Extracto
Antecedentes
En base a los hallazgos preclínicos, estamos evaluando la eficacia de la inyección intratumoral de células dendríticas (DC ) transducidas con un vector adenoviral que expresa el gen de quimiocina secundaria linfoide (CCL21) (Ad-CCL21-DC) en un ensayo de fase I en el cáncer avanzado de pulmón no microcítico (CPNM). Si bien este enfoque muestra la mejora inmunológica, la preparación de DC autólogas para CCL21 modificación genética es engorroso, caro y consume tiempo. Estamos evaluando un enfoque no basado en DC que utiliza nanopartículas para la entrega de la bóveda CCL21 intratumoral para mediar en la actividad antitumoral en cáncer de pulmón.
Principales conclusiones
Aquí se describe que la plataforma de bóveda de nanocápsulas para la entrega provoca CCL21 actividad antitumoral con la inhibición del crecimiento del cáncer de pulmón. Bóveda de nanocápsulas CCL21 empaquetado (CCL21 bóvedas) ha mostrado una actividad funcional en la quimiotaxis y presentadoras de antígenos ensayos de actividad. bóvedas recombinantes afectados migración quimiotáctica de las células T y este efecto fue predominantemente CCL21 dependiente como la neutralización CCL21 abrogó la mejora CCL21 en la quimiotaxis mediada. la administración intratumoral de CCL21-bóvedas en ratones portadores de cáncer de pulmón realzada infiltrados leucocitarios (CXCR3
+ T, CCR7
+ T, IFN
+ linfocitos T, DEC205
+ DC), el crecimiento del tumor del cáncer de pulmón inhibido y reduce la frecuencia de las células inmunes supresoras [células mieloides supresoras derivadas (MDSC), células T reguladoras (Treg), IL-10 células T]. CCL21 bóvedas indujeron respuestas antitumorales sistémicos mediante el aumento de la actividad lítica de las células T del bazo frente a células tumorales parentales.
Importancia
Este estudio demuestra que la bóveda de nanocápsulas puede entregar de manera eficiente CCL21 para sostener la actividad antitumoral e inhibir pulmonar el crecimiento del cáncer. La bóveda de nanocápsulas puede servir como un enfoque "fuera de la plataforma" para entregar citocinas antitumorales para el tratamiento de una amplia gama de tumores malignos
Visto:. Kar Reino Unido, Srivastava MK, Andersson, Baratelli F, H Huang, Kickhoefer VA , et al. (2011) Novela CCL21-Bóveda Nanocápsula intratumoral Entrega inhibe el crecimiento del cáncer de pulmón. PLoS ONE 6 (5): e18758. doi: 10.1371 /journal.pone.0018758
Editor: Siyaram Pandey, Universidad de Windsor, Canada |
Recibido: Diciembre 21, 2010; Aceptado: 9 Marzo 2011; Publicado el 3 mayo, 2011
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Universidad de California Descubrimiento Grant (a LHR y VAK) Jonnson un Centro Integral del Cáncer de becas a UKK) y por Institutos nacionales de Salud Subvenciones (SR1 CA95686 y CA126944 SR1), Universidad de California en Los Ángeles Programa de cáncer de pulmón, Departamento de Asuntos de Veteranos Medical Fondos de investigación y tabaco Programa de las enfermedades relacionadas con el Programa de Premios de la Universidad de California (15RT-0207). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en los Estados Unidos y en todo el mundo [1]. Hasta la fecha, con las formas existentes de tratamiento, la supervivencia global a largo plazo es sólo el 15%. Por lo tanto, se necesitan nuevas estrategias terapéuticas. Estamos evaluando una novela de nanocápsulas bóveda como una prueba de concepto para la entrega de citoquinas inmunopotenciador para un "fuera de la plataforma de reactivo" terapia a base inmunitaria para el cáncer de pulmón.
bóvedas son ribonucleoproteínas ubicuos citoplásmicos descritos por primera vez en 1986 [2]. bóvedas nativas son 12,9 ± 1 esferas ovoides MDa con dimensiones totales de aproximadamente 40 nm de anchura y 70 nm de longitud [3], [4], presente en los organismos casi todo eucariotas con entre 10
4 y 10
7 partículas por célula [5]. A pesar de su abundancia celular, la función bóveda sigue siendo difícil a pesar de que se han relacionado con muchos procesos celulares, incluyendo la respuesta inmune innata, la resistencia a múltiples fármacos en células cancerosas, las vías de señalización multifacéticos, y el transporte intracelular [6].
