Rata
Extracto
Objetivo
Para evaluar la fiabilidad de imágenes por resonancia magnética (MRI ) para la detección de cáncer de esófago en el modelo de LEVRAT esofagoyeyunostomía de extremo a lado.
Antecedentes
el modelo LEVRAT ha demostrado utilidad en términos de su capacidad para replicar la carcinogénesis de Barrett mediante la inducción de reflujo gastroduodenoesophageal (GDER). Debido a la falta de datos sobre la utilidad de los métodos no invasivos para la detección de cáncer de esófago, estudios de eficacia del tratamiento han sido limitados, como la histología de adenocarcinoma sólo ha sido validado post mortem. Por tanto, sería de gran valor si la validez y la fiabilidad de la RM podrían establecerse en este entorno.
Métodos
reflujo GDER crónica se indujo en 19 ratas macho Sprague-Dawley utilizando el LEVRAT modificado modelo. A las 40 semanas después de la cirugía, todos los animales fueron sometidos a endoscopia, resonancia magnética, y el análisis histológico post-mortem del esófago y la anastomosis. Con la histología post-mortem que sirve como el estándar de oro, la evaluación de la presencia de cáncer de esófago fue hecha por cinco especialistas esofágicas y cinco radiólogos en la endoscopia y la RM, respectivamente.
Resultados
La precisión de la RM y análisis endoscópica para identificar correctamente el cáncer vs. ningún cáncer fue 85,3% y 50,5%, respectivamente. Las curvas ROC demostrado que la calificación de la RM tuvo una AUC de 0,966 (
p Hotel & lt; 0,001) y la calificación endoscopia tenido una AUC de 0,534 (
p = 0,804
). La sensibilidad y especificidad de la RM para identificar el cáncer vs. no-cáncer fue 89,1% y 80% respectivamente, en comparación con 45,5% y 57,5% para la endoscopia. tasas de falsos positivos de resonancia magnética y endoscopia fueron de 20% y 42,5%, respectivamente.
Conclusiones
La resonancia magnética es un método de diagnóstico más fiable que la endoscopia en el modelo LEVRAT. El carácter no invasivo de la herramienta y su potencial para cuantificar volumétricamente el tamaño y el número de tumores probable que lo hace aún más útil en la evaluación de nuevos fármacos y su eficacia en estudios de tratamiento del cáncer de esófago
Visto:. Kosovec JE, Zaidi AH, Y Komatsu, Kasi PM, Cothron K, Thompson DV, et al. (2014) El establecimiento de Imágenes por Resonancia Magnética como una herramienta preciso y fiable para diagnosticar y controlar el cáncer de esófago en un modelo de rata. PLoS ONE 9 (4): e93694. doi: 10.1371 /journal.pone.0093694
Editor: Helge Bruns, Hospital de la Universidad de Heidelberg, Alemania |
Recibido: 6 de diciembre de 2013; Aceptado: March 8, 2014; Publicado: 4 Abril 2014
Derechos de Autor © 2014 Kosovec et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por el oro de David e Irene Blumenkranz. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
las opciones de tratamiento para los pacientes con adenocarcinoma de esófago (EAC) están actualmente limitados y complican por el hecho de que la mayoría de los pacientes se presentan con enfermedad en estadio avanzado [1] - [3]. Además, la prevalencia de adenocarcinoma de esófago sigue aumentando en los Estados Unidos, y la tasa de supervivencia de cinco años es sólo el 15% [4]. Por lo tanto, se ha vuelto cada vez más relevante para probar nuevas técnicas y nuevos agentes para prevenir y tratar EAC mediante la implementación de modelos integrales de traducción. El modelo quirúrgico de extremo a lado anastomosis esofagoyeyunal en ratas (modelo LEVRAT modificado) induce reflujo gastroduodenoesophageal crónica (GDER) y expone el esófago al ácido gástrico y la bilis para iniciar la progresión de la enfermedad [5] - [10]. El modelo ha sido validado LEVRAT replicar con eficacia la misma progresión longitudinal de la enfermedad por reflujo gastroesofágico (ERGE) para el esófago de Barrett (EB) de EAC que se observa en los seres humanos [11], [12]. Además, el modelo es muy eficiente, ya que se ha demostrado que aproximadamente el 70% de las ratas desarrollar EAC por 28 semanas después de la cirugía [13].
