Extracto
Antecedentes
La asociación del virus de la leucemia murina xenotropic relacionada con el virus (XMRV) con cáncer de próstata sigue recibiendo mayor atención ya que los estudios informan de la prevalencia de XMRV discrepantes que van desde cero hasta 23%. No está claro si las diferencias en las pruebas de diagnóstico, gravedad de la enfermedad, la geografía, u otros factores dan cuenta de los resultados discordantes. Presentamos aquí la prevalencia de XMRV en una población con cáncer de próstata bien definidos y RNasa L polimorfismo. Utilizamos los ensayos de PCR y Western blot (WB) ampliamente reactivos para detectar la infección por XMRV y el virus de la leucemia murina relacionados (MLV).
Metodología /Principales conclusiones
Hemos estudiado muestras de 162 pacientes diagnosticados de EE.UU. con cáncer de próstata con un intermedio a la etapa avanzada (puntuación de Gleason de 5-10; moderada (46%) tumores mal diferenciados (54%)). ADN tejido prostático se puso a prueba mediante ensayos de PCR que detectan XMRV y MLV variantes. Para evitar la contaminación con el ADN del ratón, también diseñamos y utilizamos una prueba de ADN de PCR específicos de ratón. Se utilizó el análisis filogenético detallada para inferir relaciones evolutivas. RNasa L tipificación mostró que el 9,3% eran homocigóticos (QQ) para la mutación R462Q L de RNasa, mientras que el 45,6% y el 45,1% eran homocigotos o heterocigotos, respectivamente. Las pruebas serológicas se realizó mediante una prueba de WB. Tres de ADN tejido prostático 162 (1,9%) fueron PCR positivos para XMRV y tenía ADN de ratón indetectable. Ninguno era homocigótica para la mutación QQ. El plasma de las tres personas fue negativo para ARN viral mediante RT-PCR. Todos los 162 pacientes fueron WB negativa. El análisis filogenético inferirse una XMRV distinta.
Conclusiones y su significado
Se encontró una prevalencia muy baja de XMRV en pacientes con cáncer de próstata. La infección fue confirmada por el análisis filogenético y la ausencia de contaminación de ADN de ratón. El hallazgo de anticuerpos indetectables y viremia en los tres pacientes puede reflejar la infección latente. Nuestros resultados no apoyan una asociación de XMRV o MLV variantes con cáncer de próstata
Visto:. Switzer WM, Jia H, H Zheng, Tang S, Heneine W (2011) Sin Asociación de Xenotropic Virus de la leucemia murina relacionada Los virus con el cáncer de próstata. PLoS ONE 6 (5): e19065. doi: 10.1371 /journal.pone.0019065
Editor: Paul Dent, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos de América
Recibido: 3 Febrero 2011; Aceptado: March 15, 2011; Publicado: 4 Mayo 2011
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0
Financiación:. Los fondos para el estudio fue proporcionado por los Centros para el Control y la Prevención de por créditos anuales en el Gobierno de los Estados Unidos la enfermedad. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es uno de los de crecimiento más frecuente, lenta, neoplasias no cutáneas de los hombres en el mundo en desarrollo [1]. Por ejemplo, se estima que más de 192.000 hombres en los EE.UU., en su mayoría de ascendencia afroamericana, serán diagnosticados con cáncer de próstata este año [2], [3]. Aunque la historia natural del cáncer de próstata es actualmente desconocido, múltiples etiologías han sido propuestos, incluyendo defectos genéticos [4], [5], [6]. virus En 2006, utilizando microarrays y análisis de virus de la leucemia murina xenotropic RT-PCR (MLV) -relacionados (XMRV) se identificó primero en aproximadamente 40% de los pacientes de cáncer de próstata familiares que contienen la mutación R462Q en el gen de la RNasa L, un componente de la antiviral la inmunidad innata [7]. MLV son gammaretroviruses endógenos que se han integrado en el genoma del ratón y pueden causar cáncer, enfermedades neurológicas y trastornos de inmunodeficiencia en ratones y se clasifican en tres grupos en función de su tropismo de acogida [8]. Xenotropic MLV (XMLV) sólo se reproducen en células no-ratón. Por el contrario, ecotropic MLV (EMLV) replicar sólo en ratones, mientras que politrópico MLV (pMLV) tienen un tropismo más amplio y se puede replicar en el ratón y no de ratón hosts [8]. XMRV acciones alrededor del 93% y de identidad de nucleótidos con 89% XMLV y pMLV en todo el genoma [7]. La identificación de una posible causa viral del cáncer de próstata es muy significativo, ya que podría facilitar el tratamiento y la prevención de esta enfermedad debilitante
.