Como forma natural que ocurre nanocápsulas, bóveda de la partícula puede ser una estructura ideal para ingeniería como un sistema terapéutico para el compuesto de encapsulación, la protección, y la entrega. Bóvedas son estructuras muy estables
in vitro
, y varios estudios indican que las partículas son no inmunogénicas [7]. Bóvedas se puede diseñar y expresarse utilizando un sistema de expresión de baculovirus y las proteínas heterólogas se puede encapsular en el interior de estas partículas recombinantes utilizando un dominio de proteína de metas denomina INT para la interacción bóveda. Varias proteínas heterólogas se han fusionado con el dominio INT (por ejemplo, fluorescente y las proteínas enzimáticas) y estas proteínas de fusión, cuando se envasa en las bóvedas recombinantes, conservar sus características nativas, y por lo tanto conferir nuevas propiedades de bóveda [8], [9].
CCL21 se ha identificado como una quimioquina linfoide que se expresa predominantemente y constitutivamente por las vénulas endoteliales altas en nódulos linfáticos y placas de Peyer, los vasos linfáticos y las células del estroma en el bazo y el apéndice [10]. CCL21 se une al receptor de quimioquinas CCR7 y es un quimioatrayente para células maduras dendríticas (DC), células T vírgenes y de memoria [11], [12]. Esta quimiocina, junto con CCL19, es necesaria para la organización del tejido linfoide normal que es en última instancia esencial para las interacciones eficaces de células T de DC. asesinas naturales (NK) y células T asesinas naturales (NKT) efectores antitumorales también expresan receptor CCR7 y son atraídos por la quimioterapia CCL21. El uso de quimiocinas para atraer DC, linfocitos, NK y NKT efectores en tumores puede servir como una estrategia antitumoral eficaz. Sobre la base de este concepto, hemos demostrado previamente que la administración intratumoral de CCL21 recombinante reduce la carga tumoral en modelos de cáncer de pulmón murino [13]. La actividad antitumoral inducida por CCL21 recombinante sin embargo requiere una dosificación alta y frecuente porque las proteínas administradas por vía intratumoral no se conservan localmente por períodos prolongados. Aunque estos estudios delineados el papel de CCL21 como un agente antitumoral eficaz, de alta dosis de administración intratumoral frecuente es clínicamente limitando con el potencial de toxicidad sistémica innecesario. Sobre la base de las limitaciones de este enfoque, hemos examinado el uso de DC para el suministro intratumoral CCL21 [14], [15]. En estudios preclínicos, se demostró que la administración intratumoral del gen modificado CCL21 DC condujo a la erradicación del tumor en modelos murinos de cáncer de pulmón. Después de nuestra descripción inicial de las actividades antitumorales de CCL21, varios grupos han informado de que CCL21 tiene propiedades antitumorales potentes en una variedad de sistemas modelo [16], [17], [18], [19], [20]. En todos los modelos, CCL21 demostrado una potente regresión de los tumores, que ha demostrado ser dependiente de la inmunidad del huésped celular T.
Sobre la base de una amplia evaluación preclínica, que comenzó un ensayo clínico patrocinado por el NCI hace un año la evaluación de la intratumoral inyección de DC transducidas con un vector adenoviral que expresa el gen CCL21 (Ad-CCL21-DC) en un ensayo de fase I en el cáncer avanzado de pulmón no microcítico (CPNM) [21]. Aunque nuestros estudios clínicos que utilizan la administración intratumoral del gen modificado CCL21 DC muestra la mejora inmunológica, la preparación de CCL21 que expresan DC autólogas es engorroso, costoso y consume mucho tiempo. Un reactivo off-the-shelf eficaz sería facilitar la evaluación de esta terapia a base de quimioquinas. Hacia el logro de este objetivo, estamos evaluando un enfoque no basado en DC que utiliza nanopartículas para la entrega de la bóveda CCL21 intratumoral con el propósito de iniciar las respuestas inmunitarias antitumorales en cáncer de pulmón. Anticipamos que el uso de nanopartículas de la bóveda será eludir preparación DC autólogo, reducir al mínimo la variabilidad lote a lote y permitir la comparabilidad y la normalización. Además, las nanopartículas de la bóveda diseñados para liberar CCL21 puede ser utilizado para tratar una amplia gama de tumores malignos.
En este estudio se evaluó el efecto de la entrega bóveda de nanocápsulas de CCL21 en el crecimiento de pulmón de Lewis (3LL) tumores
in vivo
. Nuestros resultados indican que una sola administración intratumoral de nanocápsulas CCL21-bóveda recluta efectores antitumorales, induce una potente actividad antitumoral e inhibe el crecimiento del tumor.