Estudios anteriores han demostrado la utilidad de este modelo para determinar la eficacia de agentes preventivos contra la progresión de la enfermedad, pero el potencial para su uso como un modelo de tratamiento ha sido limitado por la incapacidad de diagnosticar de forma fiable la patología antes de la muerte [13], [14]. El análisis visual endoscópica se ha utilizado como una herramienta para el seguimiento de la historia natural de la enfermedad [15], con biopsia permitiendo el análisis de marcadores moleculares evitando al mismo tiempo el sacrificio de animales [16] - [18]; sin embargo, debido al modelo de limitación inherente de la presentación extra-luminal de la mayoría de los tumores, así como la baja precisión de biopsias endoscópicas, histología adenocarcinoma sólo se ha validado post-mortem [15].
Alternativa técnicas de imagen como la exploración micro-PET se han explorado en un intento de resolver este problema; sin embargo, ninguna técnica ha demostrado significativamente sensible y específica en comparación con el estándar de oro de la histología [19]. Recientemente, la resonancia magnética (MRI) ha sido utilizado con éxito como método de formación de imágenes no invasiva en modelos animales de mama y cáncer de hígado [20] - [22]. Con el análisis histológico post mortem siendo el estándar de oro para EAC, nuestro objetivo fue examinar si la RM demostraría ser una herramienta válida para detectar la presencia de cáncer de esófago en el modelo LEVRAT en comparación con la inspección visual con endoscopia.
Materiales y Métodos
LEVRAT Modelo
el Comité de Cuidado y uso de Animales Institucional de la Universidad de Pittsburgh aprobó un protocolo para el desarrollo de este estudio (protocolo no. 1104373). Todos los animales recibieron atención humanitaria de conformidad con la "Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio." De extremo a lado anastomosis esofagoyeyunal (Fig. 1) se realizó sobre 300 g de 6-8 ratas macho Sprague-Dawley de una semana de edad ( Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) de acuerdo con el procedimiento quirúrgico y seguimiento de las normas se ha descrito previamente [13]. El estado de peso y la salud de los animales se controlaron diariamente. Se sacrificaron los animales antes de la punto final del estudio si experimentaban mayor que 45% de pérdida de peso o problemas de salud agudos y recibieron dieta suplementaria de pellet mushed o dieta gel (Nutra-Gel S5769, Bioserv) si la pérdida de peso alcanza mayor que 25%. Las ratas se sacrificaron a 40 semanas después de la operación a través de la inhalación de dióxido de carbono para la evaluación histológica. Los animales fueron programados para recibir la resonancia magnética y endoscopia en 32, 36, y 40 semanas después de la operación.
Imagen bruto de tumor de esófago (animal no. 13) inducida por el modelo LEVRAT modificado.
evaluación endoscópica
Alimentos y agua fueron restringidos de los animales durante 2-6 horas antes de la evaluación endoscópica y durante 2-4 horas después del procedimiento. Las ratas se anestesiaron con isofluorano al 5% y 2% de inducción y de mantenimiento, respectivamente. Los animales fueron intubados con un catéter intravenoso de calibre 16 ajustada para mantener la vía aérea durante la endoscopia pero no fueron ventilados. Las ratas se colocaron en posición supina sobre una cama quirúrgica calentada de agua para mantener la temperatura corporal durante la evaluación y un cono de la nariz se fijan con cinta adhesiva sobre el tubo de intubación. evaluación endoscópica visual se realizó de toda esófago mediante una fuente de luz de fibra óptica mini-rígida Hopkins II Delantero-oblicua Telescopio 30 ° (diámetro de 1,9 /2,1 mm, longitud 19 cm), y se obtuvieron muestras de biopsia por medio de 1 mm pellizco pinzas de biopsia en miniatura con las mordazas de doble acción (Karl Storz, Tuttlingen, Alemania). Se introdujo aire a través del puerto lateral del endoscopio para ayudar a la visualización del esófago distal. Se obtuvieron cuatro biopsias durante cada evaluación, dos para la evaluación histológica y dos para análisis correlato molecular. Todas las evaluaciones endoscópicas se registraron utilizando un grabador de vídeo digital (DVD HD Connect AIDA, Karl Storz, Tuttlingen, Alemania). Tras la evaluación endoscópica, los animales fueron inyectados por vía intramuscular para los días 0 a 3 con ketoprofeno (3 mg /kg) y enrofloxacina (5 mg /kg) en un esfuerzo para reducir las molestias y prevenir la infección respiratoria de aspiración. Los animales también se colocaron en una progresión dieta modificada tres días desde dieta gel a la dieta de pellets mushed a la dieta normal de pellets, respectivamente.
