Extracto
Varias características biológicas únicas del VIH-1 VPR lo convierten en un agente potencialmente poderosa para la terapia contra el cáncer. En primer lugar, Vpr inhibe la proliferación celular por inducción de la detención del ciclo celular G2. En segundo lugar, induce la apoptosis a través de múltiples mecanismos, que podría ser significativo, ya que puede ser capaz de superar la resistencia de apoptosis exhibida por muchas células cancerosas, y, por último, Vpr selectivamente mata rápido crecimiento de las células de una manera independiente de p53. Para demostrar la utilidad potencial de la VPR como un agente anti-cáncer, llevamos a cabo estudios de prueba de concepto
in vitro
y
in vivo
. Los resultados de nuestros estudios preliminares demostraron que Vpr induce la detención del ciclo celular G2 y la apoptosis en una variedad de tipos de cáncer. Por otra parte, los mismos efectos de Vpr también podría ser detectada en algunas células cancerosas que son resistentes a fármacos contra el cáncer, tales como doxorrubicina (DOX). Para ilustrar aún más el valor potencial de Vpr en la inhibición del crecimiento tumoral, se adoptó un modelo de neuroblastoma DOX resistentes mediante la inyección de células SK-N-SH en ratones C57BL /6N y de los ratones C57BL /6J-scid /scid. La hipótesis de que Vpr es capaz de bloquear la proliferación celular e inducir la apoptosis independientemente del estado de resistencia a los medicamentos de los tumores. De hecho, la producción de VPR
a través de la entrega
adenoviral de células de neuroblastoma causó G2 detención y la apoptosis en las células ingenuas y DOX-resistentes a los fármacos. Además, pre-infección o la inyección intratumoral de
vpr
expresando partículas adenovirales en los tumores de neuroblastoma en ratones SCID el crecimiento del tumor marcadamente inhibida. Por lo tanto, Vpr, posiblemente, podría ser utilizado como un agente terapéutico viral suplementario para la inhibición selectiva del crecimiento del tumor en la terapia anti-cáncer, especialmente cuando otros tratamientos dejan de funcionar
Visto:. Zhao RY, Liang D, Li G, Larrimore CW , Mirkin BL (2010) Efecto anti-cáncer del VIH-1 proteína viral R en doxorrubicina neuroblastoma resistente. PLoS ONE 5 (7): e11466. doi: 10.1371 /journal.pone.0011466
Editor: Fatah Kashanchi, George Mason University, Estados Unidos de América
Recibido: 6 Mayo 2010; Aceptado: June 8, 2010; Publicado: 7 Julio 2010
Derechos de Autor © 2010 Zhao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado en parte por el Consejo de Investigación médica de Chicago, Departamento de Asistencia Pública y el Departamento de Servicios de Salud Humanos de Estados Unidos Illinois y la Universidad de Maryland Medical Center (a RYZ). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
a pesar de que se han producido grandes avances en el tratamiento del cáncer durante las últimas décadas, todavía existe una serie de importantes obstáculos que limitan el uso de algunas de estas nuevas terapias. Los obstáculos que se presentan incluyen, pero no se limitan a, 1) sirven de efectos secundarios debido a la citotoxicidad no específica de las terapias, 2) el desarrollo de resistencia a los medicamentos, y 3) el desarrollo de la resistencia del tumor a la apoptosis. Por lo tanto, cualquier agente anti-cáncer que se podrían evitar o anular las deficiencias de algunos de los actuales tratamientos contra el cáncer sería de gran importancia para el futuro diseño de la terapia contra el cáncer. Idealmente, un agente eficaz contra el cáncer debería tener las siguientes propiedades. Debe ser capaz de solamente la proliferación celular anormal 1) bloque que resulta de la pérdida de la regulación del ciclo celular normal, por ejemplo, mutaciones de punto de control celular; 2) inducir la detención del ciclo celular sostenido que podría conducir a la muerte celular o apoptosis; 3) inducir la celda específica de matar a las células cancerosas con un mínimo o ningún efecto sobre las células normales; 4) ser capaz de anular la resistencia a la apoptosis, una característica típica de muchas células cancerosas; 5) tener la célula efecto independiente de mutaciones oncogénicas comunes, tales como p53 matar; 6) confieren el mismo detención y celular efectos en las células resistentes a los fármacos, matar es decir, cuando falla otro fármaco quimioterapéutico; y 7) fácilmente absorbida o secretada por las células en su forma bioactiva originales.