Materiales y Métodos
recombinantes Bóvedas
La CCL21 cDNA se fusionó en marco con cualquiera de INT o mCherry-INT [22]. CCL21 murina se amplificó por PCR con los cebadores: CCL21- GCGCGGATCCCCATGGCTCAGATGATG hacia adelante y marcha atrás CCL21- GCGCAGATCTTCCTCTTGAGGGCTGTGTCTG. Para formar mCCL21-mCherry-INT en pFastBac, se purificó el producto CCL21 PCR se digirió con BamH1 y Bgl I y se ligó a BamH1 fosfatasa tratada mCherry-INT pFastBac. CCL21 humana se amplificó por PCR con los cebadores: CCL-21 M-Spel CCCCACTAGTC CAGTTCTCAGTCACTGGCTCTG, CCL-21-NheI CCCCGCTAGCTGGCCCTTTAGGGGTCTGTG, INT con NheI CCCCGCTAGCTGCACACAACACTGGCAGGA, INT con XhoI GGGGCTCGAGTTAGCCTTGACTGTAATGGA para formar hCCL21-INT. Recombinante (r) baculovirus se generaron como se describe [7]. Las células Sf9 se infectaron con mCCL21-mCherry-INT, hCCL21-INT o CP-MVP codifican baculovirus a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,01 para 65 h. Se prepararon las células infectadas como se describe [7]. Los lisados que contienen CP-MVP bóveda se mezclaron con lisados que contienen mCCL21-mCherry-INT o hCCL21-INT y se incubaron en hielo durante 30 minutos para permitir que las proteínas de fusión INT para empaquetar el interior de las bóvedas. Bóveda se purificaron como se describe [8], se resuspendieron en PBS estéril y la concentración de proteína determinada por ensayo de BCA (Bio-Rad, CA). integridad de la muestra se analizó por microscopía electrónica con tinción negativa o tinción de Coomassie de SDS-PAGE seguido de análisis de transferencia de Western. CCL21 proteína-INT en la bóveda se cuantificó por análisis densitométrico de transferencias de Western contra la proteína purificada INT recombinante como estándar.
Los anticuerpos
Los anticuerpos primarios para el análisis Western Blot fueron conejo anti-anticuerpo MVP (1 /dilución 1000) [23] o anticuerpo de conejo anti-VPARP (1/500 dilución) [24] y secundario de cabra anti-conejo HRP-anticuerpo (1:2000 dilución) (Amersham). El CCL21 y CXCR3 (220803) mAb eran de I + amp; D, (Minneapolis, MN), inmunotinción primaria CD3 era de DAKO (Cytomation, Carpinteria, CA, EE.UU.). FLTC, PE, APC, PerCP o PerCP-Cy7 conjugado mAbs anti-ratón a CD3 (145-2C11), CD4 (RM4-5), CD8a (53-6,7) y el anticuerpo de control de isotipo fueron de BD Biosciences (San Diego, CA), anticuerpos monoclonales para detectar células T reguladoras CD4 (GK1.5), CD25 (PC61), intranucleares Foxp3 (fjk-16) IL-10 (JES5-16E3), IFN (XMG1.2), DEC205 (205yekta), CCR7 ( 4B12) y EpCAM (G8.8) eran de eBioscience (San Diego, CA), mAb CD11b (M1 /70), Gr1 (RB6-8C5), eran de BioLegend (San Diego). colorante de proteínas de Bradford cuantificación fue de Sigma.
Ensayo de quimiotaxis
ensayos de quimiotaxis se realizaron utilizando placas de 24 pocillos con 3 micras insertos de tamaño de poro (Costar /Corning, Corning, Nueva York) según la Instrucciones del fabricante. 2.0 × 10
5 células T2 en medio libre de suero fueron cargados en la cámara superior. 200 ng /ml de CCL21-mCherry-INT /bóveda, 600 ng /ml rCCL21 (R & amp; D), 200 ng /bóveda ml CCL21-mCherry-INT /CP-MVP con anticuerpos neutralizantes CCL21 (5 mg /ml), 600 ng /ml con anticuerpo CCL21 CCL21 (5 mg /ml) se añadieron a las cámaras inferiores. Después de 2 horas de incubación, las células migraron fueron enumerados por FACS.
procesamiento y presentación de antígenos de ensayo
DC2.4 (5 × 10
4c /pocillo) en placas de 96 pocillos con la proteína OVA (350 g /ml), línea de células CD8 T B3Z (10
5c /pocillo), en presencia de bóvedas de control (200 ng /ml), o mCCL21 bóvedas (200 ng /ml) o rCCL21 (200 ng /ml) durante 24 hrs. Para determinar el impacto de CCL21 en la actividad de APC, CCL21 se neutralizó con anti-CCL21 Ab (5 mg /ml). IL-2 segregada por las células T CD8 activadas se cuantificó por ELISA (eBioscience).
