Extracto
aldehído deshidrogenasa isoforma 1 (ALDH1) ha demostrado ser útil para la identificación de Las células madre del cáncer. Sin embargo, nuestro conocimiento de la expresión y actividad de ALDH1 en los cánceres epiteliales comunes y sus tejidos normales correspondientes sigue siendo en gran medida ausentes. Por lo tanto, hemos caracterizado la expresión ALDH1 en 24 tipos de tejidos normales y una gran colección de muestras de tumores epiteliales (seis tipos de cáncer, n = 792) por tinción inmunohistoquímica. Usando el ensayo de ALDEFUOR, también se examinó la actividad ALDH1 en 16 muestras de tumores primarios y 43 líneas celulares de cáncer epiteliales establecidos. Además, se analizaron un modelo de ratón transgénico de cáncer de ovario y de 7 líneas celulares de cáncer de ovario de murino. Se encontró que los niveles de expresión y patrones de ALDH1 en cánceres epiteliales son notablemente distinta, y se correlacionan con sus tejidos normales correspondientes. ALDH1 niveles de expresión de la proteína se correlacionan positivamente con la actividad enzimática ALDH1 medido por el ensayo de ALDEFLUOR. A largo plazo
cultivo in vitro
no afecta significativamente la actividad ALDH1 en las células tumorales epiteliales. De acuerdo con investigaciones en otros tipos de cáncer, se encontró que la expresión de alto ALDH1 se asocia significativamente con pobres resultados clínicos en pacientes con cáncer de ovario seroso (n = 439, p = 0,0036). Por último, ALDH
br células tumorales exhiben propiedades de células madre del cáncer y son resistentes a la quimioterapia. Como marcador de células madre novela cáncer, ALDH1 se puede utilizar para los tumores cuyos tejidos normales correspondientes expresar ALDH1 en niveles limitados relativamente restringidos o como el de mama, de pulmón, de ovario o cáncer de colon
Visto:. Deng S, Yang X , Lassus H, Liang S, S Kaur, ye Q, et al. (2010) Niveles de expresión distinto y patrones de marcador de células madre, la aldehído deshidrogenasa isoforma 1 (ALDH1), en los cánceres epiteliales humanas. PLoS ONE 5 (4): e10277. doi: 10.1371 /journal.pone.0010277
Editor: Yihai Cao, Karolinska Institutet, Suecia |
Recibido: 1 de diciembre de 2009; Aceptado: March 30, 2010; Publicado: 21 Abril 2010
Derechos de Autor © 2010 Deng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Alianza de cáncer de mama (LZ), el cáncer de ovario Investigación encontrado (Liz Tilberis Académico, LZ), la Fundación Caritativa Mary Kay Ash (LZ), Instituto Nacional del cáncer (R01CA142776 y SPORE cáncer de ovario P50-CA83638-7951 proyecto 3, LZ), y el Departamento de Defensa (W81XWH-10-1-0082, LZ). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la investigación ha proporcionado un fuerte apoyo a la hipótesis de las células madre del cáncer, que propone que una subpoblación relativamente raro de las células tumorales tienen la capacidad única para iniciar y perpetuar el crecimiento del tumor [1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10]. Estas células, llamadas células madre cancerosas o células iniciadoras de tumores, comparten varias características con las células madre embrionarias y somáticas, que incluso la auto-renovación y multi-potente diferenciación [11], [12], [13], [14], [15] , [16], [17]. Las células madre del cáncer pueden ser altamente resistente a la radiación o la quimioterapia [18], [19], [20], por lo tanto, el desarrollo de terapias más eficaces para el cáncer requiere la orientación eficaz de esta población celular [11] [12], [13, ], [14], [15], [16], [17]. Las células madre del cáncer pueden ser identificados y aislados utilizando marcadores específicos de células progenitoras normales o del mismo órgano [16] madre, [21]. Varios marcadores han demostrado ser útiles para el aislamiento de subconjuntos enriquecida para las células madre de cáncer epitelial, incluyendo CD44 /CD24 (HAS /PGP1) [3], CD133 (PROM1) [4], de unión a ATP B5 casete (ABCB5) [22], CD90 (thy1) [23], CD61 (integrina β3) [24], la actividad del proteasoma 26S [25], así como la exclusión Hoechst33342 [6], [26], [27].