La proteína viral R (VPR) hecha por el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) potencialmente podrían cumplir con muchos de los criterios antes mencionados. Porque, 1) Vpr bloquea la proliferación de células cancerosas mediante la inducción de la detención del ciclo celular G2 [1], [2], y este efecto es independiente de la detención de los puestos de control de ADN clásicos [3], [4]; 2) Vpr induce la apoptosis a través de múltiples vías que no dependen de las respuestas celulares huésped [5], [6]; y 3) Vpr selectivamente mata rápido crecimiento de las células de una manera independiente de p53 [7], [8], lo que sugiere muerte celular inducida por Vpr puede ofrecer más potencia de forma selectiva en la eliminación de células cancerosas de las células normales y esta propiedad citotóxica debe ser eficaz en muchos de los tipos de cáncer, en el que se muta el gen p53. 4) VPR en sí no es infecciosa; 5) Vpr es una proteína soluble que también se transduce de forma natural. capacidad tranducing natural de la proteína permite que sea tomada hasta y secretada por las células sin la ayuda de cualquier vehículo de entrega especial [9]; y 6) Vpr es una proteína asociada con el virión. Esto permite que sea posible la entrega de la proteína Vpr para apuntar tumores específicos, tales como neuroblastoma o glioma usando vectores virales diseñados especialmente [Para una revisión, véase [10]].
VIH-1 Vpr es una proteína viral accesorio pequeño con una longitud media de 96 aminoácidos y un peso molecular calculado de 12,7 kD. Vpr es una proteína única que no muestra homología conocida a cualquier otras proteínas celulares actuales. Una estructura terciaria de Vpr propuesto sobre la base de análisis de RMN se compone de un dominio de α-hélice-giro-α-hélice en el medio amino-terminal entre los aminoácidos 17 a 46 y un largo α-hélice de los aminoácidos 53 a 78 en la mitad carboxilo-terminal [11]. Estos tres alfa-hélices se doblan alrededor de un núcleo hidrófobo en una estructura que permite la interacción entre Vpr y otras proteínas celulares diferentes [12]. Las interacciones entre las proteínas celulares VPR y subrayan los papeles multifacéticos en su interferencia con las funciones celulares del huésped como se describe anteriormente [Para una revisión, ver [8], [13], [14]].
Uno de los más difíciles para el tratamiento de cánceres es el neuroblastoma. Este sarcoma mortal consiste en células malignas neuroblastos que, o bien aparece en el sistema nervioso autónomo o en la médula adrenal. El neuroblastoma es considerado como un tipo de tumor neuroepitelial que afecta principalmente a los bebés y niños de hasta 10 años de edad. Es uno de los tumores sólidos más comunes de la primera infancia. El tumor se origina típicamente en la médula suprarrenal, con el sitio más común es el abdomen (cerca de la glándula suprarrenal), pero también puede ser encontrado en la piel, el pecho, el cuello, la pelvis u otras áreas. Si bien se entiende que las mutaciones genéticas, ya sea durante el desarrollo fetal o aquellos que han sido heredados de plomo para el neuroblastoma, la causa exacta de estas mutaciones genéticas son todavía desconocidos. Las opciones de tratamiento que están disponibles incluyen principalmente la cirugía, la quimioterapia, la radioterapia, y trasplantes de médula ósea. Sin embargo, a pesar de diversas opciones de tratamiento, la morbilidad de este tipo de cáncer es todavía muy alta y se encuentra actualmente cerca del 100%. La razón principal de tan alta morbilidad se debe a que la mayoría de los pacientes tienen enfermedad muy extendida en el diagnóstico y estos tumores se desarrollan rápida resistencia a la quimioterapia y la radioterapia.
Un enfoque principal para el tratamiento del cáncer a menudo implica la quimioterapia. La quimioterapia actúa matando las células de rápida divididas, lo cual es una característica principal de las células cancerosas. Desafortunadamente, neuroblastoma desarrolla resistencia rápidamente a los agentes de quimioterapia y hace que el tratamiento difícil. Hay varias razones posibles para la resistencia a la quimioterapia, que se compone de 1) las células que no son matados por la quimioterapia muten y se vuelvan resistentes, 2) las proteínas que transportan la droga en las células cancerosas dejan de funcionar, 3) las células pueden comenzar a bombear las drogas fuera de la célula como rápido, ya que pueden entrar en la célula, 4) los genes que desencadenan una sobreproducción de proteínas que hacen que un medicamento ineficaz puede llegar a ser amplificada, y 5) las células cancerosas pueden comenzar a reparar roturas en el ADN causados por el tratamiento. Teniendo en cuenta la rápida resistencia a los medicamentos de neuroblastoma y un número limitado de fármacos actualmente disponibles para el tratamiento de neuroblastoma, hay una gran necesidad de una nueva terapia que podría continuar eliminando las células malignas cuando esas células desarrollaron resistencia a otros medicamentos contra el cáncer. Una posible nueva solución a este dilema es el uso potencial del VIH-1 VPR con sus características biológicas únicas descritas anteriormente.
