Extracto
La migración y la invasión de las células malignas son requisitos previos para la progresión del cáncer y la metástasis. La familia Bcl-2 de proteínas consiste en cerca de 25 miembros y ha sido ampliamente estudiado en el contexto de la apoptosis. A pesar del hecho de que las pequeñas moléculas dirigidas a proteínas Bcl-2 ya han entrado en ensayos clínicos, muy pocos estudios investigaron un papel de antiapoptóticas Bcl-2 de proteínas junto a la muerte celular en el contexto de la metástasis. El objetivo de este estudio fue analizar un posible papel de los anti-apoptóticas Bcl-2 proteínas MCL-1, Bcl-2 y Bcl-x
L sobre la migración y la invasión de células de cáncer colorrectal con independencia de su función de control de la muerte celular. Utilizamos ensayos de migración y la invasión, así como tres cultivos de células dimensionales para analizar las líneas celulares de cáncer colorrectal (HT29 y SW480) después de siRNA mediada desmontables o sobreexpresión de MCL-1, Bcl-2 o Bcl-x
L. Hemos observado ni inducción de muerte celular espontánea ni alteración de la proliferación de las células que carecen de Mcl-1, Bcl-2 o Bcl-x
L. Por el contrario, desmontables de MCL-1 provocó un aumento de la proliferación. Sorprendentemente, se demuestra un profundo deterioro tanto, la migración y la invasión de células de cáncer colorrectal después de MCL-1, Bcl-2 o Bcl-x
L caída. Este fenotipo se revisó completamente en las células que sobreexpresan MCL-1, Bcl-2 o Bcl-x
L. Se observó el efecto más pronunciado entre las proteínas investigados por Bcl-2. Los datos presentados indican un papel fundamental de MCL-1, Bcl-2 y Bcl-x
L para la migración y la invasión de células de cáncer colorrectal independientes de sus efectos antiapoptóticos conocidos. Por lo tanto, nuestro estudio pone de manifiesto nuevos mecanismos antitumorales de la proteína Bcl-2 focalización
Visto:. Koehler aC, Scherr A-L, S Lorenz, Urbanik T, N Kautz, Elssner C, et al. (2013) Más allá de la muerte celular - antiapoptóticos proteínas Bcl-2 regular la migración y la invasión de células de cáncer colorrectal
in vitro
. PLoS ONE 8 (10): e76446. doi: 10.1371 /journal.pone.0076446
Editor: Jun Li, Escuela de Medicina de la Universidad Sun Yat-sen, China
Recibido: 14 Junio, 2013; Aceptado: 23 Agosto 2013; Publicado: 3 Octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Koehler et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio el apoyo de una beca de postdoctorado-concedida a BCC de la Facultad de Medicina de la Universidad de Heidelberg, Alemania (http://www.medizinische-fakultaet-hd.uni-heidelberg.de), y subvenciones para HSB de la Fundación alemana de Investigación (Deutsche Forschungsgemeinschaft, http://www.dfg.de/, DFG SCHU 1443 /4-1) y de Merck Serono GmbH (Darmstadt, Alemania). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Henning Schulze-Bergkamen recibido becas de investigación, así como el reembolso de los gastos de viaje de conferencias y honorarios de Merck Serono GmbH. Ninguno de los autores tiene que ver con Merck Serono de empleo, consultoría, patentes y productos en desarrollo o comercialización de productos. Ningún producto de Merck Serono se ha utilizado o investigado en el manuscrito. Merck Serono GmbH no estaba involucrado en los experimentos o preparación del manuscrito. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
El carcinoma colorrectal (CCR) es la segunda neoplasia maligna más común en las mujeres y la tercera en los hombres de todo el mundo con una incidencia creciente. Además, el CRC es la cuarta causa de muerte por cáncer. Incluso si los avances en el desarrollo de fármacos y la cirugía condujeron a un aumento de la supervivencia global, el pronóstico de los pacientes con CCR hecho metástasis (estadio UICC IV) es todavía limitada [1], [2]. Metastasation es una causa importante de muerte en pacientes con cáncer e implica un proceso de múltiples pasos de enorme complejidad. A pesar de nuestra creciente comprensión de las vías subyacentes, muchos aspectos de la metástasis permanecen sin resolver [3], [4].