aldehído deshidrogenasa ( ALDH) cataliza la oxidación irreversible de una amplia gama de aldehídos alifáticos y aromáticos a sus ácidos carboxílicos correspondientes [28]. se detecta actividad alta ALDH en las células madre y progenitoras de varios linajes, incluyendo hematopoyéticas [29], [30], [31], mesenquimales [32], neuronal [33], de mama [34], [35] y de próstata [36] . El ensayo ALDEFLUOR fue originalmente desarrollado para detectar la actividad de ALDH en tejidos hematopoyéticos; el producto de reacción ALDEFLUOR fluorescente se acumula en las células madre y se correlaciona con la actividad de ALDH [29]. ALDH convierte el sustrato ALDH, BAAA (BODIPY-aminoacetaldehído), en el BAA producto fluorescente (BODIPY-aminoacetato), que está retenido dentro de las células viables. Las células que expresan altos niveles de ALDH se vuelven fluorescentes brillantes (ALDH
br) y puede ser identificado y enumerado utilizando un citómetro de flujo estándar o aislado por clasificación de células para la purificación adicional y caracterización. ALDECOUNT® es un
in vitro
producto de diagnóstico aprobado por la FDA que se basa en el ensayo de ALDEFLUOR y se utiliza para la identificación y enumeración de células madre para aplicaciones clínicas. Más recientemente, el ensayo ALDEFLUOR se ha aplicado con éxito para detectar las células progenitoras y madre cancerosas en los tejidos no hematopoyéticos tales como las glándulas mamarias y de mama [34]. El reactivo ALDEFLUOR se sabe que actúa como sustrato para la ALDH1. Es importante destacar que, un anticuerpo específico ALDH1 se puede utilizar para detectar las células madre de cáncer en muestras clínicas incluidas en parafina [34]. Varios grupos independientes han informado de que la expresión ALDH1 puede ser utilizado como marcador pronóstico para los cánceres epiteliales [34], [37], [38], [39], [40], [41], [42], [43]. Por lo tanto, el ensayo ALDEFLUOR y inmunotinción ALDH1 pueden resultar útiles para la detección y el aislamiento de células madre de cáncer en los tumores epiteliales, facilitando así la introducción de los conceptos de células madre de cáncer en la práctica clínica [34]. Sin embargo, nuestro conocimiento de la expresión y actividad de ALDH1 en los cánceres epiteliales humanas y sus tejidos normales correspondientes, así como su importancia clínica, se encuentra todavía en su infancia. Para avanzar en el conocimiento de esta importante área, que caracteriza la expresión ALDH1 en 24 tipos de tejidos humanos normales, así como una gran colección de especímenes humanos epiteliales tumorales incluidas en parafina (seis tipos de cáncer, n = 792) por tinción inmunohistoquímica. Usando el ensayo ALDEFUOR, también se examinó la actividad ALDH1 en 16 muestras de tumores primarios y 43 líneas de células cancerosas epiteliales humanas establecidas. Además, un modelo de ratón transgénico de cáncer de ovario y de 7 líneas celulares de cáncer de ovario de murino fueron analizadas en nuestro estudio.
Materiales y Métodos
Tumor Fresh muestras
Los tejidos se obtuvieron después de consentimiento por escrito de los pacientes bajo un protocolo de recogida de tejido general aprobado por la institución del Consejo de Revisión Institucional (IRB) de la Universidad de Pennsylvania. Todas las muestras se recogieron en el momento de la cirugía de reducción de volumen de pacientes no tratados previamente con cáncer de ovario en etapa tardía. Los eritrocitos se lisaron con solución de cloruro de amonio. una sola célula suspensiones se prepararon usando un filtro de células de 40 micras. Las células muertas se eliminan usando perlas magnéticas (kit de eliminación de Dead Cell, Miltenyi Biotec) y un separador MidiMACS
microarrays de tejidos
Tejido cohorte red matriz:.
un humano normal FDA microarray de tejido de órganos se utilizó para caracterizar la expresión ALDH1 en los órganos normales. Esta gama plataforma tejido incluye 24 tipos de órganos humanos normales basados en las directrices de la FDA, y cada órgano se tomaron muestras de 3 individuos normales. Se utilizaron seis tipos de microarrays de tejidos tumorales epiteliales humanas para caracterizar la expresión ALDH1 en tumores epiteliales. Cada paciente fue representado con al menos dos biopsias de tejido de núcleo.