Para demostrar la utilidad potencial de VPR como un agente anti-cáncer, hemos llevado a cabo prueba- de concepto estudios preliminares
in vitro Opiniones y
in vivo
. Los resultados de nuestros estudios mostraron que la Vpr induce la detención del ciclo celular G2 y la apoptosis en una gran variedad de tipos de cáncer. Hemos demostrado, además, que los mismos efectos de Vpr también se pueden detectar en las células cancerosas que son resistentes a fármacos contra el cáncer tales como DOX. Por otra parte, hemos adoptado un sistema modelo de neuroblastoma de ratón que nos permite mostrar el efecto supresor de VPR sobre el crecimiento tumoral
in vivo
.
Resultados
VPR induce G2 del ciclo celular detención en diversas células cancerosas
Vpr se ha observado para inducir la detención en G2 del ciclo celular en una amplia variedad de células eucariotas que van desde la levadura de fisión a las células humanas [15], [16]. Estas observaciones sugieren que las actividades celulares altamente conservadas en las células eucariotas son de hecho afectados por VPR. En este estudio, se seleccionó el sistema de infección adenoviral para medir el efecto potencial del VIH-1 en la inducción G2 del ciclo celular en diversos tipos de cáncer (Tabla 1) como se describió anteriormente [17] - [19]. Los sistemas de adenovirus permite a casi el 100% de las células infectadas por ser la transducción y la detección de los efectos de Vpr son capaces de ser observado ya en 5 horas [18]. Utilizando este sistema, hemos probado el efecto potencial de VPR en varios tipos de líneas celulares de cáncer. Estos tipos de cáncer incluyen cervical (HeLa), mama (MCF-7), de ovario (A2780), y T o los linfomas de células B (Jurkat y SU-DHL-4). Como se muestra en la Figura 1 y la Tabla 1, Vpr induce la detención G2 del ciclo celular en todos los tipos celulares de cáncer de prueba con la excepción de que sólo se observó cambio G2 parcial en las células MCF-7 (Figura 1 - medio). La relevancia funcional de esta inducción G2 parcial se conjeturó en discusión. Además, esta inducción G2 parece ser independiente de la condición de gen p53, que es coherente con un número de informes anteriores [7], [20]
Todas las líneas celulares de cáncer (véase la Tabla 1 para los detalles;. Únicamente 3 líneas de células se muestran aquí como ejemplos) se cultivaron como se describe en los Materiales y Métodos. Las células fueron transducidas con ADV o Adv-VPR con MOI de 1,0. Las células se recogieron 48 horas post-infección (
p.i.
), las células se prepararon entonces tal como se describe en Materiales y Métodos. contenido de ADN celular se analizó mediante citometría de flujo FACScan (Becton Dickinson) como se describió anteriormente [4], [19]. Los perfiles del ciclo celular se modelaron usando el software ModFit (Verity Software House, Inc.).