Cultivo celular
Se obtuvo la línea celular de carcinoma de pulmón de Lewis (3LL) de ATCC (Manassas, VA) y se cultivó como se describe [25]. La línea celular estaba libre de micoplasma y utilizado antes de la décima Passage to
Tumorigénesis Modelo
C57BL /6 ratones libres de gérmenes patógenos o UBC-GFP /BL6 (6-8 semanas de edad; Jackson Laboratory). se mantuvieron en el vivero de Asuntos de Veteranos de Investigación de animales de acuerdo con las directrices de la junta de revisión institucional de animales. Todo el trabajo con animales se llevó a cabo de acuerdo con la atención de asuntos de los veteranos de Animales institucional y el empleo directrices del Comité: Identificación del A3002-01. La junta de revisión institucional aprobado todos los estudios con animales en este manuscrito. Animales que exhiben signos de dolor o que satisfacen los criterios de punto final fueron sacrificados inmediatamente de acuerdo con el protocolo basado institución aceptada. las células del tumor 3LL (1,5 × 10
5) se inyectaron
s.c.
. en la zona supraescapular derecha de los ratones. Los ratones portadores de tumores establecidos 9 días de edad, se trataron con una única inyección intratumoral de mCCL21-mCherry-INT /bóvedas CP-MVP (200 ng), bóvedas CP- MVP (200 ng) en 200 l o NS diluyentes. volúmenes de los tumores se monitorizaron y se calculan como se describe [25]. Para determinar los linfocitos que infiltran los tumores, los ratones UBC-GFP /BL6 que portaban tumores de 9 días se trataron y 7 días post-tratamiento, los tumores no necróticas se aislaron y se congelaron en OCT. El tejido congelado se seccionó, fijo y counterstained con 4 ', 6-diamino-2-fenilindol (DAPI) y se observa bajo un microscopio de fluorescencia Olympus 1 × 71. Las imágenes fueron adquiridas mediante el software Image Pro.
modelo ortotópico
células
3LL-GFP (5 × 10
3) fueron implantados en el pulmón izquierdo como se describe [25]. Una semana después de la inoculación del tumor, los ratones fueron tratados con diluyente, bóvedas de control o mCCL21 bóvedas
a través de la inyección
transtorácica. Cuatro semanas después de la implantación del tumor, los pulmones se recogieron para la evaluación de la carga tumoral e infiltrados leucocitarios como se describe [25].
inmunotinción
tumores sección se prepararon de acuerdo con el protocolo estándar [26]. Los portaobjetos se incubaron con anticuerpo primario (CD3 1:200) durante la noche a 4 ° C, se lavó y se incubó con biotinilado secundario. Las diapositivas fueron desarrolladas con el kit Vectastain ABC-AP y la solución de sustrato Vector Red (Vector Laboratories, Burlingame, California). Las diapositivas se counterstained con hematoxilina.
Citometría de Flujo
FACS análisis se realizó para CD3, CD4, CD8, CCR7, CD11b, Gr1, DEC205, CD25, FOXP3, CXCR3 y intracitoplasmática de células T IFN y IL-10 en una sola suspensión de células tumorales de pulmón como se describe [25].
T célula citolisis
se evaluó esplénica linfocitos T lisis contra células de melanoma B16 y 3LL autólogo de control como se describe [25] .
El análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron mediante pruebas t o pruebas de Mann-Whitney. Todos los análisis estadísticos se realizaron en el software GraphPad PRISM 5.