MRI Análisis
Todas las evaluaciones de MRI se realizaron dentro de las 24 horas de análisis endoscópico . Los animales fueron anestesiados con isofluorano al 5% de inducción y 2% mantenimiento a través de cono de la nariz. Las ratas se colocaron propensos a la camilla y asegurados. Un globo de presión pequeño se coloca por debajo de la cavidad torácica para controlar la frecuencia respiratoria y electrodos de electrocardiograma de plomo-2 fueron colocados a la izquierda patas traseras derecho de controlar la frecuencia del pulso (MR-compatible Modelo 1030 Sistema de Monitoreo y apertura de puerta, pequeños instrumentos animal, Inc. frontal y, Stony Brook-, Nueva York). imágenes por resonancia magnética usando una secuencia de eco de espín-T2-respiratoria cerrada turbo (TSE) con un tiempo de eco (TE) de 27 ms y el tiempo de repetición (TR) de aproximadamente 1200 a 1800 ms se realizaron con un pequeño animal 7 T ClinScan RM (Bruker) utilizando interfaz Siemens MRI (versión VB15A). RM imágenes fueron adquiridas tanto en planos coronal y axial. El tiempo de adquisición era de 9-10 minutos por avión.
procesamiento histológico y patológico Evaluación
Las muestras de biopsia obtenida con fines histológicos y moleculares para evaluar las correlaciones se congelaron en compuesto OCT (Tissue-Tek) y en tampón RLT (Qiagen), respectivamente. Los animales fueron sacrificados inmediatamente después de completar endoscópica final y las evaluaciones de MRI. Tras la necropsia, se recogieron todo el esófago y yeyuno aproximadamente 1 cm distal a la anastomosis y abrieron longitudinalmente para la inspección visual y la eliminación del artefacto antes de muestras se incluyeron en OCT y se congelaron rápidamente. Las secciones de tejido fueron cortados (5 micras) a partir de bloques de OCT y se tiñeron en hematoxilina y eosina (Fig. 2). Dos expertos en patología experimentados independientes realizaron análisis histológico. Las muestras en las que no se logró el consenso, así como los tumores que no son visibles en el examen macroscópico (no sobresaliente; & lt; 1 mm de diámetro) fueron excluidos
A, hematoxilina y eosina (aumento x 10) muestra la confirmación histológica. de EAC. B, la evaluación endoscópica de la misma rata. Flecha designa el área de tumor identificado por los participantes del estudio endoscópicos sospecha. C, evaluación axial de resonancia magnética. La flecha muestra una masa anormal en la pared esofágica seleccionada por los participantes del estudio de resonancia magnética. D, imagen coronal de resonancia magnética. La flecha identifica sección transversal correspondiente del tumor sospechoso en la zona de la anastomosis de interés. RM; imágenes por resonancia magnética, EAC; adenocarcinoma esofágico.
Diseño del Estudio de Interpretación Blinded
Endoscopia.
vídeos endoscópicos fueron editadas utilizando QuickTime Player (versión 10.1, Apple Inc.) para incluir la visualización completa de esófago distal (Fig. 2). Videos se cortaron para excluir escenas de biopsia, de manera que no sesgo del observador de las posibles áreas de interés. Todos los vídeos se importaron en una presentación de diapositivas por triplicado, aleatorio e identificados de-(PowerPoint 2010, Microsoft). Inmediatamente antes del estudio, endoscopistas y gastroenterólogos quirúrgicas esofágicas se presentaron con un tutorial delineando el modelo quirúrgico, objetivos del estudio, y la clasificación de los patrones de la mucosa superficial. características endoscópicas fueron descritos como los siguientes:
normal de CD - caracterizado por la superficie lisa y coloración uniforme;
esofagitis CD - se caracteriza por placas y crestas elevadas y coloración opaca con el exudado;
Barrett-como-intestinal metaplasia-CD - caracterizada por manchas de color salmón, incluso surgido-;
cáncer de CD - caracterizado por elevadas masas irregulares y /o ulceración. Los observadores fueron instruidos para cada grado de vídeo como positivo o negativo para el cáncer. Además, se pidió a los observadores en dar la vuelta manualmente las zonas sospechosas de tumor positivo en el vídeo para el primer subconjunto triplicado utilizando Herramientas de tinta PowerPoint. Todas las presentaciones se registraron para preservar anotaciones.