Familia
El linfoma de células B-2 (Bcl-2) de las proteínas consta de unos 25 miembros y ha sido ampliamente estudiado con respecto a la señalización de apoptosis. El delicado equilibrio de proteínas Bcl-2 gobierna el destino de las células en la superficie mitocondrial. Los pro-apoptóticos proteínas Bcl-2 (es decir, Bax y Bak) están obligados por sus parientes anti-apoptóticas (es decir, MCL-1, Bcl-2 y Bcl-x
L). En caso de un cambio de este equilibrio hacia la muerte, los pro-apoptóticos proteínas Bcl-2 son liberados por sus homólogos anti-apoptóticas. Una vez que los pro-apoptóticos proteínas Bcl-2 son puestos en libertad, las mitocondrias se activan y se produce la muerte celular [5]. Por otra parte, una contribución de las proteínas antiapoptóticas a necrosis y la autofagia se ha demostrado [6], [7]. En la autofagia, anti-apoptóticas Bcl-2 proteínas actúan secuestrando proteínas proautophagic como Beclin1 [8], [9].
Los anti-apoptóticas Bcl-2 proteínas son ampliamente sobreexpresa en los cánceres humanos incluyendo CRC. Por ejemplo, un aumento de la expresión de Bcl-x
L y MCL-1 se ha mostrado para CRCs y se correlaciona con una mala diferenciación, estadio tumoral más alto y mal pronóstico de los pacientes [10] - [12]. Por el contrario, otro estudio presenta datos que correlacionan una alta expresión de Bcl-2 con buena evolución clínica de los pacientes con CCR [13]. Estos informes contradictorios apuntan a funciones no redundantes de anti-apoptóticas Bcl-2 de proteínas y dilucidar la necesidad de una investigación más profunda del compromiso y la pertinencia de estas proteínas en el CCR.
Hay una creciente evidencia de un papel de las proteínas anti-apoptóticas allá de la regulación de muerte celular. Por ejemplo, MCL-1 y sus variantes de empalme se han demostrado interactuar con la cadena respiratoria y el metabolismo oxidativo [14]. Bcl-x
L y Bcl-2 se han relacionado con señalización implicadas en las especies reactivas de oxígeno (ROS) [15], [16]. Los efectos de las proteínas Bcl-2 sobre la proliferación aún no se han aclarado. Hay cierta evidencia de efectos antiproliferativos de Bcl-2, Bcl-x
L y MCL-1 en el entorno fisiológico [17]. En este caso, un beneficio de supervivencia de las células menos propensas a la apoptosis se mantiene al menos en parte de la costa de la proliferación. Sin embargo, es importante para hacer frente a la cuestión, si los efectos reguladores de proteínas Bcl-2 en el ciclo celular y muerte celular son fenómenos independientes. Hasta ahora, sólo unos pocos se sabe acerca de un posible compromiso de los anti-apoptóticas Bcl-2 de proteínas sobre la migración y la invasión de las células cancerosas. Bcl-x
L se ha demostrado estar involucrados en metastasation cáncer de mama y la migración CRC, pero el papel de Bcl-2 y MCL-1 a la extensión del tumor permanece sin resolver [18], [19]. En nuestro estudio tuvo como objetivo investigar la inducción de muerte celular, la proliferación, la migración y la invasión de las células CRC después de la eliminación de Bcl-2, Bcl-x
L o MCL-1 de expresión. Es importante destacar que una caída de antiapoptóticas Bcl-2 de proteínas inhibe directamente la migración y la invasión de las células de CRC independientes de la inducción de la muerte celular o efectos sobre la proliferación. En resumen, nuestro estudio proporciona nuevos conocimientos sobre los efectos antitumorales de la inhibición de la proteína Bcl-2 en el cáncer colorrectal más allá de la señalización de la muerte celular y la regulación del ciclo celular.
Materiales y Métodos
Reactivos y líneas celulares
CRC líneas celulares HT29, SW480, CaCo2 y Colo205 se adquirieron de ATCC. Las células se cultivaron en una atmósfera humidificada (37 ° C, 5% de CO
2) en RPMI + GlutaMAX ™ (Gibco, Karlsruhe, Alemania) suplementado con 10% de FCS (PAA Laboratories, Cölbe, Alemania), 1% Pen /Strep (PAA Laboratories), 1% HEPES (Gibco) y aminoácidos no esenciales al 1% (NEAA, Gibco). Todas las líneas celulares fueron evaluados regularmente para detectar contaminaciones y no exceden de un paso de reactivos quimioterapéuticos 10. 5-fluorouracilo, oxaliplatino e irinotecán fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (Hamburgo, Alemania).
Prueba de Viabilidad
Las células fueron sembradas en placas de 12 pocillos y 24 h después de la siembra transfectadas o someterse al tratamiento indicado. La viabilidad celular se determinó usando un 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, bromuro de 5-difeniltetrazolio ensayo colorimétrico (MTT) como se describe antes [20]. Se midió la absorbancia a 550 nm usando un lector de microplacas (Infinito 200 pro; Tecan, Männedorf, Suiza).