VPR induce la detención del ciclo celular y la muerte celular G2 independientemente del estado de resistencia a los medicamentos a la doxorrubicina
doxorrubicina (Adriamycin, hidroxidaunorrubicina, DOX) es un fármaco contra el cáncer que se ha utilizado en el tratamiento de una amplia gama de tipos de cáncer, incluyendo cáncer de mama, de estómago, de pulmón, de ovario y cánceres de la vejiga, así como la leucemia, muchos tipos de carcinoma, y los tejidos blandos sarcomas. El mecanismo molecular preciso de DOX no ha sido bien establecida. Sin embargo, se conoce intercalar ADN e interrumpir la replicación del ADN lo que conduce a la muerte celular [21]. A pesar de que DOX sigue siendo un componente esencial de primera línea terapias contra el cáncer en el tratamiento de muchos tipos de tumores, el desarrollo de drogas tumor resistente a DOX y otros regímenes anticancerosos es un obstáculo importante para la consecución de éxito los tratamientos contra el cáncer [22], [23]. Para explorar si VPR puede bloquear la proliferación celular mediante la detención en G2 y matar a las células tumorales resistentes a los medicamentos contra el cáncer, expresamos el
gen vpr
a través de
transducción ADV-VPR en tres pares de drogas naïve (WT) y las células de cáncer de DOX-resistente (DOX-R). Son neuroblastoma humano (SK-N-SH), osteosarcoma (SAOS2), y el adenocarcinoma de mama (MCF-7). Estas líneas celulares DOX resistentes se generaron por incubación continua de líneas de células parentales con paso a paso aumentos de las concentraciones de DOX que van desde 10
-9 a 10
-6 M durante un período de 3 a 6 meses. método detallado para la generación de estas líneas celulares DOX resistentes se han descrito anteriormente [24]. Como se muestra en la Tabla 1, la expresión de Vpr causa la detención del crecimiento celular en todas las células ensayadas, independientemente del estado resistente a los medicamentos para DOX. Por otra parte, la medición de la proliferación celular y la viabilidad por el ensayo MTT, que metaboliza la sal de tetrazolio (MTT), mostró proliferación de células poco o células viables izquierda 5 días después de la transducción ADV-Vpr (Figura 2); Del mismo modo, la determinación de la integridad de la membrana celular por el azul de tripán, que tiñe únicamente células muertas, indicó que Vpr confiere muy potente citotoxicidad a las células (Figura 2).
Tres pares de drogas naïve (WT) y DOX resistentes se ensayaron células de cáncer (DOX-R) para la detención Vpr inducida G2 (Tabla 1) y la muerte celular. Estas líneas celulares de cáncer se hicieron crecer como se describe en los Materiales y Métodos. Las células fueron transducidas con ADV o Adv-VPR con MOI de 2,5. Se determinó la viabilidad celular, ya sea por el ensayo de exclusión de azul de tripano, que identifica las células muertas (figura superior) o por el ensayo MTT para medir la supervivencia celular (figura inferior). Se examinaron las células 5 días
p.i
intials:. WT, de tipo salvaje; Dox-R, doxorrubicina resistentes; 1, Cuello; 2, 3 y Adv, Adv-VPR.
VPR induce la muerte celular dependiente de la dosis y la apoptosis en células de neuroblastoma DOX-naïve y resistentes
Para comprender mejor la muerte celular inducida por VPR en las células tumorales resistentes ingenuo y drogas y para prepararse para un
in vivo
estudio del efecto del potencial VPR sobre el crecimiento tumoral en un modelo de ratón, decidimos enfocar nuestro esfuerzo estudio sobre el neuroblastoma. Neuroblastoma fue elegido como un sistema modelo, ya que el neuroblastoma es uno de los tumores sólidos más comunes de la primera infancia que normalmente se encuentran en los bebés o niños pequeños. Otra razón para elegir el modelo de neuroblastoma es que el sistema de xenoinjerto modelo murino de neuroblastoma humano está bien establecida [25], [26].
Antes de la realización de
in vivo
estudios con ratones, se determinó en primer lugar el respuestas potenciales dependientes de la dosis de la muerte celular inducida por Vpr en tanto de tipo salvaje (WT) y el fármaco células resistentes (DOX-R) SK-N-SH de neuroblastoma. El azul de tripano y los ensayos de MTT se utilizaron para medir la proliferación celular y la viabilidad 5 días después del control Adv y transducciones Adv-Vpr. Resumen de los resultados se muestran en la Figura 3A-a. Si bien el aumento de la multiplicidad de la infectividad (MOI) de control de Adv no causó una muerte celular significativa, a la muerte celular dependiente de la dosis clara se muestra tanto en las células WT y DOX-R como se indica por el ensayo de azul de tripano. Al extremo inferior, MOI 1.0 causó alrededor de un 40-80% de muerte celular; mientras que todas las células (100%) fueron asesinados por MOI 10.0. El ensayo MTT mostró la disminución dependiente de la dosis correspondiente de la proliferación celular y la supervivencia de las células, y los análisis de transferencia de Western confirmó que Vpr se produjo en las células infectadas-Adv-Vpr (Figura 3A-B). Para entender mejor la dinámica de efecto de Vpr en la proliferación celular, la proliferación celular y la viabilidad se midió con el tiempo (hasta 5 días) con MOI 2,5. Como se muestra en la Figura 3B, las células simuladas o infectados por Adv mostraron proliferación celular normal y alcanzaron una meseta después de 3 días con proliferación de poca o ninguna célula detectada en las células infectadas Adv-Vpr. La actividad metabólica reducida con el tiempo sugirió que aumentó la muerte celular en el tiempo. Para evaluar más a fondo el modo de muerte celular inducida por Vpr en células de neuroblastoma (sea o no Vpr mata a las células por apoptosis u otro mecanismo) potencial efecto de escisión de caspasa-3 se midió como una indicación de la apoptosis. Para distinguir la muerte celular Vpr inducida de su efecto sobre el ciclo celular, un mutante de Vpr (F34I) que causa la inducción G2 pero no induce la muerte celular también se incluyó en este estudio como control [18], [27], [28] . Después de la infección adenoviral, el estado de la caspasa-3 se controló a partir de 6 a 36 horas mediante análisis de transferencia de Western usando anticuerpos contra el total de la caspasa-3 (Figura 3C, la parte superior del carril) o específicamente exfoliados caspasa-3 (Figura 3C - carril central). No caspasa-3 escisión se detectó en las células infectadas con Vpr Adv-F34I (indicado por "m") durante todo el período de prueba; la escisión de la caspasa-3 se observa claramente a partir de 24-36 horas en las células que fueron infectadas con el tipo salvaje (indicado por "w") VPR.