Resultados
Embalaje CCL21 en bóvedas recombinantes
Varias proteínas exógenas se han empaquetado en el interior de las bóvedas recombinantes (luciferasa, verde fluorescente proteína, proteína fluorescente mCherry, proteína de adenovirus VI, y la principal proteína de la membrana exterior de Chlamydia) cuando se fusiona a un 162 aminoácidos del dominio bóveda de segmentación (INT) derivado de la proteína bóveda-asociado (VPARP, los aminoácidos 1563-1724). Estas proteínas de fusión se unen con alta afinidad por el interior de la partícula bóveda, están protegidos del ambiente exterior, y conservan sus propiedades nativas, lo que confiere nuevas características sobre las partículas de bóveda recombinantes [7], [9], [22]. La CCL21 quimiocina de ratón se fusiona a INT para crear una proteína de fusión CCL21 (mCCL21-INT) que se pueden empaquetar en el interior de las bóvedas recombinantes. La mezcla de lisados que contienen recombinante CCL21-INT y MVP rata generados en células Sf-9 permitió la formación de un complejo bóveda macromolecular que contiene la proteína de fusión CCL21 que puedan ser aislados por ultracentrifugación en gradiente de densidad. Las bóvedas purificadas contenían tanto MVP así como CCL21-INT (en adelante como CCL21 bóvedas) como se indica por análisis de tinción de Coomassie y inmunotransferencia (Fig. 1). Para estos estudios se prepararon tres bóvedas diferentes. Uno fue empaquetado con CCL21 ratón fusionado a la proteína fluorescente mCherry-INT (bóvedas /CP-MVP-mCCL21 mCherry-INT, abreviado aquí mCCL21 bóvedas), una segunda bóveda fue empaquetado con CCL21 humana-INT (hCCL21-INT /CP- bóvedas MVP, abreviado aquí hCCL21 bóvedas) y el tercero era un control bóveda vacía (CP-MVP bóvedas [27]) (fig. 1A y B). Se estimó la cantidad de CCL21 empaquetado dentro de las bóvedas mediante transferencias Western cuantitativas. Nuestro análisis indica que 20-30 moléculas de la proteína CCL21-INT fueron empaquetados en cada partícula CCL21-bóveda. Esto es consistente con nuestra experiencia anterior en el envasado de múltiples copias de otras proteínas de fusión INT en bóvedas recombinantes [22]. Con una estimación de 20-30 proteínas CCL21-INT por bóveda, es probable que esta se encuentra en o cerca de un nivel de saturación para el envasado de esta proteína tamaño. Los CCL21 bóvedas también mostraron un perfil de sedimentación muy similar en gradientes de sacarosa como partículas de bóveda que contienen el dominio INT fusionan con luciferasa, [7], [9], [22] lo que sugiere que la incorporación de CCL21-INT no tuvo impacto en la estructura normal de bóveda partículas recombinantes. Para comprobar esto, se examinaron los complejos de bóveda purificadas por microscopía electrónica de transmisión tinción negativa (Fig. 1C). Las bóvedas de CCL21 exhiben la característica forma de barril morfología de las bóvedas, en consonancia con la morfología previamente establecido de bóvedas que contienen proteínas de fusión recombinante-INT [9], [27].
A. Tinción de Coomassie de las bóvedas purificados fraccionado en un SDS-PAGE 4-16%. Carril 1, marcadores de peso molecular. Carril 2, bóvedas mCCL21-mCherry-INT /CP-MVP. La banda de 97 kDa MVP se indica por la flecha. Carril 3, bóvedas hCCL21-INT /CP-MVP. Carril 4, CP-MVP bóvedas. B. Western blot análisis de las bóvedas purificados para confirmar las presencias de MVP o las proteínas de fusión INT indicados (flechas). Carril 1, bóvedas mCCL21-mCherry-INT /CP-MVP se inmunotransferencia con el anticuerpo anti-MVP. Carril 2, bóvedas mCCL21-mCherry-INT /CP-MVP se inmunotransferencia con el anticuerpo anti-INT. Carril 3, bóvedas hCCL21-INT /CP-MVP se inmunotransferencia con el anticuerpo anti-INT. C. micrografías electrónicas Negativo-manchadas de bóvedas purificada. bóvedas CP-MVP (izquierda), mCCL21-mCherry-INT /CP-MVP bóvedas, hCCL21-INT /bóvedas CP-MVP (derecha). (centro) guía empresas
CCL21 bóvedas son biológicamente activos y inducen la migración de las células T2 y mejorar la actividad DC APC
a ensayo de quimiotaxis se utilizó para determinar si CCL21 conserva la función biológica cuando se envasa en las bóvedas recombinantes. La actividad quimiotáctica de CCL21 está mediada a través de su receptor CCR7 para inducir la migración de células T y DC. Para evaluar la actividad biológica de CCL21 en la bóveda, se utilizó células de hibridoma T2 que expresan constitutivamente CCR7. Dos concentraciones diferentes de CCL21 bóvedas (200 ng y 600 ng), bóvedas vacías (600 ng), y CCL21 recombinante (600 ng) se colocaron en la cámara inferior de una placas Transwell de 24 pocillos y 2 × 10