RNAi, plásmidos y Transfección
pequeños ARN de interferencia (siRNA) de orientación Bcl-x
L, Bcl-2, MCL-1 mRNA o DNA plásmido se administró en el día 1 después de la siembra de las células en 12 o placas de 6 pocillos con una confluencia de 70-80% en el momento de la transfección. Las siguientes secuencias de siRNA se aplicaron (MWG Biotech, Ebersberg, Alemania): Bcl-x
L-5 'gcuuggauaaagaugcaaTT-3' (sentido) y 5'-uugcaucuuaucccaagcAG-3 '(antisentido), MCL-1 5' aaguaucacagacguucucTT-3 '(sentido) y 5'-gagaacgucugugauacuuTT-3' (antisentido), Bcl-2 5'-uaauaacgugccucaugaaTT-3 '(sentido) y 5'-uucaugaggcacguuauuaTT-3' (antisentido). siRNA contra GFP se utilizó como control: GFP 5'-ggcuscguccaggagcgcaccTT-3 '(sentido) y 5'-ggugcgcuccuggacgguagccTT-3' (antisentido). Las letras minúsculas representan ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos capitales. Las células fueron transfectadas en OptiMEM® (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) sin ningún tipo de suplementos usando RNAiMAX ™ (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
El plásmido transfección se realizó utilizando Lipofectamine® LTX (Invitrogen) en OptiMEM® para SW480 células o ADN peqFECT (Peqlab, Erlangen, Alemania) en RPMI completo para las células HT29 de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se usaron los siguientes plásmidos: MCL-1 humano se clonó en un vector pEF4. Bcl-2 y Bcl-humana x
L fueron clonados en un vector pcDNA3. pcDNA3- hBCL-2 fue una especie de regalo de W. Roth (Instituto de Patología, Heidelberg). pcDNA3- hBCL-x
L fue proporcionado amablemente por M. Li-Weber y P. H. Krammer (Centro Alemán de Investigación del Cáncer, Heidelberg, Alemania). Correspondientes vectores vacíos se utilizaron como controles. En paralelo, la eficacia de transfección fue validada utilizando transfección de GFP mediante citometría de flujo. La eficacia de transfección fue de al menos 70% en todos los experimentos (datos no mostrados) y se evaluó adicionalmente mediante Western blotting 24, 48 y 72 h después de la transfección.
Detección de la proliferación y la muerte celular
Después del tratamiento , el sobrenadante se transfirió a tubos y las células fueron separadas suavemente con Accutase ™ (PAA) y se agruparon con el sobrenadante correspondiente FACS. Después de la centrifugación, las células se resuspendieron en un tampón hipotónico que contiene 0,1% (w /v) de citrato de sodio, 0,1% (v /v) de Triton X-100 y 50 mg /ml de yoduro de propidio (Sigma-Aldrich). Después de 1 h de incubación a 4 ° C el contenido total de ADN de las células se midió de acuerdo con el protocolo de Nicoletti
et al.
[21] utilizando un flujo CANTO II citómetro (Becton Dickinson [BD], Franklin Lakes, NJ EE.UU.). El análisis del ciclo celular se realizó mediante FACS Diva 6 (BD) y FlowJo 7.6.5. (Árbol Star Inc., Ashland, Oregón EE.UU.). Las células que representan la fracción subG1 se representan como apoptosis.
Para especificar con mayor detalle la inducción de muerte celular y la proliferación, las células se fijaron y permeabilizaron usando ciclo celular y la proliferación kit de citometría de flujo (BD) de acuerdo con el protocolo del fabricante. En resumen, se pulsaron las células durante 1 h con 20 mM bromodesoxiuridina (BrdU) para discriminar descansando de células proliferantes. En lo sucesivo, se recogieron las células, se fijaron, permeabilizaron y luego refixed seguido de tinción con anticuerpos fluorocromo acoplado contra PARP escindida (Asp214, acoplado a PE) como un indicador de apoptosis, BrdU (acoplado a PerCP-Cy ™ 5.5) para la proliferación y phosphorylated- H2AX (pS139, acoplado a Alexa Fluor ® 647) de daño en el ADN, respectivamente. Las células fueron analizadas por citometría de flujo.