Helsinki cohorte:
Un microarray de tejido de cáncer de ovario se utilizó para examinar la importancia pronóstica de la ALDH1 en el cáncer de ovario. La matriz se incluyó a pacientes tratados de cáncer de ovario seroso primario en el Hospital Central Universitario de Helsinki.
Líneas celulares y cultivo celular
Un total de 50 líneas de células cancerosas establecidas se utilizaron en este estudio que incluyó a 15 humana de mama, de ovario humano 18, 7 de ovario de murino, y 10 de colon humano. Todas las líneas celulares de cáncer se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino (Invitrogen). Tres células humanas inmortalizadas independientes ováricos epiteliales superficiales (IOSes) fueron generosamente proporcionadas por el Dr. Auersperg, y se cultivaron en una combinación 01:01 de medio MCDB 199 y 105 medio (Sigma) suplementado con 15% de SFB. células epiteliales de la superficie del ovario de murino (Moisés) fueron aisladas y cultivadas como se informó anteriormente [44].
Los ratones transgénicos
El protocolo de estudio en animales fue revisado y aprobado por el cuidado de los animales y el uso comité institucional ( IACUC) de la Universidad de Pennsylvania. El ratón transgénico de cáncer de ovario MISRII-SV40 fue generada por el laboratorio del Dr Denise Connolly [45].
La inmunohistoquímica y análisis de imágenes
La inmunohistoquímica (IHC) se realizó utilizando el kit VECTASTAIN ABC como se describe por el fabricante (Vector). Los siguientes anticuerpos primarios se utilizaron en este estudio: ratón ALDH1 anti-humano (clon: 44 /ALDH, 1:250, BD Pharmingen) [34], [39], [46]; ratón anti-humano Ki67 (1:100, DAKO) y conejo anti-CD45 humano (1:200, Millipore). Los anticuerpos se incubaron durante la noche a 4 ° C. La inmunorreacción se visualizó con 3,3 'diaminobencidina. Doble tinción de inmunofluorescencia se realizó como se describe anteriormente [47].
se detectó ALDEFLUOR Ensayo
actividad ALDH usando el kit de ensayo de ALDEFLUOR (StemCell Technologies) como se describe por el fabricante. Brevemente, se disociaron las células individuales a partir de líneas celulares o muestras de tumor se suspendieron en tampón de ensayo que contiene un sustrato ALDEFLUOR ALDH, BODIPY-aminoacetaldehído (BAAA), a 1,5 M, y se incubaron durante 1 hora a 37 ° C. Un inhibidor específico de la ALDH, diethylaminobenzaldehyde (DEAB), en un exceso molar de 10 veces, se utilizó como control negativo. Citometría de flujo Se analizaron los datos por BD V6.1.3 software FACSDiva (BD Biosciences) o software FlowJo (TreeStar).
aislamiento de proteínas y Western blot
Las células cultivadas se lisaron en 200 l de tampón de lisis que contiene 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 150 mM, y 1% de Triton X-100. Las proteínas fueron separadas por 10% SDS-PAGE en condiciones desnaturalizantes y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se incubaron con un anticuerpo anti-ALDH1 primaria (1:300, BD Pharmingen), seguido de incubación en anti-ratón anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (1:5,000; Amersham Biosciences). Las proteínas inmunorreactivas se visualizaron utilizando ECL Western Blot sustrato (Thermo Scientific).
mammosphere Cultura y
culturas mammosphere se realizaron como se describe por Dontu
et al
[48]. Brevemente, las células individuales se sembraron en placas de fijación 24 pocillos ultra-baja (Corning) a una densidad de 20.000 células /ml viables y 5000 células /ml en pasajes posteriores. Las células fueron cultivadas en un medio de cultivo libre de suero mammosphere (MammoCult, StemCell Technologies) suplementado con MammoCult proliferación suplementos. Mammospheres se recogieron por centrifugación suave (800 rpm) después de 7-10 días y se disociaron mecánicamente y enzimáticamente (10 min en 0,05% de tripsina, 0,53 mM EDTA-4Na).