A. VPR induce la muerte celular dependiente de la dosis en las células SK-N-SH-drogas no tratados previamente y resistentes. a. Nivel de la muerte celular inducida por Vpr se examinó mediante la infección de células SK-N-SH-DOX ingenuos y resistente utilizando el aumento de MOI de Adv o virus Adv-Vpr. La muerte celular se midió mediante la determinación de la integridad y la proliferación de la membrana celular utilizando esfuerzo Trypan azul (izquierda) o la viabilidad celular mediante el ensayo de MTT (derecha). Proliferación de las células y la viabilidad se examinaron 5 días
p.i
. segundo. la producción de proteínas Vpr se confirmó por análisis de transferencia Western. Tenga en cuenta que es muy difícil de detectar la proteína Vpr a baja MOI. La infección ha de Adv-VPR fue verificada por núcleos grandes de células como se informó anteriormente [43]. B. Vpr induce la muerte celular en el tiempo de las drogas células SK-N-SH no tratados previamente y resistentes. Tanto las células SK-N-SH fármaco-resistentes no tratados previamente y tratados de la misma manera como A. Sólo MOI2.5 se utiliza aquí. C. Vpr induce la apoptosis en las células SK-N-SH y resistente naïve con las drogas. Caspasa-3 división se controló hasta 36 horas. Iniciales: CSP3, caspasa-3; cl-CSP3, exfoliados caspasa-3; m, Adv-VprF34I; w, Adv-VPR.
En conjunto, los resultados de estos
in vitro
estudios apoyan la idea de que la proliferación de células de neuroblastoma VPR bloques en virtud de detención G2 del ciclo celular y muerte celular
a través
apoptosis. Más importante aún, VPR confiere estos efectos citotóxicos a células de neuroblastoma a un nivel comparable con independencia de su estado de resistencia a los medicamentos.
En vivo
efecto de VPR en el crecimiento del tumor neuroblastoma en un sistema de modelo de ratón
a continuación examinó el efecto VPR sobre el crecimiento tumoral de células de neuroblastoma en el C57-SCID sistema de modelo de ratón [29], [30]. Dos enfoques diferentes fueron usados para introducir Vpr en los tumores, es decir, la transducción viral pre previo a la celda de la inoculación en ratones o inyección post-intratumoral. Para pre-transducción, de tipo salvaje y DOX resistentes SK-N-SH fueron inyectados con Adj, adv VprF34I y Adv-VPR
s.c..
En el flanco izquierdo de los ratones SCID-C57. El tamaño del tumor se midió cada 7 días. medición final era el tamaño del tumor a los 26 días después de la transducción y los ratones se sacrificaron para el análisis adicional. Como se muestra en la figura 4A, un tamaño medio de tumor de aprox. 2 cm se observó claramente en ratones que fueron inoculados con células SK-N-SH WT o DOX resistentes a 26 días después de la transducción. tamaños tumorales similares se observaron en los ratones infectados Ad-F34Ivpr. Por el contrario, se observaron muy pequeños nódulos en el sitio de la inyección en los ratones transducidas con Ad-Vpr, lo que sugiere la expresión de Vpr en esas células impedido su crecimiento en ratones C57-SCID. Para minimizar la variación potencial de ratones individuales, los ratones individuales fueron inyectados con los tres virus de transducción
s.c..