Lisis Celular, SDS-PAGE y Western Blotting
Las células se sembraron en placas de 12 pocillos, se cultivaron durante 24 h y se tratan como se indica. La lisis celular, SDS-PAGE y Western Blot se realizaron. Los siguientes anticuerpos fueron utilizados para la inmunodetección: anti-MCL-1 (Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Alemania), anti-Bcl-x
(Cell Signaling, Boston, MA EE.UU.) L, anti-Bcl-2 (Abcam, Cambridge, Reino Unido), anti-αTubulin (Sigma), anti-PARP escindida (ASP214, Señalización celular).
Recuento celular
Las células se sembraron en placas de 6 pocillos y se transfectaron con ARNsi específico después 24 h. Las células se recogieron, se volvieron a suspender y luego se contaron usando una cámara de Neubauer 24, 48 y 72 h después de la transfección. Tripano tinción con azul fue utilizado para excluir las células muertas y fragmentados durante el recuento procedimiento.
ensayos de migración
2 × 10
6 células fueron sembradas en placas de 12 pocillos, cultivadas a una confluencia de aproximadamente 70 a 80% y se transfectaron como se indica. 24 h después de la transfección la monocapa de células se raspó con una punta de pipeta estéril. Después, las células se lavaron con medio y las imágenes fueron inmediatamente capturados utilizando un microscopio invertido (CKX41, Olympus Inc., Hamburgo, Alemania) equipado con una cámara digital de color (XC30, Olympus Inc.). La ubicación exacta de la imagen dentro de la monocapa fue marcado para identificar la misma distancia durante el próximo 72 h. La reducción de distancias se midió cada 24 h como sigue usando el software de imágenes CellSense® (Olympus Inc.): distancias Gap del cero entre un lado y el otro se midieron a ciertos intervalos a lo largo del borde de la rayado generado (cada 200 m). Después se calculó la media de las distancias medidas y en comparación con la distancia media de la brecha en el punto de tiempo de inicio del experimento [22].
Invasión Ensayo
BioCoat Matrigel ™ ™ Cámaras Invasion (tamaño de poro 8 micras, BD) se utilizaron para estudiar la invasión de células SW480. cámaras de invasión Matrigel ™ se hidrataron en FCS libre de RPMI en una atmósfera humidificada durante 2 h. De aquí en adelante, las cámaras de invasión se transfirieron en pocillos de placas de compañero (BD) que contiene 750 l de RPMI suplementado con 10% FCS. FCS sirve como un quimioatrayente para células invasoras. Las células se sembraron en placas de 12 pocillos y se transfectaron como se describe. 24 h de transfección las células se recogieron usando enviar Accutase ™ (PAA), se agruparon y se contaron. 3 × 10
5 células se resuspendieron en 500 l FCS libre de RPMI y se transfieren a la parte superior de la cámara de invasión. Después de 72 h, la superficie superior de la cámara de invasión se restregó para eliminar las células no invasora usando un hisopo de punta de algodón. células invadidas en la superficie inferior del inserto se fijaron con 80% de EtOH durante 30 min seguido de tinción de los núcleos utilizando Hoechst 33342 (Invitrogen) durante 15 min. a continuación, inserta se lavaron en PBS. Cinco fotografías de cada inserto fueron tomadas y el número de células invadidas se contó a simple vista.
Cell 3D Cultura y
Se utilizó Alvetex® andamios hechos de un material inerte, altamente poroso y transversal vinculada andamio de poliestireno, se secciona en una membrana de espesor de 200 micras para llevar a cabo tres experimentos de cultivo celular dimensiones adecuadas. Alvetex® Los andamios se utilizaron en formato de placa de 12 pocillos (reinervar AVP002, Sedgefield, Reino Unido) en condiciones estériles. Los andamios se incubaron con EtOH filtrada estéril (80%) durante 5 minutos como tratamiento previo, se lavaron dos veces con medio y se deja en medio. Las células se transfectaron y se recogieron usando Accutase ™ como se describe, se contaron y se resuspendieron en RPMI completo. 1 × 10
6 células luego fueron sembradas en la parte superior del disco inserto en un volumen total de 200 l de medio. 3 h después de la siembra, los andamios se inundaron suavemente desde abajo hasta que se alcanzó una cobertura completa. El medio se cambió cada 48 h.