RM.
Todas las imágenes de resonancia magnética DICOM se transfirieron a OsiriX (versión 4.1, Pixmeo Sari) por triplicado, aleatorizado y aplica el anonimato para la evaluación cegada del estudio. Los participantes del estudio fueron presentados con un tutorial delineando el modelo quirúrgico, objetivos del estudio, y la clasificación de la patología de la siguiente manera:
normal de CD - incluso espesor de pared del esófago de proximal a distal del esófago;
estenosis benigna CD - aumento en el grosor de la pared del esófago en el esófago distal con límites lisos; - Aumento desigual en la pared del esófago que resulta en masa irregular. expertos radiólogo fueron instruidos para interpretar las imágenes de resonancia magnética correlacionados en planos axiales y coronales y registro positivo o negativo para el cáncer (Fig. 2). Además, se pidió a los participantes para rodear las zonas sospechosas de tumor en las imágenes axiales para el primer subconjunto triplicado. Todas las imágenes que contienen anotaciones fueron salvados.
Análisis estadístico
porcentaje de acuerdo fue calculada como el número total de veces que el evaluador estuvo de acuerdo con la histología, dividido por el número total de lecturas realizadas. kappa de Cohen se utilizó como una medida de acuerdo entre un evaluador individual y diagnósticos histológicos (por ejemplo, cáncer positivo o negativo). Kappa valores fueron evaluados de la siguiente manera: & lt; 0 representan ningún acuerdo; entre 0,01-0,20 representar una ligera coincidencia; entre desde 0,21 hasta 0,40, acuerdo justo; entre 0.41-0.60, moderado; entre 0,61-0,80 acuerdo sustancial; y entre 0,81 a 0,99 excelente acuerdo [23]. El coeficiente de correlación intraclase (CCI) se utilizó para estimar inter e intra-evaluador fiabilidad para detectar la presencia de tumores /ausencia hecha por los endoscopistas quirúrgicas esofágicas y gastroenterólogos la visualización de vídeos de endoscopia y por radiólogos que leen imágenes por resonancia magnética. ICC puede variar de 0 (sin acuerdo) a 1 (completamente de acuerdo). El aumento de la CPI, tanto para inter e intra-calificadores fiabilidad, ha aumentado acuerdo. Cinco evaluadores individuales leen cada rata tres veces para la RM. Cinco evaluadores diferentes leen cada rata tres veces para la endoscopia. Se determinó una lectura de consenso (≥2 /3) para cada evaluador y cada rata. Un promedio de todas las puntuaciones de consenso para todos los evaluadores se determinó para cada modalidad. La sensibilidad, especificidad, valores positivos y falsos negativos y falsos se calcularon utilizando la histología como patrón de referencia. Una característica de funcionamiento del receptor (ROC) curva se construyó para la resonancia magnética y endoscopia usar la puntuación media de consenso como la variable de contraste y la histología como la variable de estado. 0,05 fue considerado estadísticamente significativo; Un valor de p & lt. Los datos se analizaron utilizando SPSS Statistics, versión 18.0 (SPSS-IBM, Inc., Chicago).
Resultados
Las ratas y los Histología
Una cohorte de 38 animales, que hayan sido sometidas cirugía de la Levrat modificado, se seleccionó para recibir endoscópica y evaluación MRI a las 32, 36, y 40 semanas después de la cirugía. Diez animales fueron retirados del estudio debido a muerte preliminar (26,3%). Las necropsias se formaron en todos los animales y las causas de muerte fueron: pérdida de peso (n = 5), infección respiratoria aguda (n = 2), y desconocido (n = 3). La tasa de mortalidad reportada y causas asociadas de la muerte fueron consistentes con informes anteriores estudios que utilizan el modelo LEVRAT [13].