5 se añadieron células T2 a la cámara superior. El número de células que migraron a la cámara inferior se determinó por citometría de flujo y representa como% de migración (Fig. 2A). Más de 7,5% de las células T2 respondió a 200 ng de mCCL21 bóvedas en comparación con ≤2.5% de las células T2 incubadas con 600 ng de CCL21 recombinante. Este es un potente respuesta teniendo en cuenta que la concentración se ha indicado anteriormente es para CCL21 bóvedas y la concentración real de CCL21 en las bóvedas se estima que es ≤20 ng. El aumento de la bioactividad de mCCL21 bóvedas puede ser debido a una mayor estabilización de CCL21 resultante de embalaje de la proteína en el entorno de protección de la luz de bóveda. Como la proteína de fusión asociados no covalentemente dentro de bóvedas, la respiración bóveda en solución puede liberar CCL21 en una forma de gradiente. Así, el número de células que migran en respuesta a mCCL21 bóvedas era más alta que la CCL21 recombinante porque se forma un gradiente más pronunciado. Para determinar si la migración de células T2 fue CCL21-dependiente, un anticuerpo neutralizante anti-CCL21 se utilizó para bloquear la actividad quimiotáctica de tanto CCL21 recombinante y mCCL21 bóvedas. El anti-CCL21 bloqueado mCCL21-bóveda actividad funcional que indica la actividad quimiotáctica de una manera específica CCL21 (Fig. 2A). Se evaluó el impacto de mCCL21 bóvedas sobre la actividad de APC DC
in vitro
. En comparación con el control bóvedas, mCCL21 bóvedas aumentada capacidad de DC para procesar y presentar la ovoalbúmina y activan las células T CD8 para secretar IL-2. La neutralización de CCL21 abrogó el aumento de la actividad DC APC para controlar los niveles (Fig. 2B). Se observaron resultados similares con hCCL21 bóvedas sobre la actividad de APC DC (datos no mostrados).
A. CCL21 bóvedas aumentó la migración de células T2. 2.0 × 10
5 células T2 se sembraron en medio libre de suero en la cámara superior. mCCL21-mCherry-INT /bóvedas CP-MVP (200 ng /ml o 600 ng /ml), CCL21 recombinante (600 ng /ml), bóvedas de control (CP-MVP bóvedas 600 ng /ml) o la neutralización de anti-CCL21 anticuerpo recombinante (5 mg /ml) se añadieron a la cámara inferior de los pocillos. Después de 2 horas de incubación, la migración de las células T2 se analizaron mediante citometría de flujo. mCCL21 bóvedas se incrementaron de manera efectiva la migración T2 en comparación con el control. Anti-CCL21 neutralizar Ab a CCL21 abrogó el aumento de la migración T2 lo que sugiere que CCL21 en la bóveda predominantemente mediar en la migración quimiotáctica de células T2. Los datos en el panel son representativos de 2 experimentos independientes. Barras; Media ± SEM, * p & lt; 0,05 entre los mCCL21 bóvedas y bóvedas de control o los grupos de tratamiento de anticuerpo anti-CCL21. B. mCCL21 bóvedas de mayor actividad DC APC y el bloqueo de CCL21 invirtieron el aumento en la actividad de APC. células B3Z (1 × 10
5 células /200 l /pocillo) fueron co-cultivadas con DC 2,4 (5 × 10
4 células /200 l /pocillo) y ovoalbúmina (350 g /ml) en presencia o ausencia de mCCL21 bóvedas (200 ng /ml) y anticuerpo anti-CCL21 (5 g /ml) o anticuerpo control (5 mg /ml IgG de cabra) durante 24 hrs. bóvedas de control se utilizaron a una concentración de 200 ng /ml. estado de activación de células T se midió por la IL-2 por ELISA. Los datos son representativos de 2 experimentos independientes. Barras; La media ± SEM, * p & lt;. 0,05 entre los mCCL21 bóvedas y bóvedas de control o los grupos de tratamiento de anticuerpos anti-CCL21
CCL21 bóvedas de mejorar el reclutamiento de los leucocitos infiltrados e inhiben el crecimiento del tumor 3LL
Se determinó la actividad antitumoral de mCCL21 bóvedas de tumor 3LL establecida
in vivo
. Una sola inyección intratumoral de mCCL21 bóvedas (200 ng) dio lugar a disminución significativa en el crecimiento del tumor en comparación con bóvedas vacías (Fig. 3A). El grupo de tratamiento mCCL21-bóveda mostraron una mayor infiltrados leucocitarios intratumorales en comparación con bóvedas de control (Fig. 3B) y la tinción inmune demostró que los infiltrados fueron predominantemente CD3 células T que expresan (Fig. 3C panel inferior derecho). La eficacia antitumoral de mCCL21 bóvedas se determinó en el modelo de cáncer de pulmón 3LL ortotópico establecido 7-día. mCCL21 bóvedas inhibieron la carga tumoral por 7 veces en comparación con los controles (Fig. 4A-B). En el control de grupos de tratamiento (diluyentes o bóveda control), había 7-9% de disminución en el peso corporal medio al final de la duración experimental pero no se observó cambio de peso significativa en el grupo de tratamiento CCL21-bóveda. Una evaluación de las poblaciones leucocitarias intratumorales mostró frecuencia de células CD4, CD8, CD3 CXCR3, CD3 CCR7 y DEC205 mejorada pero la frecuencia de MDSC y Tregs (Fig. 4C) reduce.