In vivo
ensayo de tumorigénico
el protocolo de estudio en animales fue revisado y aprobado por el comité de cuidado de los animales y el uso institucional (IACUC) de la Universidad de Pennsylvania. De seis a ocho semanas de edad ratones inmunodeficientes hembra se utilizaron en estos estudios. ALDH
baja y ALDH
br (ALDH
brillantes) las células se aislaron por FACS. Las células se suspendieron en solución salina tamponada con fosfato se mezcla con un volumen igual de Matrigel (BD Biosciences) a 10 mg /ml. Un volumen total de 0,3 ml, que contienen 500; por vía subcutánea 5.000 o 50.000 células, se inyectó (ovariectomizadas y ratones suplementados con estrógeno pellet).
ensayo MTT
ensayos de MTT se realizaron en placas de 96 pocillos usando el kit de proliferación celular (I) ( Roche) siguiendo las instrucciones del fabricante.
el análisis estadístico
el análisis estadístico se realizó mediante los paquetes de software estadístico SPSS y StatView.
resultados
Expresión y distribución de proteína ALDH1 en tejidos humanos normales
Como marcador de células madre, ALDH1 se ha utilizado para detectar las células madre de cáncer en múltiples tipos de tumores epiteliales humanos usando tinción inmunohistoquímica; sin embargo, su expresión y distribución de los patrones en los tejidos humanos normales son todavía en gran parte desconocida. Para hacer frente a esta importante cuestión, que caracteriza el patrón de expresión de ALDH1 en tejidos humanos normales por tinción inmunohistoquímica. Un microarray de tejido de órganos humanos normales aprobado por la FDA se utilizó en este estudio. A continuación, se incluyeron 24 tipos de órganos humanos normales sobre la base de directrices de la FDA, en los que cada órgano se tomó de 3 individuos humanos normales. Ratón anticuerpo ALDH1 anti-humano (clon: 44 /ALDH) [34], [39], [46] se utilizó para detectar la expresión ALDH1. Como se muestra en la Figura 1A, se detectó ALDH1 tinción positiva principalmente en el citoplasma, y se expresa ampliamente en el sistema digestivo (incluyendo el epitelio de esófago, estómago, intestino y colon, así como el hígado y el páncreas), el sistema endocrino (incluyendo la glándula suprarrenal, hipófisis, el tiroides y la glándula salival) y el sistema reproductor (ovario y testículo). No hubo células detectables ALDH1 positivos en el cerebro y el cerebelo (Figura 1A). En otros órganos, ALDH1 se distribuyó en ciertas áreas y en tipos de células específicos. Por ejemplo, en el bazo, las células ALDH1 positivas se encuentran principalmente en los leucocitos de las regiones pulpa roja, pero no en la pulpa blanca (Figura 1A). Es importante destacar que, en consonancia con otros informes [34], [46], [49], las células fuertemente ALDH1 positivos se encontraron en las áreas en las que las células madre /progenitoras epiteliales fueron supuestamente ubicados en la mama, colon y estómago (Figura 1B). En mamario normal, las células ALDH1 positivos fueron localizados principalmente en la región luminal (Figura 1B), y eran una población relativamente poco frecuente (1-2% de las células epiteliales luminales). También se encontraron células positivas pequeñas ALDH1 en el estroma de mama normal (Figura 1 B). Doble tinción inmunohistoquímica demostró que la mayoría de estas células (& gt; 90%) eran leucocitos CD45 positivos (datos no presentados). En el colon normal, aunque débilmente células ALDH1 positivas podían encontrarse en casi todas las criptas normales, el número de células fuertemente positivas ALDH1 era bastante limitado (Figura 1B). Estas células fuertemente positivas se encuentran principalmente en la base de las criptas (Figura 1B). patrones de tinción similares se observan también en el estómago (Figura 1B).
A. Un microarray de tejido de órganos humanos normales FDA se utilizó para caracterizar la expresión y distribución de ALDH1 en 24 tejidos. No se encontraron células B. ALDH1 fuertemente positiva en las áreas en las que las células madre /progenitoras epiteliales fueron supuestamente ubicados en mama, colon y estómago.