La evaluación histológica se realizó en todas las 28 muestras restantes de estudio y verificado por un observador independiente. Las muestras donde el consenso no podría lograrse en la histología (n = 5) y los tumores microscópicos (n = 4) fueron retirados de la cohorte del estudio, lo que resulta en una muestra final del estudio de 19 animales. De los 19 animales, se informó de 57,9% para tener EAC (n = 11). No hubo correlación significativa entre las biopsias endoscópicas y la histología post-mortem (datos no mostrados), como la mayoría de las muestras fueron difíciles debido a aplastar lee artefacto, profundidad inadecuada o la orientación indeterminado.
Análisis endoscópica
de los 5 participantes en el estudio ciego, porcentaje de acuerdo con la histología osciló entre 42,1% -57,9%, con un acuerdo promedio de 50,5% (Fig. 3). Kappa valores para los valores individuales cayeron entre -0,044 a 0,165, y no hay evaluaciones alcanzaron significación estadística (valor p & gt; 0,05) (Tabla 1). 47,37% de las exploraciones se puede leer con al menos 80% de precisión (9/19) (Fig. 3). CCI intra-calificadores fiabilidad oscilaron entre los escaneos desde 0,667 hasta 0,873 por triplicado; mientras que entre los calificadores CPI fue 0,608. análisis de la curva ROC produjo un área bajo la curva (AUC) de 0,534 (SE = 0,138; significancia asintótica = 0,804; intervalo de confianza del 95%, 0,263-0,805) (Fig. 4). La sensibilidad de la endoscopia fue 0,455 (intervalo de confianza del 95%, 0,323-0,586), la especificidad fue 0,575 (intervalo de confianza del 95%, 0,422 hasta 0,728) y la precisión diagnóstica (eficiencia) fue 0,505 (intervalo de confianza del 95%, 0,405-0,606). tasas positivas falsas y medias medias falsos negativos fueron de 0,425 (intervalo de confianza del 95%, 0,272-0,578) y 0,546 (intervalo de confianza del 95%, 0.0.414-0.679), respectivamente. Incluso cuando 5/5 evaluadores de endoscopia clasificado un tumor como positivo, había una tasa de falsos positivos del 40%
A, El gráfico muestra el porcentaje de exactitud de exploraciones individuales cuando se evaluó por cada técnica:. Endoscopia visual y MRI. B, El gráfico compara la precisión media de cada técnica como evaluado por el estudio ciego. RM; imágenes por resonancia magnética
A, curva ROC de lectura endoscópica promedio. (AUC = 0,534; SE = 0,138; significancia asintótica = 0,80; intervalo de confianza del 95%, 0,263-0,805). B, curva ROC de lectura promedio de resonancia magnética. (AUC = 0,966; SE = 0,036; significancia asintótica & lt; 0,001; intervalo de confianza del 95%, 0-1,0). ROC; característica de funcionamiento del receptor, AUC; área bajo la curva, SE; error estándar.
RM Evaluación
porcentaje de acuerdo con la histología de los participantes de resonancia magnética osciló entre 78,95% -94.7% con un acuerdo promedio de 85,3% (Fig. 3) y valores kappa de las tasas individuales entre 0,553-0,890. Todos los evaluadores alcanzaron significación estadística (valor p & gt; 0,05) (Tabla 1). 78,95% de las exploraciones se puede leer con al menos 80% de precisión (15/19) (Fig. 3). Intra-calificadores fiabilidad entre los CCI exploraciones por triplicado cayeron entre 0,315 a 0,785 y el ICC entre los calificadores fue 0,624. análisis de la curva ROC determinó una AUC de 0,966 (SE = 0,035; asintótica importancia & lt; 0,001; intervalo de confianza del 95%, 0-1,00) con una sensibilidad de 0,891 (intervalo de confianza del 95%, 0,809-0,973), la especificidad de la confianza de 0.800 (95% intervalo, 0,676 hasta 0,924), y la eficiencia de 0,853 (intervalo de confianza del 95%, 0,781-0,924) (Fig. 4). las tasas de positivos falsos y negativos falsos promedio fueron de 0,200 (intervalo de confianza del 95%, 0,076 a 0,324) y 0,109 (intervalo de confianza del 95%, 0,027-0,208), respectivamente. Con una calificación promedio de resonancia magnética de 0,80 o mayor (4/5 o 5/5 de opiniones positivas para tumor), resonancia magnética calificación promedio se observó a ser predictivo de tumor sin falsos positivos.