seccionamiento e inmunohistoquímica de 3D-andamios
Después de 72 h, los andamios se lavaron dos veces en PBS, se cortan en rodajas e inmediatamente transferido en Cryomolds® que contiene medio de montaje octubre (Servicios de Ciencia, Munich, Alemania) y se congeló gradualmente en la fase gaseosa de nitrógeno líquido. Después de 24 horas a -80 ° C, los andamios se cryosectioned (Criostato, Thermo) y se montaron en HistoBond® diapositivas. Secciones (9 m de espesor) se fijaron en PFA al 4% y se tiñeron con hematoxilina y eosina para los estudios morfológicos, recuento total de células y la medición de la profundidad de la invasión. Además, se realizó inmunohistoquímica utilizando el sistema de detección NovoLink Polymer (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante después de PFA-fijación y el calor de recuperación del epítopo inducida (HIER) en tampón citrato (pH 6). Los anticuerpos contra Ki67 (Abcam) y Bcl-x
L (Señalización Celular) se utilizaron y los portaobjetos se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las imágenes fueron capturadas utilizando un microscopio invertido. Las imágenes fueron analizados utilizando el software ImageJ y CellSense®.
Análisis estadístico
Los datos obtenidos en la invasión y 3D-andamio experimentos se analizaron mediante la prueba t de Student (emparejado, dos caras) basan en la distribución de datos normal. Para Ensayos de Migración, la relación entre gapclosure como respuesta, y el tiempo y el tratamiento como variables explicativas fue investigado por un análisis de varianza (ANOVA). El análisis de la interacción entre el tiempo y el tratamiento no era un objetivo del presente estudio y no se incluyó en el modelo de varianza. el software SPSS 20 estadísticas (IBM, NY, EE.UU.) se utilizó para todos los análisis estadísticos. Un valor de P & lt; 0,05 se consideró significativo
Resultados
MCL-1, Bcl-2 y Bcl-XL Expresión en líneas celulares de cáncer colorrectal humano
con el fin de investigar la expresión de los anti-apoptóticas Bcl-2 proteínas MCL-1, Bcl-2 y Bcl-x
L en las líneas celulares de CRC humanos, que mide los niveles de proteínas en cuatro líneas celulares de cáncer colorrectal. CaCo2, Colo205, HT29 y SW480 células son ampliamente utilizados y bien caracterizado [23], [24]. células CaCo2 son conocidos por ser mal tumorigénico en ratones. células SW480 y Colo205 son localmente invasivos en modelos de tumores ortotópico. células HT29 metástasis en el hígado y el pulmón cuando se inyecta en el tejido subcutáneo [24]. MCL-1, Bcl-2 y Bcl-x
L expresión fue detectable en las líneas celulares de CRC (Fig. 1A). células CaCo2 mostraron cantidades considerables de MCL-1, Bcl-2 y Bcl-x
L, con el nivel de expresión más alto de Bcl-2. células Colo205 tenían una cantidad disminuida de Bcl-x
L. células SW480 tenían una cantidad aproximadamente igual de todas las proteínas Bcl-2. células HT29 mostraron una expresión dominante de Bcl-2 y un nivel bajo de Bcl-x
L. Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que el patrón de expresión de proteínas anti-apoptóticas variaron en las líneas celulares de CRC utilizado en nuestro estudio. No hubo correlación entre la tumorigenicidad de una línea celular y un cierto patrón de expresión (Fig. 1A). Decidimos centrarnos en las células SW480 y HT29 para experimentos adicionales con Bcl-2 desmontables, debido a que ambas líneas celulares comparten la capacidad de invadir y forman metástasis en modelos de ratón. Analiza
(A) Western blot del cáncer colorrectal líneas celulares CaCo2, Colo205, SW480 y HT29. Basales niveles de expresión de Bcl-x
L, MCL-1 y Bcl-2. Tubulina sirvió como control de carga. Las células se disponen con el aumento de la tumorigenicidad de izquierda a derecha. Aquí, la tumorigenicidad indica la capacidad de una línea de células de metástasis en ratones. La tumorigenicidad más bajo significa un crecimiento local del tumor que carece de capacidad de invasión; la más alta tumorigenicidad indica la formación de metástasis a distancia de órganos (hígado y /o pulmón). análisis (B) Western blot de HT29 (izquierda) y SW480 (derecha) de las células después de siRNA mediada desmontables de MCL-1, Bcl-2 y Bcl-x
L 24, 48 y 72 h después de la transfección. Tubulina sirvió como control de carga. Las transferencias de Western presentados son representativos de tres experimentos independientes.