Expresión y distribución de proteínas ALDH1 en tumores epiteliales humanas
a continuación, se investigó la expresión ALDH1 en tumores epiteliales humanas usando arrays de tejidos. Como puede observarse, los patrones y los niveles de expresión de ALDH1 en tejidos humanos normales son notablemente diferentes y se pueden clasificar en tres tipos: 1) los tejidos con la expresión ALDH1 ausente o limitada, como el de mama o de pulmón; 2) el tejido con la expresión ALDH1 débil en relación, como el de colon o el epitelio gástrico; y 3) el tejido con una amplia y alta expresión de ALDH1 tal, como el hígado o el páncreas (Figura 1A). Por lo tanto, elegimos seis tipos (de mama, n = 69; pulmonar, n = 66; ovario, n = 65; de colon, n = 67; hígado, n = 67; y el cáncer de páncreas, n = 19) de los cánceres epiteliales cuyo correspondiente epitelios normales eran representativas de cada subtipo. En todos los seis tipos de tumores, se encontraron un gran número de células del estroma de tumor infiltrante positivos ALDH1 (Figura 2B). inmunotinción doble demostró que la mayoría de éstos eran células CD45 positivas. El porcentaje de células tumorales positivas ALDH1 en islotes tumorales se cuantificó de forma independiente por dos investigadores con formación patológica. Las células del estroma ALDH1 positivos fueron excluidos de este análisis. Hemos encontrado que la expresión ALDH1 fue negativo en 79,7% (55/69) de la mama, el 18,2% (12/66) de los pulmones y el 23,1% (15/65) de los cánceres de ovario. Por el contrario, sólo el 6,0% (4/67) de colon y 5,3% (1/19) de los cánceres de páncreas eran ALDH1 negativo, y todos los especímenes de cáncer de hígado fueron ALDH1 positivo. Además, para aquellos tumores ALDH positivos, también se analizó el porcentaje de células tumorales que expresan ALDH1. El porcentaje detallado de las células de cáncer positivo ALDH1 se resume en la Figura 2C. Excepto en el caso de cáncer de mama (4,3%), un alto porcentaje de expresión ALDH1 (entre 75 a 100% de las células tumorales) se encontró en cada uno de los otros cinco tipos de cáncer (de ovario: 29,2%, colon: 38,8%, pulmón : 43,9%, 78,9% de páncreas y el hígado: 97,0%). Tomados en conjunto, no había una correlación clara de expresión ALDH1 entre tumores y tejidos normales correspondientes. Por ejemplo, en aquellos tipos de cáncer donde ALDH1 fue altamente expresado en los epitelios normales correspondientes, tales como cánceres de hígado y de páncreas, ALDH1 se expresó en la mayoría de las muestras de tumor en niveles notablemente altos.
microarrays de tejido se utilizan para caracterizar la expresión y distribución de ALDH1 en tipos de cáncer (n = 353). A. Expresión de ALDH1 en los tejidos normales correspondientes. Se detectaron células infiltrantes de tumor B. ALDH1 + en el estroma. C. Expresión de ALDH1 en tumores epiteliales. se resumió porcentaje de células tumorales ALDH1 +. D. alto porcentaje de células ALDH1 + se asocia con pobres resultados clínicos en cáncer de ovario seroso.
Se ha informado por parte de grupos independientes que un alto porcentaje de células tumorales positivas ALDH1 se asocia con tiempos de supervivencia más cortos en de mama [34], [37], [42], de pulmón [38], de páncreas [40], de la vejiga [41] y de próstata [43] pacientes con cáncer. Hemos probado el valor pronóstico de la ALDH1 utilizando una matriz de tejido de cáncer de ovario seroso, el histotype más común de cáncer epitelial de ovario humano. Las muestras se recogieron en el Departamento de Ginecología y Obstetricia del Hospital Central Universitario de Helsinki. La mediana del tiempo de seguimiento de los pacientes vivos al final del período de estudio fue de 101 meses, que van desde 4 a 475 meses. Los pacientes fueron separados en dos grupos en función de ALDH1 inmunotinción: ALDH1 bajo (& lt; 10% células tumorales eran ALDH1 positivo) y ALDH1 elevada (células tumorales ≥10% eran ALDH1 positivo). En consonancia con los resultados de mama [34], [37], [42], de pulmón [38], de páncreas [40], la vejiga [41] y de próstata [43] pacientes con cáncer, se encontró que los pacientes con alta ALDH1 tenían enfermedad más corta horas libres y de supervivencia global en comparación con aquellos con bajo ALDH1 (p = 0,0036 yp = 0,023, respectivamente, Figura 2D).