A. CCL21 bóvedas inhibieron el crecimiento del tumor y el aumento de células T intratumoral se infiltra en el cáncer de pulmón. C57BL /6 ratones que llevan 9 día 3LL tumores establecidos (
s.c..
) Fueron tratados por vía intratumoral con bóvedas de control (200 ng), mCCL21 bóvedas (200 ng) o solución salina normal diluyente (NS). que divide en dos diámetros de los tumores se midieron con calibres. ANTES DE CRISTO. mCCL21 bóvedas aumentaron la afluencia de células T que expresan CD3 en el tumor en comparación con el control de bóvedas. ratones UBC-GFP /BL6 que portaban tumores establecidos de 9 días se trataron por vía intratumoral con bóvedas de control o mCCL21 bóvedas. tejido congelado OCT, fue seccionada, fijada en portaobjetos, y contratinción con DAPI el tinte nuclear (azul). Los tumores de control (
panel superior
) demuestran fluorescencia verde muy limitada (la infiltración de células) en una vista de alta potencia (ampliación, × 400). La mayoría de las células fluorescentes verdes son grandes células estromales poligonales mientras que las células tumorales son contrastados azul por DAPI. tinción inmune de las células T CD3 muestra muy pocos expresando linfocitos T (panel superior derecho). En contraste, los linfocitos prominentes infiltrantes de tumor, las pequeñas células fluorescentes verdes redondas son evidentes en los tumores de los ratones tratados con mCCL21-bóveda (flecha,
panel inferior
). tinción inmune de las células T demuestra que los infiltrados son CD3 células T que expresan (abajo a la derecha). Datos; La media ± SEM, * p & lt; 0,05 entre mCCL21-bóveda y el grupo control, n = 10 ratones /grupo
5 × 10
3 se inyectaron células tumorales 3LL-GFP en el pulmón izquierdo. por vía transtorácica. Una semana después de las inyecciones tumorales, los ratones fueron tratados con diluyente (NS), bóvedas de control (2 g) o mCCL21 bóvedas (2 g) por vía transtorácica en el pulmón izquierdo. Día de la implantación del tumor 28 después, los pulmones se recogieron para el análisis de la carga tumoral e infiltrados leucocitarios. A. H & amp; E tinción de secciones de tumor de pulmón de diluyente o de control bóvedas mostraron un aumento de las masas tumorales (masa tumoral representado por la flecha superior del panel y se infiltra en el panel inferior derecho) en comparación con la masa tumoral reducido en el grupo de tratamiento CCL21-bóveda. B. La carga tumoral se calculó en porcentaje total de células tumorales que expresan GFP y EpCAM en total compendio de pulmón. ingenua de pulmón se utilizó como control para configurar la puerta. tratamiento CCL21-bóveda redujo el crecimiento del tumor. C. CCL21 bóvedas aumentados CD4, CD8, CXCR3
+ CD3
+ T, CCR7
+ CD3
+ T y DEC205
+ DC se infiltra y se habían reducido las frecuencias de MDSC y células T reguladoras. DELAWARE. Los ratones tratados CCL21-bóveda había aumentado tumor infiltra con alta IFN pero redujo IL-10 que expresan las células T en comparación con los controles. F. Tratamiento CCL21-bóveda aumentó la actividad citolítica de las células T esplénicas purificadas contra los tumores 3LL parentales
in vitro gratis (E:T de 20:01 y 40:1). Las barras de datos, con una media ± SEM, * p & lt; 0,05 CCL21 entre bóvedas y los grupos de la bóveda de control, n = 10 ratones /grupo
CCL21 bóvedas aumentan tumor infiltración de células T que se mejora el IFN pero reducen IL. -10 y aumentar la actividad citolítica de las células T sistémica
tumor T linfocítica infiltra de ratones tratados mCCL21-bóveda había aumentado intracitoplasmática de IFN y la reducción de IL-10 (Fig. 4D-e). Intratumoral mCCL21 bóvedas de la actividad inmunitaria antitumoral sistémica inducida:. Las células T del bazo de los ratones tratados mCCL21 bóveda habían aumentado la actividad lítica contra las células tumorales parentales
in vitro gratis (Fig. 4F)
Discusión
Hemos demostrado previamente que intratumoral CCL21 o CCL21 gen recombinante modificado DC provoca una reducción del tumor dependiente de células T en modelos murinos de cáncer de pulmón [13], [14], [15], [28], [29]. Sobre la base de modelado amplio preclínica, hemos traducido nuestro enfoque DC-AdCCL21 intratumoral para tratar el cáncer de pulmón en estadio avanzado en un ensayo clínico de fase. Aunque los resultados iniciales de este estudio sugieren la mejora inmunológica, estamos evaluando los mecanismos de entrega CCL21 que obviará la necesidad de aislar y cultura autólogo DC. Con este fin se evaluaron nanocápsulas CCL21-bóveda como un "fuera de la plataforma" plataforma terapéutica contra el crecimiento tumoral
in vivo
utilizando el modelo bien caracterizado cáncer 3LL. Nuestra razón fundamental para la administración de nanocápsulas CCL21-bóveda intratumoral es promover el reclutamiento de linfocitos T y CC en el microambiente tumoral para una actividad antitumoral robusta.