Desmontables de antiapoptóticos proteínas Bcl-2 no induce la apoptosis espontánea, pero sensibiliza a las células CRC con la Quimioterapia
Se determinó el efecto de la primera siRNA específico de orientación Bcl-2, Bcl-x
L o MCL-1 durante un periodo de tiempo de 72 h en HT29 y las células SW480. En este caso, la regulación a la baja de las proteínas anti-apoptóticas fue eficiente durante al menos 72 h como se observa por Western blot (Fig. 1 B). Con el fin de analizar el impacto de una regulación a la baja de Bcl-2, Bcl-x
L o MCL-1 sobre la viabilidad celular que realizan MTT Ensayos de 48 h después de la transfección. Los resultados indican que no hay efectos de disminución de anti-apoptóticas Bcl-2 niveles de proteína en la viabilidad celular en células HT29 y SW480 (Fig. 2 A).
(A) Ensayo de MTT-SW480 y células HT29 después desmontables de Mcl- 1, Bcl-2 y Bcl-x
L. (B) por citometría de flujo y análisis correspondientes transferencias de Western para la escisión de PARP 48 h después de la desmontables de MCL-1, Bcl-2 y Bcl-x
L en HT29 (izquierda) y células SW480 (derecha). análisis (C) por citometría de flujo de HT29 (izquierda) y células SW480 (derecha) para pH2AX 48 h después de la desmontables de MCL-1, Bcl-2 y Bcl-x
L. 24 h de tratamiento estaurosporina (1 M) sirvió como control positivo para la inducción de la muerte celular. (D) Análisis de citometría de flujo para la fragmentación del ADN de células HT29 después de desmontables de MCL-1, Bcl-2 y Bcl-x
L seguido de 48 h de tratamiento con 30 mM oxaliplatino y 0,2% de DMSO como vehículo. Citometría de flujo análisis se realizó por triplicado. Las barras representan la media ± SD. Los ensayos son representativos de al menos tres experimentos independientes. (Oxa = oxaliplatino).
En segundo lugar, se investigó si la inducción de muerte celular espontánea se produjo en células HT29 y SW480 transfectadas. Por lo tanto, se analizaron las células para poli escindido (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) 48 h después de la transfección por citometría de flujo, así como por transferencia de Western. Desde PARP es un objetivo de la caspasa 3 activa su escisión indica una ejecución eficiente de la apoptosis [25]. No se detectó un aumento en escindido (cl.) Niveles de PARP, con posterioridad a MCL-1 desmontables (Fig. 2 B). Para Bcl-2 y Bcl-x
L desmontables, se detectó un ligero aumento de la cl. los niveles de PARP por FACS, pero no pudieron detectar una cantidad razonable de proteína escindida en transferencias Western (Fig. 2 B). Además, se verificó la presencia de daño en el ADN como un sello distintivo de la muerte celular. Por lo tanto, teñidas las células 48 h después de la transfección con fluorocromo anticuerpo acoplado de orientación fosforilados histona H2AX [26]. La fosforilación de H2AX se produce en respuesta a ADN de doble filamento se rompe. No había ninguna cantidad considerable de H2AX fosforilado detectable en las células transfectadas y los controles (Fig. 2 C). Estaurosporina tratamiento (STS) de HT29 y las células SW480 sirvió como control positivo para la inducción de la muerte celular (Fig. 2 B y C).
En tercer lugar, el objetivo fue investigar el potencial de antiapoptótico proteína Bcl-2 desmontables para sensibilizar a las células HT29 a agentes quimioterapéuticos clínicamente relevantes y de uso común. Para 5-FU e irinotecán no hubo efecto sensibilizante significativas de siRNA mediada desmontables de proteínas antiapoptóticas, como se evaluó por análisis de FACS de la fragmentación del ADN (datos no mostrados). En marcado contraste, se observó una sensibilización profunda y altamente significativo al oxaliplatino después de la precipitación de las proteínas anti-apoptóticas Bcl-2, Bcl-x
L y MCL-1 (Fig. 2D).
En su conjunto, estos resultados indican que una caída de Bcl-2, Bcl-x
L o MCL-1 no dio lugar a la muerte celular espontánea y fue aparentemente bien compensados en las células de CRC. Entre los agentes quimioterapéuticos aplicado en el tratamiento de CRC, sólo el efecto de oxaliplatino fue marcadamente aumentada por la precipitación de las proteínas anti-apoptóticas.