La evidencia adicional para la infección por XMRV de las personas con cáncer de próstata se ha informado en un estudio que nos muestra un mayor prevalencia de la detección de ADN XMRV por PCR (6%) y las proteínas virales por inmunohistoquímica (IHC) (23%) en los tejidos de la próstata de pacientes con cáncer 334 de la próstata en comparación con los 101 controles benignos (1,9% por PCR y 3,9% en IHC) [9] . Este estudio también informó del hallazgo de XMRV con mayor frecuencia en pacientes con un grado del tumor de próstata más alta que sugiere una relación causal entre el virus y la enfermedad. Una tendencia similar se informó en otro estudio que reportó una tasa de prevalencia del 22% XMRV en pacientes con cáncer de próstata de Texas, pero se encontró virus en ambos tejidos tumorales y no tumorales [9], [10]. XMRV anticuerpos neutralizantes fueron identificados recientemente en 11 de 40 (27,5%) pacientes con cáncer de próstata de Estados Unidos y secuencias XMRV fueron confirmados en cinco de estas 11 personas mediante el uso anidado de ADN por PCR y la hibridación fluorescente in situ (FISH) [11].
Por el contrario, los estudios en Europa y dos de los EE.UU. informaron poca o ninguna infección por XMRV [12], [13], [14], [15], [16]. Un estudio de pacientes con cáncer de próstata alemanes y uno en Holanda encontró una prevalencia mucho menor XMRV (1/87, 1,2% y 3/74 = 4%, respectivamente) utilizando sólo RT-PCR y cebadores-XMRV específica [12]. Un segundo estudio más grande en Alemania usando una combinación de ADN y ARN PCR no encontró ninguna evidencia de infección por XMRV en 589 pacientes [14]. Además, los sueros de un adicional de 146 pacientes de cáncer de próstata eran todos negativos mediante el ensayo con un ELISA que incorpora sobre recombinante XMRV (Env), y proteínas Gag y por ensayos de inmunofluorescencia indirecta que expresan XMRV [14]. XMRV también no se encontró en el ADN de tejidos de 161 y 200 pacientes de cáncer de próstata a partir de dos poblaciones de Estados Unidos, respectivamente [13], [15]. El estudio realizado por Aloia
et al.
También no detectar proteínas XMRV en los tejidos de 596 adenocarcinomas prostáticos y 452 muestras de tejido benigno de la próstata mediante IHC [13].
Las razones de los resultados incongruentes XMRV no se conocen, pero pueden estar relacionados con diferencias técnicas en las pruebas de XMRV o a factores relacionados con las poblaciones de pacientes, incluyendo la etapa de la enfermedad, los factores genéticos, o agrupación geográfica. Los resultados discordantes similares también se han reportado recientemente por XMRV en personas con el síndrome de fatiga crónica (SFC) [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23], que incluye una Lo estudio realizado por
et. Al
informes secuencias pMLV-al igual que entre los pacientes con SFC estadounidenses [24]. La mayoría de los estudios de cáncer de próstata utilizados PCR con cebadores XMRV específica que no puede ser muy sensible para otras variantes MLV-como [7], [9], [10], [11], [12], [15], [dieciséis]. Además, la mayoría de los estudios no se han realizado pruebas serológicas para anticuerpos que son características de las infecciones retrovirales y puede, por lo tanto, proporcionar evidencia adicional de que la infección no es específica de tejido.
