutina, por lo general hasta un extenso periodo libre de enfermedad ha ocurrido. Una metodología de diagnóstico más fácil, menos invasiva sería ventajoso para el manejo del paciente y podría aumentar el seguimiento del cumplimiento de vigilancia. La medición de los metabolitos de orina puede proporcionar un método diagnóstico de acompañamiento que podría facilitar el control de la recurrencia del cáncer de vejiga y quizás también contribuyen al diagnóstico primario.
Los estudios recientes han demostrado metabolómicos valiosa para identificar biomarcadores del cáncer y en la obtención de conocimientos sobre el papel de reprogramación metabólica en el inicio y la progresión de neoplasias malignas. reprogramación metabólica en las células tumorales es un fenómeno común y ahora se reconoce como una característica emergente de cáncer [28]. Los cambios en los niveles de metabolitos resultantes de la reprogramación metabólica del tumor pueden ofrecer oportunidades únicas para el descubrimiento de biomarcadores. Por ejemplo, 2-hidroxiglutarato se incrementa en los gliomas, mieloma múltiple y cáncer de colon [29] y sarcosina elevada se asocia con cáncer de próstata y de colon [30], [31]. Los metabolitos asociados con células tumorales de reprogramación metabólica o tal vez de tumor-estroma interacciones podrían ser anticipadas para mostrar un cambio en los niveles no sólo en el propio tejido tumoral, sino también en matrices tales como sangre u orina que apoyan la captación o excreción de sustancias bioquímicas conectados al crecimiento del tumor o invasión. Varias investigaciones han informado sobre la utilidad de los biomarcadores metabolito de diagnosticar, estratificar y controlar a los pacientes con cáncer [31] - [34].
El presente estudio perfilado 430 muestras de orina de dos cohortes de sujetos, con positivo conocido o negativo BCA diagnósticos y, como tal, representa la proyección más completa para el cáncer de vejiga biomarcadores metabolito urinario hasta la fecha. Estudios previos han medido un número limitado de metabolitos en la orina (típicamente menos de 25). La plataforma no específica UPLC /espectrometría de masas basado tecnología empleada en este estudio facilita la identificación y la cuantificación relativa de & gt; 500 compuestos químicos, en muestras de orina, ampliando en gran medida el número de posibles candidatos de biomarcadores más de los descritos anteriormente. 25 metabolitos fueron seleccionados de la cohorte 1 para la evaluación en el conjunto de datos independientes cohorte 2. Los 25 productos bioquímicos identificados como biomarcadores candidatos cubrieron una amplia gama de rutas metabólicas. Mientras que el conjunto de biomarcadores 25 candidatos incluyera el aumento o disminución de metabolitos - elegidos para explorar mejores algoritmos de predicción de múltiples analitos - hipótesis de aumento de metabolitos en orina en BCa son más fácilmente generada que las hipótesis para la disminución de los niveles de metabolitos. El aumento de metabolitos podrían derivar de metabolitos tumorales secretadas en la orina o de la descomposición o la alteración de tejido no maligno causado por la invasión del tumor a través de la pared de epitelio. Las respuestas inflamatorias que resultan de la presencia de tumor también pueden causar un aumento de los niveles de metabolitos. La disminución de los metabolitos pueden ser causados una menor tasa de excreción de los metabolitos por las células tumorales en relación con el epitelio normal o por una absorción de metabolitos de la orina en el tumor o tejido adyacente. Los cambios en el metabolismo sistémico causadas por factores liberados por los tumores de vejiga o tejidos adyacentes remodelado y excreción urinaria posterior, también podrían causar cambios en los niveles de metabolitos en orina, tanto los aumentos y disminuciones. 25 metabolitos fueron seleccionados como candidatos de biomarcadores del conjunto de datos de cohortes 1 basada en múltiples criterios. El análisis de los bosques al azar pruebas de los 25 metabolitos en contra del conjunto de datos de la cohorte 2 ilustra que un subconjunto de los 25 se destacó como mejor desempeño. esfingomielina palmitoil, lactato, succinato adenosina y tenían el mayor valor predictivo, con otros metabolitos presentan una gama de valores reducidos. Una posible explicación para el desempeño más débil de muchos de los biomarcadores candidatos cohorte 1 podría ser que las muestras de orina positivas cohorte 1 del cáncer de vejiga se derivaron de un mayor porcentaje de sujetos con tumores de etapa superior /de alto grado que los presentes en los sujetos de la cohorte 2. Se también es posible que muchas de las cohortes 1 biomarcadores candidatos eran falsos positivos resultantes de las características únicas de esa población muestra particular
las 25 cohorte 1 biomarcadores candidatos representan un conjunto diverso de las rutas metabólicas -. en parte debido a la diversidad vía era un filtro para seleccionar el conjunto de 25 de & gt; 200 metabolitos con diferencias estadísticamente significativas al comparar la cohorte 1 CaV orinas positivas del grupo combinado de todos los controles negativos. Varias vías representadas por los metabolitos candidatos eran de particular interés. Una importante característica metabólica de cáncer es el cambio observado con frecuencia de la fosforilación oxidativa a una mayor dependencia de metabolismo de la glucosa a través de la glicólisis, incluso en condiciones aeróbicas (metabolismo Warburg) [35]. Aunque se cree que muchos mecanismos diferentes para contribuir a este cambio en la actividad metabólica, los resultados incluyen un aumento de la captación y el consumo de glucosa, aumento de la producción de lactato y la excreción, la producción de citrato elevada y aumento de la actividad de la vía pentosa fosfato (PPP). Upregulating estas vías proporciona energía, ácidos grasos, biosíntesis de nucleótidos, y la generación de NADPH [36], [37]. Los niveles de lactato fueron significativamente superiores en las muestras de orina de pacientes con cáncer de vejiga en las cohortes 1 y 2 y pueden ser un indicio de un aumento de la glucólisis en las células BCa. Además de lactato, β-hidroxipiruvato, que no ha sido previamente vinculado con el metabolismo del tumor, fue significativamente elevado en la orina de los sujetos con cáncer de vejiga primario. β-hidroxipiruvato se puede conectar a la glucólisis aunque su formación a través de la reacción de transaminasa serina-piruvato o su derivación de la glucólisis intermedio 3-fosfoglicerato [38].
tres metabolitos asociados con el metabolismo de lípidos, esfingomielina palmitoilo, y fosfocolina araquidonato (cohorte 2 solamente) se alteró significativamente en la orina de los sujetos BCA. Esto fue algo sorprendente, ya que;