Desmontables de antiapoptóticos proteínas Bcl-2 no ejerce efectos antiproliferativos sobre células CRC
Después de la exclusión de la inducción de la muerte celular espontánea después de Bcl-2, Bcl-x
L o MCL-1 desmontables próximo investigó la proliferación de células de CRC. Una alta proporción de las células HT29 sin tratar (38,6%) se proliferando según la evaluación de la incorporación de BrdU (Fig. 3 A y B). La relación de la proliferación de células no fue significativamente diferente después de Bcl-2 y Bcl-x
L desmontables (siBcl-2:37,3%; siBcl-x
L: 37,4%). Por el contrario, desmontables de MCL-1 condujo a un aumento significativo en la incorporación de BrdU en comparación con los controles (47,5 vs. 38,6%, p & lt; 0,05, Fig 3 A y B).. Para las células SW480, se observó un nivel basal inferior de la proliferación (21,1% de células BrdU positivas). Los resultados para las células transfectadas con siRNA contra MCL-1, Bcl-2 y Bcl-x
L estaban en línea con los obtenidos para las células HT29. Una vez más, solamente MCL-1 desmontables condujo a un aumento significativo de la positividad BrdU, mientras que Bcl-2 y Bcl-x
L desmontables no mostró efectos significativos (MCL-1:25,6% vs. 21,1%, p & lt ; 0,05, Fig 3 C).. A fin de validar nuestros resultados sobre la proliferación después de siRNA transfección, seguimos el número de células totales de células SW480 lo largo del tiempo. Los resultados estuvieron en línea con los experimentos de BrdU: Sólo eliminación de MCL-1 dio lugar a un aumento de los recuentos de células totales, mientras que no se observaron cambios significativos de Bcl-2 y Bcl-x
L deleción (figura 3 D). . En conjunto, nuestros datos indican que no hay ningún efecto significativo de una caída de Bcl-2 y Bcl-x
L sobre la proliferación. Por el contrario, la falta de MCL-1 conduce a una mayor proliferación de puntero en las funciones específicas de MCL-1 en este contexto.
SW480 y células HT29 fueron transfectadas con siRNA contra MCL-1, Bcl-2 y Bcl x
L. 24 h después de la transfección, las células se pulsaron con 20 M de BrdU y se preparó para citometría de flujo. (A) flujo original Representante citometría de datos con células HT29 para positividad BrdU después de la tinción con anticuerpo anti-BrdU acoplado a PerCP-CY5.5 fluoróforo. (B) El flujo de los análisis de citometría de incorporación de BrdU en las células HT29 y SW480 (C). (D) número de células total de células SW480 después de desmontables de MCL-1, Bcl-2 y Bcl-x
L. Las células se sembraron en placas de 6 pocillos, se recogieron y se contaron 24, 48 y 72 h después de la transfección. Los valores se expresan como media ± desviación estándar. Ensayos se realizaron por triplicado (citometría de flujo) y sextuplicates (recuento de células). Los ensayos son representativos de al menos tres experimentos independientes. * P & lt;. 0,05
Desmontables de antiapoptótico Bcl-2 proteínas Massively deteriora migración de las células CRC
A continuación, el objetivo fue investigar los efectos de MCL-1, Bcl-2 y Bcl-x
L eliminación de la migración de las células de CRC. Con el fin de visualizar la migración celular, se realizaron ensayos de arañazos en monocapas de células HT29 y SW480 transfectadas. distancia de separación se midió cada 24 h después de desmontables de MCL-1, Bcl-2 y Bcl-x
L seguido de cálculo de reducción de distancias. reducción de distancias se desaceleró significativamente a la baja tanto en las células HT29 y SW480 después de la desmontables de MCL-1, Bcl-2 y Bcl-x
L (p-valores para HT29: siMcl-1: & lt; 0,001; siBcl-2: & lt ; 0001; siBcl-x
L: = 0,002 P-valores para SW480: siMcl-1:. = 0,0011; siBcl-2:. = 0,0005; siBcl-x
L: = 0,004) (Fig. 4 B y C, izquierda). En las células HT29 y SW480, se observó el efecto más llamativo después desmontables de Bcl-2. Aquí, la distancia de migración se redujo a 56% en SW480 y 36% en HT29 después de 72 h en comparación con los controles (Fig 4 A;. Fig. 4 B y C, izquierda). Tomados en conjunto, hemos demostrado efectos negativos de un MCL-1, Bcl-x
L-2 y Bcl caída sobre la CRC migración independiente de la inducción de la muerte celular y efectos antiproliferativos.