Discusión
la búsqueda de nuevos métodos de tratamiento para EAC ha convertido en muy importante en los últimos años con el aumento de los pacientes con cáncer de esófago. [24], [25]. Dado que la RM recientemente se ha utilizado con éxito en modelos animales pequeños traducción para otros tipos de cáncer [20] - [22], que tuvo como objetivo poner a prueba la capacidad de la RM para el diagnóstico de tumores de esófago con eficacia en el modelo LEVRAT en comparación con la endoscopia. Como se ha señalado, se encontró resonancia magnética para ser un método muy válido y fiable para la detección de tumores de esófago en comparación con la endoscopia. Aunque la evaluación endoscópica tiene sus propias ventajas, en nuestro estudio, las biopsias podrían no proporcionar la histología fiable debido al tamaño pequeño de la muestra y la orientación complicada
.
Cuando se compara con la evaluación endoscópica, resonancia magnética se observó a ser superior en la detección de adenocarcinoma en todos los niveles, incluyendo la precisión, la sensibilidad, la especificidad y la eficiencia. consenso entre observadores también fue mayor para MRI que indican las evaluaciones futuras probablemente producir resultados similares. Intra-observador consenso entre lecturas por triplicado fue la única variable que los valores representados endoscópicos una gama más alta, lo que indica una mayor consenso entre las lecturas endoscópicos. Aún así, la resonancia magnética con los niveles más bajos de consenso intraobservador fueron consistentes con las exploraciones producir niveles de precisión más bajas, lo que indica la variabilidad se limita principalmente a las exploraciones difíciles. Hubo cuatro casos en los que se observó la exactitud promedio de resonancia magnética para estar por debajo de 80%. En tres de los casos, la interpretación fue difícil debido a la presencia de un absceso en el sitio anastomótico o el estómago; mientras que en el cuarto caso, hubo una significativa efecto de movimiento.
La naturaleza no invasiva de la resonancia magnética, su capacidad para identificar con precisión el cáncer, y la incorporación en el modelo LEVRAT hace que la modalidad más aún para evaluar nuevos agentes y su eficacia en los estudios de tratamiento. La alta precisión y bajas tasas de falsos positivos indican MRI sería un método fiable para diferenciar cáncer vs. no hay brazos de tratamiento del cáncer con el mínimo error. Además, la baja tasa de falsos negativos también ayudaría a maximizar la eficiencia y minimizar la cantidad de animales necesarios para un protocolo particular. Por otro lado, la endoscopia produjo una tasa de falsos positivos del 40%, incluso cuando todos los expertos endoscópicos de acuerdo tumor estaba presente. Por lo tanto, la endoscopia visual sería una mala discriminador de estado del tumor para un estudio de este tipo
.
Las limitaciones de este estudio incluyen el pequeño tamaño de la muestra. Además, aunque la secuencia específico utilizado en este estudio fue capaz de detectar con precisión la presencia del tumor, todo el volumen de masas sospechosas no fue cuantificado debido a la naturaleza inherente de 2 dimensiones de la exploración TSE. Los estudios futuros pueden beneficiarse de una exploración de 3 dimensiones. Una secuencia de MRI 3-D integra la axial, coronal y sagital para permitir la cuantificación volumétrica precisa de características anatómicas. En el modelo descrito, una exploración 3-D MRI podría ser utilizado para analizar la eficacia en un modelo de tratamiento, proporcionando pre- volumen del tumor y el tratamiento posterior. La utilización de agentes de contraste para mejorar la zona de la anastomosis de interés y diferenciar tumor aumentaría aún más la precisión de esta modalidad.
Reconocimientos
Los autores también desean agradecer a la Universidad de Pittsburgh Cancer Institute, específicamente Erik Weiner, Paul Schornack, y Michael K. Gibson por su apoyo en nuestros esfuerzos.