Presentamos aquí las pruebas de XMRV de un bien cohorte caracterizado de 162 pacientes de cáncer de próstata de los EE.UU. mediante el uso de una combinación de ensayos serológicos y de PCR capaces de detectar XMRV y pMLV. También se midió la distribución de la RNasa L mutación QQ para evaluar la asociación de XMRV con este alelo mutante [7]. También hemos utilizado una prueba de PCR sensible para detectar la contaminación con el ADN murino y excluir los resultados de PCR positivos falsos. Nuestros resultados muestran que el XMRV es poco frecuente en esta población de pacientes y no apoyan una asociación de este virus con el cáncer de próstata.
Resultados
secuencias XMRV raras en los tejidos tumorales de pacientes con cáncer de próstata
secuencias
ß-actina fueron detectados por PCR en los extractos de ADN de todos los tejidos de la próstata que confirman su integridad para las pruebas de PCR. ADN de sólo dos (5956 y 6203) de 162 pacientes (1,23%) dio positivo por secuencias XMRV en la selección inicial (Fig. 1, Tabla 1). De las 77 muestras de ADN que se someten además por triplicado por el
pol
ensayo de PCR, sólo un paciente (5935) (1,3%) se encontró positivo. Este espécimen fue positivo en sólo una de las tres repeticiones. Por lo tanto, la prevalencia global de la PCR fue 3/162 o 1,85%. El paciente fue positivo para 5956
gag
y
pol
secuencias en 3/5 y 4/6 de ensayos repetidos, respectivamente, y
env fueron también detectados en
secuencias 1/3 ensayos repetidos (Tabla 2). Espécimen 5956 también fue positiva en los tres replicados
pruebas pol
PCR. Sólo XMRV
pol
y
env secuencias
fueron detectados en el ADN del tejido de la próstata del paciente 6203 en 1/4 y 1/1 de ensayos repetidos, respectivamente. Las pruebas adicionales de ADN extraído de otra sección de tejido de próstata de 6203 fue repetidamente negativos, reflejando probablemente una distribución desigual de baja XMRV copia en este tejido. ADN de los tres pacientes en repetidas ocasiones resultaron negativos a ADNmt murino que demuestra la ausencia de contaminación de ADN de ratón. Para la prueba de viremia se analizaron extractos de ARN a partir de muestras de plasma de los tres pacientes. Todas las muestras tenían secuencias no detectables por los ensayos de QRT-PCR y nRT-PCR.
Representante anidada
pol
resultados de la PCR utilizando el ADN del tumor de próstata. Los carriles 1-24, pacientes de cáncer de próstata, incluyendo pacientes 5956 (carril 8) y 6203 (carril 19); carril 25, el control de ADN de PBMC humano negativo; carriles 26 y 27, el agua sólo controla para las pruebas de PCR primarias y anidadas, respectivamente; carriles 28 y 29, los controles de la sensibilidad del ensayo que consiste en 10 y 10
3 copias de ADN plásmido XMRV VP62 diluidos en un fondo de 1 ug de ADN de PBMC humana, respectivamente.
identificación de la diversidad XMRV en pacientes con cáncer de próstata
mostró que los pacientes 5935, 5956 y 6203 están infectados con cepas variante XMRV. El 168-bp
pol
secuencias de los tres pacientes mostraron 90,5 a 100% de identidad de nucleótidos entre sí, desde 94 hasta 100% a XMRV, 91,7-98,8% a XMLV, 94-100% a pMLV, y 91 -100% a ecotropic MLV (EMLV) en esta región corta. 164 pb
env
secuencias de personas 5956 y 6203 eran idénticos entre sí y se comparte la identidad de nucleótidos más alta (94,9 a 100%) para el XMRV y otras cepas MLV xenotropic, respectivamente, [25]. El
env
secuencias de ambas personas eran muy divergentes de EMLVs que comparten una identidad de nucleótidos sólo alrededor del 46%. 413 pb
gag
sólo secuencias fueron amplificados a partir del ADN de tejido de la próstata persona 5956 y tenía una identidad de nucleótidos aproximadamente el 98% de XMRV, pero era idéntica a una mERV xenotropic encuentra en el cromosoma del ratón 8 (# de acceso GenBank AC127575).