SW480 y células HT29 fueron transfectadas con siRNA contra MCL-1, Bcl-2 y Bcl-x
L y se hicieron crecer como una monocapa. distancia de separación se midió cada 200 micras a lo largo del borde de la reducción de distancias y la brecha calculada 24, 48 y 72 h después de la transfección. (A) Representante imágenes capturadas después de la caída de Bcl-2 en células HT29 (barra de escala indican aumento para todos los paneles). cinética (B) Gap de cierre de células HT29 después de la desmontables de MCL-1, Bcl-2 y Bcl-x
L (izquierda) y las correspondientes Western blots (derecha). cinética (C) Gap de cierre de las células SW480 después de la desmontables de MCL-1, Bcl-2 y Bcl-x
L (izquierda) y las correspondientes Western blots (derecha). Los ensayos son representativos de al menos tres experimentos independientes. Los valores se expresan como media ± desviación estándar. (valores de p para HT29: siMcl-1: & lt; 0,001; siBcl-2: & lt; 0,001; siBcl-x
L:. = 0,002 P-valores para SW480: siMcl-1: = 0,0011; siBcl -2: = 0,0005; siBcl-x
L:. = 0,004) guía empresas
La sobreexpresión de antiapoptótico Bcl-2 de proteínas acelera la migración de células CRC
Además, hemos probado si el aumento de expresión de MCL-1, Bcl-2 y Bcl-x
L en HT29 y las células SW480 influencias migración y potencialmente revierte el fenotipo de los experimentos desmontables. Una vez más, hemos realizado ensayos de cero y células usadas transfectadas con plásmidos de expresión de proteínas Bcl-2 correspondiente. Sorprendentemente, se observó una migración acelerada significativamente de las células SW480 que sobreexpresan Bcl-x
L y Bcl-2 (p & lt; 0,001, Fig 5 B, izquierda).. Las células que sobreexpresan Bcl-2 casi se duplicó la distancia migrada a las 72 h (999 micras frente a 526 micras en los controles, la Fig. 5 A). Para MCL-1 sobreexpresión de células SW480 se observó una, pero significativo incremento menor en la migración (p. & Lt; 0,01, Figura 5 B, izquierda). Estas observaciones también se hicieron para células HT29 con sobreexpresión de MCL-1, Bcl-2 o Bcl-x
L (datos no mostrados). Además, hubo un aumento de la proliferación no detectable en las células que sobreexpresan MCL-1, Bcl-2 o Bcl-x
L (datos no mostrados). En resumen, mostramos que antiapoptóticas Bcl-2 de proteínas son capaces de desencadenar la migración de las células de CRC.
células SW480 fueron transfectadas con plásmidos que expresan MCL-1 humano, Bcl-2 o Bcl-x
L y crecido como una monocapa. Las lagunas se generaron y reducción de distancias midieron como se describe. (A) imágenes representativas para las células SW480 que sobreexpresan Bcl-2 (barra de escala indica aumento para todos los paneles). (B) Gap cinética de cierre de células que sobreexpresan SW480 MCL-1, Bcl-2 y Bcl-x
L (izquierda) y transferencias de Western correspondiente (derecha). Los ensayos son representativos de al menos tres experimentos independientes. Los valores se expresan como media ± desviación estándar. los valores de p: Mcl-1: = 0,0006; Bcl-2: = 0,0002; Bcl-x
L:. & Lt; 0,0001
Desmontables de antiapoptóticos proteínas Bcl-2 Regular la invasividad de las células CRC
Para investigar más a fondo los efectos reguladores de MCL-1 , Bcl-x
L y la invasión Bcl-2 en los procesos relevantes para la CRC metástasis, también se evaluó de células CRC después de la manipulación de proteínas Bcl-2. Las células con borrada Bcl-x
L se alteró significativamente las propiedades invasivas en los ensayos de invasión cámara de Boyden en comparación con las células transfectadas burlarse (70% en comparación con los controles, p & lt; 0,05; Fig. 6 A y B). Lo más sorprendente, una caída de Bcl-2 abrogó casi por completo la capacidad de las células para invadir SW480 (38% en comparación con los controles, p & lt; 0,001). Además, MCL-1 desmontables también causó una profunda disminución de la invasión (37% en comparación con los controles, p & lt; 0,001; Fig. 6 A y B). Estas observaciones ponen de relieve el papel de antiapoptóticas Bcl-2 de proteínas para la migración y la invasión de células de CRC e identificar un papel prominente de la Bcl-2 en el contexto de la invasividad.
SW480 células se sembraron en placas de 6 pocillos y se transfectaron como descrito. 24 × 10
5 células fueron sembradas en la cámara superior de un transwell. 48 h después de la siembra, los núcleos en la superficie inferior se visualizaron mediante tinción con Hoechst. (A) Representante imágenes de la superficie inferior de inserción después de la tinción de Hoechst (barra de escala indica aumento para todos los paneles). (B) se contaron cinco campos de visión por plaquita. n = 5 por grupo. Los valores se expresan como media ± desviación estándar. Los ensayos son representativos de al menos tres experimentos independientes. ** P & lt; 0,01.