ALDH1 actividad enzimática en las células epiteliales tumorales
El reactivo ALDEFLUOR, originalmente desarrollado para detectar la actividad de ALDH en tejidos hematopoyéticos [29], que se conoce para actuar como un sustrato para la ALDH1. Recientemente, el ensayo ALDEFLUOR se ha aplicado con éxito para detectar ALDH
br en las células madre de cáncer de tumores no hematopoyéticas [34]. En el presente estudio, se utilizó este ensayo para examinar ALDH1 actividad enzimática en las células epiteliales del tumor
in vitro
. En primer lugar, para validar los resultados de la matriz de tejido, elegimos líneas celulares a partir de tres tipos de tumores epiteliales como el de mama (n = 15), de ovario (n = 18) y el colon (n = 10). Como se muestra en la Figura 2, el porcentaje de tumores con una alta frecuencia de células ALDH1 positivas fue mayor en el cáncer de colon en comparación con cáncer de mama o de ovario. Consistente con este hallazgo, se encontró que el porcentaje de ALDH
células br en líneas celulares de cáncer de colon (15,5 ± 11,5%) fue notablemente mayor que en mama (3,5 ± 4,8%) o de ovario (6,2 ± 13,5%) de células de cáncer líneas (Figura 3B y Tabla S1). A fin de confirmar este resultado, se detectó la expresión de proteínas ALDH1 por transferencias Western en estas líneas celulares. Como era de esperar, ALDH1 niveles de expresión de proteínas se correlacionó positivamente con el porcentaje de ALDH
br células en las líneas celulares (Figura 3C y Figura S3). Aunque hubo una clara correlación positiva entre
in situ
inmunotinción y los resultados del ensayo ALDEFLUOR en estos tres tipos de tumores, el porcentaje de células que muestran actividad enzimática ALDH1 por citometría de flujo era más pequeño que el porcentaje de células positivas por inmunotinción ALDH1 . Por ejemplo, 4,3%, 29,2% y 38,8% de las muestras de mama, de ovario y de cáncer de colon altamente expresados ALDH1 (entre 75 a 100% de las células tumorales eran ALDH1 positiva, la Figura 2C), sin embargo, ninguna de las líneas de células tumorales se compone de mayor que 75% de ALDH
células br (Tabla S1). A continuación, elegimos el cáncer de ovario como un ejemplo para investigar la actividad enzimática de ALDH en células tumorales primarias. Se examinaron dieciséis muestras de cáncer de ovario en fase tardía. Dado que hemos encontrado que los leucocitos infiltrantes de tumores expresan altos niveles de ALDH1 (Figura 2B), que primero separados células de ascitis por CD326 (EpCAM, un marcador epitelial a la puerta de la población de células tumorales) o CD45 (un fabricante de linfocitos a la población de linfocitos puerta) después de la eliminación de las células muertas usando perlas magnéticas. El ensayo ALDEFLUOR se utilizó para detectar células con actividad de ALDH en cada una de la población por encima (Figura 4A). Se encontró que el 2,6 ± 3,1% (0,1-11,3%) de células CD45 positivas fueron ALDH
br (Figura 4B). En consonancia con el estudio de líneas celulares, 1,1 ± 1,9% (0,1-7,0%) de las células tumorales positivas CD326 eran ALDH
br (Figura 4B), un porcentaje menor que en los resultados de inmunotinción.
A. actividad enzimática ALDH1 se detectó usando el ensayo de ALDEFLUOR. DEAB se utilizó para inhibir la reacción de ALDH con el reactivo ALDEFLUOR, proporcionando un control negativo. B. Resumen de la actividad enzimática en ALDH1 de mama establecido (n = 15), de ovario (n = 18) y líneas celulares de cáncer de colon (n = 10). expresión de la proteína C ALDH1 se detectó mediante transferencias Western. Hubo una correlación positiva entre la expresión de la proteína y la actividad enzimática ALDH1 ALDH1. Las transferencias de larga duración se presentan en la Figura Adicional S3.
A. actividad enzimática ALDH1 en células aisladas de una muestra de cáncer de ovario. Las células muertas se eliminaron usando perlas magnéticas y un separador MidiMACS. Para determinar el inmunofenotipo de ALDH
br células de ascitis, APC-CD45 o APC-CD326 se utilizó para la tinción de contraste. DEAB se utilizó para inhibir la reacción de ALDH con el reactivo ALDEFLUOR, proporcionando un control negativo. B. Resumen de los porcentajes de ALDH
br en cada población de células de ovario de pacientes con cáncer en etapa tardía 16.