el análisis filogenético de la
env secuencias
inferirse tres grupos distintos con fuerte apoyo de arranque sobre la base de tropismo viral como se esperaba, ya que esta región incluye una porción de la membrana de la superficie viral implicada en el tropismo celular (Fig . 2a). El
env
secuencias de ambos pacientes agrupados con secuencias XMLV pero eran distintos de XMRV ya se ha informado y pMLV prototípico (Fig. 2a). Por el contrario, las relaciones filogenéticas inferidas de
pol
secuencias de todos los grupos MLV mostraron que esta región no racimo por parte de la gama de huéspedes (Fig. 2b). Los tres
pol
secuencias de los pacientes con cáncer de próstata forman un linaje bien soportado que contiene un recombinante Moloney MLV neuropatogénico (cepa ts-1-92b,#de acceso GenBank AF462057) (Fig. 2b). XMRV
pol
secuencias de pacientes con cáncer de próstata se informó anteriormente (codificados con VP), excepto dos (VP29 y VP184, proporcionado amablemente por Joe DeRisi), agrupado con los de las personas con síndrome de fatiga crónica (estará con WPI) con arranque significativa apoyo.
pol
secuencias de VP29 y VP184 eran idénticos entre sí, pero 1,2% divergente de otra XMRV y formaron un grupo débilmente apoyada contiene una mezcla de EMLV y pMLV (Fig. 2b). Estos resultados demuestran una diversidad más amplia de XMRV en esta región que visto anteriormente, pero son consistentes con la recombinación con Moloney MLV como se informó recientemente [7], [25]. VP29, VP79, VP86, VP88, VP90, y VP184 son pacientes con cáncer de próstata reportados en la Urismann
et al.
Papel, pero para los que el XMRV
pol
secuencias aún no están disponibles en el GenBank [ ,,,0],7]. Se acaba de informar
gag
y
pol
secuencias que se encuentran en la línea celular tumoral humana de ADN fueron colocados fuera de las regiones utilizadas en nuestro estudio y por lo tanto no se incluyeron en los análisis [25].
A. envolvente (
env
), B. polimerasa (
pol
), y C.
gag
. La estabilidad de la topología del árbol fue probada usando 1000 repeticiones de arranque, tanto en los métodos de máxima verosimilitud (ML) vecino unirse (NJ) y. los valores de arranque & gt; 60 se muestran en los principales nodos (NJ /ML). Nuevas secuencias del presente estudio están en caja. números de acceso a las secuencias de MLV prototípicos disponibles en GenBank son XMRV VP35 = DQ241301, XMRV VP62 = DQ399707, XMRV VP42 = DQ241302, XMRV WPI-1106 = GQ497344, XMRV WPI-1178 = GC497343, XMRV PCA1-PCA17 = GU812341-GU812357, MLV DG -75 = AF221065, MLV RCTM = NC_001702, MLV AKV = J01998, MLV BM5eco = AY252102.1, Moloney MLV = J02255, Moloney MLV neuropthogenic variante ts1-92b = AF462057, Rauscher MLV = NC_001819, amigo MLV = X02794, mERV Chr 7 = AC167978, mERV Chr 7 = AC127565, mERV Chr 8 = AC127575, mERV Chr 12 = AC153658, mERV Chr 9 = AC121813, mERV Chr 4 = AL627077, mERV Chr 1 = AC083892), XMLV A2780 = FR670594, XMLV BHY = FR670595, XMLV Daudi = FR670596, FR670597 XMLV EKVX =, XMLV IMR-5 = FR670598, XMLV MUTZ-1 = FR670599, XMLV S-117 = FR670600, XMLV TYK-nu = FR670601. Secuencias denotan RAW son de la politrópico MLV aislado en células HeLa utilizadas para desarrollar la prueba de WB en el local. Secuencias codificadas como VP XMRV y el PCA y el IPM son por cáncer de próstata y los pacientes con SFC, respectivamente. cáncer de próstata adicional paciente VP
gag
y
pol
secuencias fueron amablemente proporcionados por los Dres. Robert Silverman y Joe Derisi. tropismo viral, según lo determinado por análisis de
env secuencias
, está indicado por el azul (xenotropic), púrpura (politrópico), y esferas (ecotropic) amarillo.