En la zona abdominal, como se muestra en la Figura 4B. De manera similar a lo que hemos observado en los ratones inoculados con un solo tratamiento, aproximadamente el mismo tamaño de los tumores fueron vistos en los sitios de Adv Adv-o F34Ivpr inyecciones, mientras que poco o sin nódulos fueron vistos en los sitios de inyecciones Adv-VPR.
supresión del crecimiento del tumor neuroblastoma por Vpr se demuestra aquí, ya sea por pre-transducción de Adv-Vpr (AB) o después de la inyección intratumoral-(C). Para pre-transducción, tipo salvaje (WT) o DOX resistentes SK-N-SH se cultivaron en DMEM suplementado con FBS al 10% a 37 ° C con un 95% de aire /5% de CO
2 atmósfera. células frescas se cultivaron primero en una placa de 12 pocillos durante 36 horas y la transducción adenoviral se llevó a cabo 5 horas antes de la inoculación de células con MOI de 2,5, que se determinó empíricamente. Las células se trataron luego con Trpsin- EDTA, resuspendió en DMEM y se lavó con PBS 3 veces. células finales se suspendieron en DMEM para la inoculación. Aproximadamente el 2 × 10
se inyectaron 6 células en el volumen de 100 l
s.c..
En el flanco izquierdo de los ratones SCID-C57. Se inyectaron 3-4 ratones para cada tratamiento. Estos grupos de tratamiento incluyen un control viral Adv, Adv-VPR y Adv-F34IVpr. Se utilizó el mutante F34IVpr aquí como un control desde un solo cambio de aminoácido de ácido amino 34 de fenilalanina (F) a isoleucina (I) hace que Vpr incapaz de causar la apoptosis (Figura 3C), pero permite el ciclo celular para entrar en un G2 prolongada fase [18], [27], [28]. El tamaño del tumor se midió cada 7 días mediante la medición de dos diámetros perpendiculares del tumor usando calibres. medición tumor final fue a los 26 días después de la transducción y los ratones se sacrificaron para el análisis adicional. Para la inyección intra-lesional de Vpr, el WT y células de neuroblastoma SK-N-SH DOX-R se prepararon esencialmente de la misma manera como se describió anteriormente. 200 l de la Adv, Adv-Vpr o Adv-F34Ivpr fue entonces inyectaron discretamente 3 veces en los tumores de 2 semanas después de la inoculación de células con una concentración viral de 1.012 /ml. El tamaño del tumor se midió cada 7 días. medición final del tamaño del tumor fue a los 39 días después de la inyección y los ratones se sacrificaron para el análisis adicional. Tres experimentos independientes se llevaron a cabo y los resultados de estos experimentos con el tamaño medio de los tumores con una desviación estándar (SD) se presentan en la Tabla 2.
Uno de los posibles argumentos sobre los resultados generados a partir de pre-transducción es que la expresión de Vpr
in situ
podría matar rápidamente las células SK-N-SH, evitando así la formación de tumores y por lo tanto la prueba del efecto sobre el crecimiento tumoral Vpr real. Para sortear este problema, se utilizó un método de inyección intratumoral post-alternativa. Se prepararon las células de neuroblastoma SK-N-SH WT y DOX-R y se inocularon esencialmente de la misma manera como se describió anteriormente. El Adj, adv Vpr o Adv-F34Ivpr continuación, se inyectó discretamente 3 veces en los tumores de 2 semanas después de la inoculación de células. El tamaño del tumor se midió cada 7 días. medición final del tamaño del tumor fue a los 39 días después de la inyección y los ratones se sacrificaron para el análisis adicional. pruebas estadísticas se llevaron a cabo para evaluar las diferencias potenciales en el tamaño del tumor cada semana o durante todo el período experimental. Los resultados finales se presentan en la Tabla 2. A pesar de que VPR redujo de 44,1 ± 11,8% del crecimiento del tumor en el tipo salvaje tumores SK-N-SH en la semana 1 después de la inyección intratumoral, los análisis estadísticos indicaron un
t CD - valor de 2,35 (p = 0,10), es decir, no hay diferencia estadística; de manera similar, no hay diferencia crecimiento del tumor se observó en los tumores Dox-R en la semana 1. Sin embargo, se observaron diferencias significativas estadística tanto en los tumores de tipo salvaje y Dox-R por semana 2 y semana 3. En particular, en las células de neuroblastoma WT , VPR redujo el 64,2 ± 6,7% o 76,4 ± 5,9% del crecimiento del tumor en la semana 2 o 3 después de la inyección intratumoral, respectivamente; Del mismo modo, un porcentaje comparable de reducción (67,1 ± 4,5% o 75,6 ± 1,8%) también se detectó en las células DOX-R en el mismo período de tiempo. La comparación de la el crecimiento del tumor durante todo el período experimental mediante el uso de las cantidades promedio ponderado [31] sugirió diferencias generales en el crecimiento del tumor entre los ratones de control tratados con Ad y Ad-Vpr inyecta ratones (p & lt; 0,05). Por el contrario, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre el control y los grupos de anuncios Ad-F34IVpr. Por lo tanto, es evidente que la expresión de Vpr en los tumores ha reducido significativamente el crecimiento del tumor y la expresión de Vpr de hecho suprime el crecimiento del tumor de células de neuroblastoma humano, independientemente de su estado resistente a los medicamentos.