Como origen natural no inmunogénica, nanoescala, a base de proteínas cápsula, la partícula bóveda tiene el potencial de servir como un vehículo flexible de suministro terapéutico. Diseñado en el sistema de baculovirus, la partícula se auto-ensambla a partir de una única proteína expresada que pueden ser modificados para permitir la orientación de células, la endocitosis específica y la penetración endosoma [7], [8], [9], [30]. Las proteínas y péptidos fusionados a un dominio de bóveda de la orientación se empaquetan en la partícula, protegida del ambiente exterior y liberado lentamente. Este es el primer estudio para describir que las nanocápsulas de la bóveda pueden ser diseñados para empaquetar y retener CCL21 biológicamente activa. Nuestros resultados demuestran que, aunque bóvedas vacías y rCCL21 son cada quimiotáctico, el envasado de la quimiocina en bóveda sinérgicamente reforzada en la migración de células T, lo que sugiere que la liberación sostenida de CCL21 por la partícula bóveda puede establecer un gradiente de quimiotáctica empinada. Anticuerpos neutralizantes frente a CCL21 abrogadas la actividad quimiotáctica de la CCL21-bóveda que demuestra que la actividad quimiotáctica fue predominantemente CCL21 dependiente. Con base en los resultados de los experimentos de quimiotaxis, se evaluó el impacto de CCL21 bóvedas sobre la actividad DC APC. CCL21 bóvedas aumentados de actividad de APC DC y neutralización de CCL21 abrogadas esta actividad. En comparación con rCCL21, CCL21 bóvedas estimularon la actividad DC APC a niveles superiores a una décima parte de la concentración de rCCL21, lo que sugiere una mayor afinidad para el DC-nanocápsulas CCL21 bóveda.
Sobre la base de nuestra
in vitro
hallazgos, CCL21 bóvedas se evaluaron en un modelo de cáncer de pulmón terapéutica
in vivo
. Nuestros resultados demuestran que el diseño bóveda es eficaz en la inhibición del crecimiento de tumores establecidos. Una sola inyección intratumoral de CCL21 bóvedas condujo a una inhibición significativa del crecimiento tumoral en comparación con los controles. Nuestros datos sugieren que la formulación CCL21-bóveda es tan eficaz en comparación con las altas dosis frecuentes de rCCL21 [13]. En los dos modelos de tumores de pulmón subcutáneos y ortotópicos la terapia CCL21-bóveda se administró por vía intratumoral. En futuros estudios en la evaluación de la eficacia de los antígenos tumorales específicos rutas nanocaspsules bóveda de vacunación en los ajustes de protección y terapéuticos que incluyen
iv
o
ip
rutas de entrega, los cambios en el plasma /suero de las transaminasas habrá cuantificado los efectos de la bóveda sobre la función hepática. Aunque en el ensayo de migración, las bóvedas de control demostraron actividad quimiotáctica, bóvedas de control no afectaron el crecimiento del tumor en comparación con el grupo de tratamiento diluyentes. Esto sugiere que CCL21 es el componente crítico en la bóveda de nanocápsulas para la inducción de la actividad antitumoral. En futuros trabajos se proyectarán tanto las proteínas pro-apoptóticos y anti-apoptóticas en los tumores para determinar los cambios en la respuesta a la terapia de nanocápsulas CCL21-bóveda para explorar de manera mecánica los programas de apoptosis inducida por este tratamiento.
In vivo
, CCL21 contiene bóvedas humanos fueron tan eficaces como el murino CCL21-bóveda en la reducción de crecimiento del tumor 3LL (datos no mostrados). En comparación con los controles, el tratamiento CCL21-bóveda como resultado una amplia T tumoral y CC infiltrados leucocitarios.