El
gag
secuencia de paciente 5956 agrupado con secuencias XMRV de un paciente de cáncer de próstata (VP88), una mERV xenotropic encontrado en el cromosoma del ratón 8, y una secuencia de pMLV identificado en un donante de sangre (BD-28) por Lo
et al.
(Fig. 2c) [24]. Este linaje fue entre clados que contienen XMRV por cáncer de próstata y los pacientes con SFC y la mayoría de PMLVs y las MLV restantes se encuentran en el Mín
et al.
Estudio [24]. Una pMLV prototípico (MCF1233) agrupado con todas EMLVs y dos XMRVs, lo que sugiere que es un recombinante en esta región (Fig. 2c).
Estos resultados filogenéticos también sugieren la región corta de
env
el blanco de nuestro nuevo ensayo de PCR es útil para determinar el tropismo viral para la tipificación de las secuencias relacionadas con MLV. Esta información puede ser útil para comprender el origen de las secuencias identificadas en los seres humanos PCR-positivos. Por el contrario, el
gag Opiniones y
pol
regiones mostraron menos agrupamiento por tropismo viral que indica la recombinación en estas regiones. Por ejemplo, el
gag
secuencias de XMLVs prototípicos (RCTM), EMLVs (AKV, BM5eco), y PMLVs (MCF1233) agrupados junto con el apoyo muy significativo de arranque (Fig. 2a).
topologías de árboles filogenéticos casi idénticos para cada región del gen se obtuvieron con los dos métodos NJ y ML. Las secuencias de XMRV de ambos pacientes de cáncer de próstata también eran distintas de las secuencias de pMLV amplificados a partir de la línea celular murina (RAW) que se utiliza para la preparación de antígenos de WB que demuestran, además, que estos no son contaminantes de laboratorio (Fig. 2). Estos resultados confirman la presencia de XMRV en ambos pacientes y demuestran que la diversidad es mayor que el XMRV aprecia actualmente.
Las secuencias XMRV presentados en el trabajo actual están disponibles en GenBank con los números de acceso HM003608-HM003612, y HQ116790. Secuencias de otros estudios con pacientes con cáncer de próstata XMRV positivo no estaban disponibles en el GenBank para su inclusión en nuestros análisis [9], [11], [12], [16].
La ausencia de anticuerpos en el plasma de la próstata pacientes con cáncer
Todos los cáncer de próstata 162 se encontraron muestras de plasma de pacientes que son negativos para anticuerpos frente a XMRV /MLV en la prueba de WB, incluyendo el plasma de personas 5935, 5956, y 6203 (Fig. 3). En la mayoría de los especímenes de plasma se observó cierto nivel de reactividad no específica para el antígeno no infectado pero sin evidencia de reactividad específica para Gag y /o proteínas Env en el blot antígeno infectada (Fig. 3).
marcadores de peso molecular (kD ) se proporcionan a la izquierda de la EDT en los paneles superiores. tamaños esperados de la mordaza viral (p30, la cápside (CA)), PR65, y la cubierta (env, GP69 /71), las proteínas se proporcionan en cada BM en los paneles superiores. WB resultados representativos de los once pacientes con cáncer de próstata, incluyendo pacientes 5956 y 6203 (indicados con asteriscos). Determinación de la reactividad específica MLV se determina por comparación de serorreactividad a antígenos HeLa infectadas-MLV xenotropic y no infectados HeLa antígenos en los paneles superior e inferior, respectivamente. Ra, Rauscher MLV entera de cabra virus de antisuero policlonal; Fr, amigo MLV sobres (/71 GP69) antisueros policlonal de cabra; pre-inmune, cabra suero antes de la inmunización.