Para hacer frente a la cuestión de si a largo plazo
in vitro
cultura afectará significativamente la actividad de ALDH en líneas celulares de cáncer, se optó por un modelo de ratón transgénico de cáncer de ovario, en el que un oncogén (la región transformadora de SV40) se sobreexpresa por la superficie del ovario específico Mülleriana inhibir tipo sustancia receptor II (MISRII) promotor (Figura S1 A). El ensayo ALDEFLUOR se realizó en ambas células tumorales aisladas primarias y dos cultivos a largo plazo de líneas de células tumorales (más de 40 pases) que fueron aisladas de un mismo modelo. Se encontró que no había diferencia significativa en el porcentaje de ALDH
células br entre los tumores primarios (9,5 ± 7,6%, n = 5) y cultivos de células a largo plazo (6,8 ± 4,9%, n = 2, P & gt; 0,05 , la Figura S1B). Dado que sólo un número limitado de líneas celulares fueron analizados en el presente estudio, esta conclusión es necesario validar aún más en otros modelos.
Finalmente, se comparó la actividad de ALDH en células de cáncer de ovario y de sus correspondientes epitelios normales, las células epiteliales de la superficie del ovario. Tres líneas de células inmortalizadas humanas epiteliales de ovario superficie se compararon con 18 líneas celulares de cáncer de ovario humano, y células primarias aisladas de la superficie del ovario de murino se compararon con 7 líneas celulares de cáncer de ovario murino (incluyendo dos líneas de la MISIIR-SV40 ratón transgénico). Se encontró que el porcentaje de ALDH
células br fue relativamente mayor en las células epiteliales de la superficie del ovario normales (humano: 13,1 ± 6,72%, n = 3; murino: 7,6%, n = 1) en comparación con las células de cáncer de ovario (humanos: 6,2 ± 13,5%, n = 18; murina: 3,8 ± 2,92%, Figura S2). Del mismo modo, el porcentaje de ALDH
células br fue relativamente mayor en las células epiteliales mamarias normales (8,18 ± 4,31%, n = 14) [34] en comparación con las células de cáncer de mama (3,5 ± 4,8%, n = 15, Figura 3) .
ALDH
br células tumorales tienen cáncer propiedades de células madre y se resisten a la quimioterapia
se ha demostrado que sup>
células br aisladas de líneas celulares en cultivo a largo plazo establecidos, ALDH
baja y ALDH
células tumorales br fueron aisladas de mama humano establecido y líneas celulares de cáncer de ovario por FACS clasificación. En primer lugar, su capacidad de auto-renovación se examinó utilizando el ensayo mammosphere [48] en cuatro células de cáncer de mama. El número de mammospheres formados por ALDH
células tumorales br fue significativamente mayor que por ALDH
baja células tumorales (Figura 5A). ALDH
células bajos de líneas de células ZR-75-1 T47-D y carecían de la capacidad para formar mammospheres en cultivo en suspensión. A continuación, examinó su
in vitro
capacidades de crecimiento tumoral utilizando el ensayo de formación de colonias en líneas celulares de cáncer de mama 5. ALDH
br células tumorales forman colonias visiblemente más grandes en comparación con ALDH
células tumorales bajos (Figura 5B). Además, los números de colonias de ALDH
células tumorales br fueron significativamente mayores que de ALDH
células tumorales bajas (Figura 5B). Por último, el
in vivo
capacidad tumorigénico de la ALDH
baja y ALDH
br células tumorales se examinó el uso de células tumorales que se trasplantaron injerto (500; 5.000, o 50.000) a ratones inmunodeficientes . Se encontró que 500 ALDH
br pero no ALDH
células tumorales bajos eran capaces de generar los xenoinjertos de tumores
in vivo gratis (Figura 5C). Histología de tres xenoinjertos de tumores se examinó mediante la tinción HE. En RBSK-3 líneas celulares MCF-7 y, no hubo diferencia significativa entre histológico ALDH
br y ALDH
tumores bajos. las células del estroma Sin embargo, en el BT-474 tumores, no estaban limitados en ALDH
br tumores en comparación con ALDH
tumores bajos (Figura 5D).
In vivo
proliferación celular también se examinó mediante la tinción de Ki-67. No se encontró ninguna diferencia significativa en el índice de proliferación (porcentaje del 67 Ki-células positivas) entre la ALDH
br y ALDH
tumores bajas en las tres líneas celulares (Figura 5E).