Discusión
en el presente estudio, hemos demostrado que una proteína viral Vpr bloquea la proliferación de células de VIH-1 por la detención de las células en la fase G2 del ciclo celular en tipos diferentes de células de cáncer probadas (Tabla 1; Figura 1). Además, Vpr induce la muerte celular en tres de las líneas celulares de cáncer, independientemente de si son resistentes o sensibles a DOX (Figura 2). Otros análisis del efecto Vpr en células de neuroblastoma indicaron que Vpr induce la muerte celular de una manera dependiente de la dosis (Figura 3A-B)
vía
apoptosis como se indica por la caspasa-3 escisión (Figura 3C). Mediante el uso de un modelo de neuroblastoma de ratón, hemos demostrado además que la entrega de Vpr
vía
entrega adenoviral a los tumores de neuroblastoma, ya sea por pre-infección (Figura 4A-B) y la inyección intratumoral (Figura 4C), tumor marcadamente inhibida crecimiento. Así, los resultados descritos demuestran de una prueba de concepto que VPR podría ser un buen candidato para una mayor investigación sobre su papel en la supresión de tumores, especialmente en aquellos que son resistentes a los medicamentos contra el cáncer.
A pesar de que Vpr induce G2 del ciclo celular arresto en todos los tipos de células de cáncer de prueba, se observó que el nivel de células detenidas G2 en la línea celular de cáncer de mama MCF-7 se redujo mucho (Figura 1 - medio). No está claro en este momento qué esta línea celular es parcialmente resistente a la detención en G2 inducida por VPR. Sin embargo, no parece haber una correlación interesante entre la detención G2 VPR inducida y el estado enzimática de la proteína fosfatasa 2A (PP2A). Como hemos informado anteriormente, una de las características únicas de detención en G2 inducida por Vpr es que requiere la función de PP2A [2], [4], [16], [32]. Búsqueda de la literatura indica que la subunidad reguladora de PP2A o bien se reduce o se pierde significativamente en la línea celular MCF-7 [33], [34]. La reducción de la detención en G2 en células MCF-7 apoya la noción de que Vpr inhibe la proliferación celular por inducción de la detención G2 a través de un mecanismo de PP2A mediada por [4], [32]. Además, esta observación sugiere que Vpr puede no ser capaz de bloquear la proliferación celular mediante la detención en G2 en todas las células tumorales, especialmente las células tumorales que contienen mutaciones relacionadas PP2A. La investigación adicional de este concepto es, sin duda justificada sobre todo en el contexto de la utilización de VPR como un agente anti-cáncer.
VPR induce la muerte celular y la apoptosis a través de múltiples mecanismos [Para una revisión, ver [5], [6]] . Desde Vpr es capaz de inducir la muerte celular y apoptosis en células de neuroblastoma DOX-naïve y resistentes, una o algunas de esas vías de Vpr propuestas puede haber causado la citotoxicidad observada. Nuestro esfuerzo futuro se centrará en las pruebas que mecanismo de la muerte celular inducida por VPR podría superar la resistencia a la apoptosis, una característica típica de muchas células cancerosas, incluyendo el neuroblastoma. Basándose en los datos mostrados en la Figura 3C, es evidente que Vpr es capaz de causar la apoptosis como se indica por la escisión de la caspasa-3. Esta observación es consistente con nuestra caracterización de la apoptosis inducida por Vpr en las mismas células de neuroblastoma que se muestran usando el ensayo Anexo V [35]. Hay, hemos demostrado, además, que la apoptosis en las células de neuroblastoma SK-N-SH Vpr inducida a través de un mecanismo mediado por la caspasa-9 mitocondrias-dependiente y [35].