RNasa L R462Q distribución alélica en la población de estudio y las características clínicas de las tres personas infectadas con XMRV
15 de las 162 personas ( 9.3%) se determinó que eran homocigóticos (QQ) para el L mutación R462Q RNasa, 74 (45,6%) tenían el alelo homocigotos RR, y 73 (45,1%) eran heterocigóticos (RQ) para la mutación (Tabla 1).
paciente 5935 es el heterocigoto RQ RNasa L genotipo. Él tiene un adenocarcinoma pobremente diferenciado con la puntuación de Gleason de 6, T2C estadio patológico, nivel de PSA de 4,6 ng /ml. Paciente 5956 es la de tipo salvaje homocigotos RR RNasa L genotipo. Él tenía un adenocarcinoma pobremente diferenciado con la puntuación de Gleason de 7, T3A estadio patológico, a /nivel de PSA 12,4 ng ml. Paciente 6203 es el heterocigoto RQ RNasa L genotipo, y tenía un adenocarcinoma moderadamente diferenciado con la puntuación de Gleason de 6, el estadio patológico T2C, y un nivel de PSA de 7.1 ng /ml. Por lo tanto, no hemos podido confirmar una asociación de la infección por XMRV con los homocigotos QQ RNasa L alelo. Dada la prevalencia de bajo XMRV, que no tienen el poder estadístico para determinar si existe una asociación de XMRV con el grado del tumor.
Discusión
Se utilizó la PCR y pruebas serológicas para estudiar la prevalencia de XMRV en 162 pacientes norteamericanos bien caracterizado con cáncer de próstata. Se encuestó a los cánceres con el intermedio de las fases avanzadas, y se utilizan múltiples ensayos de PCR, incluyendo pruebas con cebadores conservados para permitir la detección de diversas secuencias de XMRV y relacionados con el MLV. Casi la mitad de las muestras también se ensayaron por triplicado para maximizar la sensibilidad de detección de secuencias de bajo número de copias. Se utilizó un ensayo de WB ampliamente reactivos para poner a prueba todos los pacientes en busca de anticuerpos. Nuestros hallazgos documentan una prevalencia muy baja (1,9%) de las secuencias de ADN de XMRV en tejido de la próstata y la ausencia de anticuerpos positivos en todas las muestras. Combinar estos datos no apoyan una asociación de XMRV o relacionadas con MLV cáncer de próstata.
Los resultados predominantemente negativos de PCR se observaron a pesar de la utilización de 1 ug de ADN que es 4-10 × más alta que la entrada de ADN utilizado en estudios previos que han reportado la detección de XMRV [7], [9], [14], [16]. Del mismo modo, la baja prevalencia observada de XMRV no puede explicarse por una disminución de la sensibilidad del ensayo de PCR, ya que exhibió muestras con el mismo ensayo utilizado originalmente por Urisman
et al.