A. ALDH
br poblaciones de células (azul) generaron un número significativamente mayor de mammospheres en comparación con la ALDH
Población bajo (amarillo). B. La tumorigenicidad de la ALDH
br y ALDH
baja células se examinaron
in vitro
utilizando ensayos de formación de colonias. C. La tumorigenicidad de la ALDH
br y ALDH
baja células se examinaron
in vivo
. D. Histología de la ALDH
br y ALDH
bajos BT-474 tumores se examinó mediante la tinción HE. E. proliferación de la ALDH
br y ALDH
BT-474 tumores de bajo fue examinado por Ki-67 inmunotinción.
pruebas rápida acumulación sugiere que las células madre del cáncer pueden ser altamente resistentes a la la radiación o la quimioterapia [18], [19], [20]. De acuerdo con estos resultados, se encontró que la ALDH
población de células br se expande en un conjunto de líneas de ovario resistentes a platino de células de cáncer, A2780 /CP70, A2780 /C200 y A2780 /C30, en comparación con su platino parental sensible a las líneas, A2780 /WT (Figura 6A). Además, el tratamiento de las células con cisplatino (1XIC
50) enriquecido significativamente la ALDH
br población celular en líneas celulares de ovario y de cáncer de mama
in vitro
(Figura 6B). La ALDH
br población fue significativamente más resistentes al tratamiento de platino en comparación con el ALDH
baja población (Figura 6C). Por último, probamos la observación anterior
in vivo
utilizando un modelo de ratón con xenoinjerto de cáncer de ovario. Tres semanas después de la implantación de las células tumorales, A2780 (5 × 10
6 por animal), los ratones se asignaron aleatoriamente a tres grupos experimentales para recibir el tratamiento por vía i.p. inyección con 1) el tratamiento de control (n = 4), 2) de tratamiento 2 mg /kg de cis-platino (½ dosis máxima tolerada (MTD), n = 3) y 3) de tratamiento 4 mg /kg de cis-platino (completo MTD, n = 3). El q7d × 4 i.p. programa de tratamiento (Figura 6D) se utilizó para la terapia experimental. Porcentaje de la población de ALDH positiva se analizó mediante el ensayo ALDEFLUOR. De acuerdo con nuestra
in vitro
de datos, el tratamiento de cis-platino aumentaron significativamente la ALDH
br población de células en el tumor de xenoinjerto
in vitro gratis (Figura 6D, ½ MTD: 8,44 veces en promedio ; MTD completo: 4,67 veces en promedio, en comparación con los tumores no tratados). Se sugiere que la ALDH
población de células tumorales br es resistente a la quimioterapia. Resultados similares también se informó en el cáncer de colon
in vivo
más recientemente por un grupo independiente [50].
A. ALDH
br células se ampliaron notablemente en líneas celulares resistentes a platino (A2780 /CP70, A2780 /A2780 y C200 /C30) en comparación con su línea de platino sensible parental (A2780 /WT). B.
in vitro
tratamiento de platino En aumentó significativamente la ALDH
br población celular en líneas celulares de ovario y cáncer de mama después de tres días. C. ALDH
br células eran resistentes al tratamiento platino. ALDH
br y ALDH
baja células fueron aisladas mediante separación FACS. D. ALDH
br población de células tumorales era resistente a la quimioterapia
in vivo
. El q7d × 4 i.p. programa de tratamiento se utilizó para la terapia experimental. Los tumores se recogieron y se disociaron mediante digestión con enzimas. Porcentaje de la ALDH
br población se analizó mediante el ensayo ALDEFLUOR.
Discusión
Como un enfoque novedoso, el ensayo y la inmunotinción ALDEFLUOR ALDH1 pueden resultar útiles para la detección y el aislamiento de las células madre del cáncer en los tumores epiteliales, lo que facilita la aplicación de los conceptos de células madre de cáncer en la práctica clínica [34]. Se encontró que el patrón y el nivel de expresión de ALDH1 en condiciones normales de tejidos humanos son notablemente diferentes y se pueden clasificar en tres tipos: 1) los tejidos con la expresión ALDH1 ausente o limitada, como el de mama o de pulmón; 2) el tejido con la expresión ALDH1 débil relativa, como el de colon o epitelios gástricos; y 3) el tejido con una amplia y alta expresión de ALDH1, tales como el hígado o el páncreas (Figura 1A).