utilizado pre-infección y intra- inyecciones tumorales en nuestro modelo de ratón para la introducción de Vpr en los tumores de neuroblastoma. Estos dos métodos se utilizaron porque la expresión de Vpr
In situ
podría matar a las células rápidamente y así evitar que las pruebas sobre el crecimiento tumoral real. Nuestros resultados demostraron ambos métodos reducido significativamente el crecimiento del tumor después de la introducción de la VPR. Comparativamente, las células DOX-resistentes también demostraron nivel similar de reducción del tamaño del tumor apoyar la premisa de que la expresión de Vpr suprime el crecimiento tumoral sin importar el estado resistente a los medicamentos.
Vale la pena mencionar que, en los experimentos descritos, no lo hicimos probar el efecto potencial de Vpr en células de neuroblastoma metastáticas. Lo hicimos, sin embargo, llevar a cabo estudios farmacológicos preliminares para probar posibles efectos adversos de los ratones SCID-C57 cuando fueron expuestos a VPR través de la inyección de cuerpo completo sistemática. En estos experimentos, un aumento cada vez mayor de partículas virales Adv-VPR que van de 1 × 10
13 a la 6 × 10
13 de partículas virales se inyectaron en ratones SCID-C57 través de venas de la cola. No se observaron reacciones adversas evidentes en los ratones durante todo el período experimental. exámenes patológicos de diversos órganos 3 semanas después de la inyección viral no mostraron claros efectos citotóxicos impuestas por Vpr (datos no mostrados). Por lo tanto, la introducción sistemática de VPR también podría ser una opción para pruebas futuras.
El concepto de usar el VIH-1 VPR como agente anticancerígeno potencial no es nuevo. De hecho, otros estudios iniciales incluyendo el nuestro han sugerido esta posibilidad [36] y una serie de estudios han mostrado que la entrega de Vpr a diversos tumores tales como melanoma [37] - [39], hepatoma [40], [41] y orales cáncer [42] suprimir el crecimiento tumoral
in vivo
. Lo que es nuevo, sin embargo, es que hemos demostrado por primera vez que VPR es capaz de suprimir el crecimiento tumoral, independientemente de si es sensible o resistente a un medicamento contra el cáncer a través de la inducción de la detención en G2 del ciclo celular y la apoptosis. Este hallazgo podría potencialmente ser significativa debido a la destrucción de las células cancerosas resistentes a los fármacos hace que sea un agente potencial y potente nuevo y alternativo anti-cáncer. Este tipo de agente contra el cáncer puede ser particularmente útil como agente terapéutico viral suplementario para la inhibición selectiva del crecimiento del tumor, especialmente cuando otros tratamientos fallan.
Materiales y Métodos
líneas y cultivo de células
Varias líneas celulares de cáncer humano que representan diferentes tipos de cáncer, con o sin resistencia a los medicamentos a la doxorrubicina, un medicamento contra el cáncer (DOX) se utilizan en este estudio y se resumen en la Tabla 1. a menos que se especifique específicamente, estas líneas celulares se cultivaron en la Dulbecco Modificado medio de eagle (DMEM) (Cellgro) o RPMI 1640 (Sigma) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS, Invitrogen). La incubación se realizó a 37 ° C en un 5% de CO
2 incubadora.
infección por adenovirus
vector adenoviral (Adv) y el vector adenoviral insertada con el
vpr gen
(Adv-VPR) fueron amablemente proporcionados por el Dr. Zhao LJ [17]. Aproximadamente 1 × 10
6 de las células de ensayo se infectaron con el virus o Adv Adv-VPR. Cuarenta y ocho horas
p.i.
, Las células se recogieron para el análisis del ciclo celular o análisis de transferencia Western. Las infecciones se llevaron a cabo a una multiplicidad de infección (MOI) de 1,0 para los análisis del ciclo celular como se muestra en la Tabla 1 y Fig. 1. MOI de 2,5 se utilizó para la muerte celular inicial los análisis como se muestra en la Fig. 2. Bajo esta condición de transducción adenoviral, eficiencia de infección mayor que 90% se alcanza con estas reservas de virus (datos no mostrados).
ciclo celular análisis
Las células se recogieron 48 horas