[7]. En las tres muestras con secuencias detectables, hemos observado que el número de copias era muy bajo como PCR anidado y replicar las pruebas con frecuencia necesaria para la detección. Es importante destacar que, en las tres muestras no se pudo detectar ratón ADNmt a pesar del uso de un ensayo altamente sensible, lo que sugiere que la fuente de XMRV es poco probable que el resultado de la contaminación con el ADN del ratón. Estos resultados son importantes ya que la contaminación de ADN de ratón se informó de que la fuente de XMRV en un estudio reciente de los tejidos de cáncer de próstata [26]. Los autores de este estudio utilizó un ensayo de PCR para el ratón intracisternal Una partícula (IAP), que se informó a ser más sensible que un ensayo basado en ADN mitocondrial D-loop-ratón específico [26]. Aunque las muestras de ADN no estaban disponibles para la prueba en la prueba de IAP, se ha encontrado que el ensayo de IAP es igualmente sensible a nuestro ensayo ADNmt en tiempo real COX2 (datos no mostrados), excluyendo así una mayor contaminación de ADN de ratón como fuente de nuestro PCR positivo resultados. Además, las muestras de ADN se prepararon a FCCC donde sólo especímenes biológicos humanos, y no las líneas celulares, se manejan, reduciendo aún más la posibilidad de contaminación murino.
El análisis de secuencia de las muestras de PCR-positivos fue muy informativo porque se confirmó que los tres especímenes fueron XMRV-relacionado. Además, el hallazgo de una cepa viral en pacientes con cáncer de próstata tres que es distinta de la XMRV visto en estudios anteriores es significativo y demuestra una diversidad más amplia viral [7], [9], [14], [16]. Esto sería un resultado esperado en consonancia con la evolución del virus durante la propagación y la persistencia. La ausencia de anticuerpos y la viremia plasmática en estos tres pacientes es notable porque puede reflejar infecciones latentes o secuestrados. La pérdida de anticuerpos durante una infección latente, mientras atípica de la mayoría de las infecciones retrovirales, se ha descrito previamente para la infección natural de macacos con simios de tipo D retrovirus (SRV) [27]. SRV en macacos se asocia con brotes de inmunodeficiencia severa en colonias de primates y la infección latente SRV en estos animales negativos de anticuerpos se confirma con una mayor sensibilidad mediante el análisis por PCR [27]. Nuestros resultados también son consistentes con las observadas recientemente en macacos infectados experimentalmente con XMRV en el que los tejidos en la necropsia son PCR-positivo, pero viremia y la detección de provirus en PBMCs desaparecen rápidamente, seguido por la pérdida de detección de anticuerpos [28], [29]. Aunque un estudio informó de la detección de anticuerpos XMRV neutralizante en 11 pacientes con cáncer de próstata, estos datos no fueron confirmados por métodos más sensibles como el Banco Mundial, o por la prueba de PCR en todos los casos, y por lo tanto pueden representar la reactividad no específica [11], [17 ]. Los estudios longitudinales pueden definir mejor las respuestas del huésped a la infección por XMRV.
Nuestra población de estudio contenía 15 personas con el mutante QQ RNasa L alelo. Sin embargo, ninguno fue XMRV-positivo, lo que contrasta con los hallazgos originales de Urismann
et al.
[7]. Las personas infectadas con XMRV de nuestro estudio tenían ya sea de tipo salvaje homocigotos (RR) o heterocigóticos alelos (RQ) RNasa L R462Q. Nuestros resultados son consistentes con otros estudios estadounidenses y europeos que también identificaron las frecuencias más altas de la QQ homocigotos alelo mutante en personas XMRV-negativas [9], [10], [16]. En conjunto, estos resultados sugieren que la infección por XMRV no está asociado con esta forma alélica de la RNasa L.
A pesar de que nuestros datos no apoyan una asociación de cáncer de próstata con el XMRV, es importante entender si el XMRV tiene ningún papel causal en el cáncer de próstata cuando se detecta poca frecuencia. En general, gammaretroviruses como XMRV inducir la transformación maligna por mutagénesis de inserción, de modo que las células malignas en un tumor se infectan todos clonal. Este mecanismo de la carcinogénesis se ha encontrado en animales, así como en niños expuestos a vectores derivados de MLV en los ensayos de terapia génica [30], [31]. Por lo tanto, la baja frecuencia de las células infectadas con XMRV encontrados en los tres pacientes son incompatibles con una función directa del XMRV en la carcinogénesis de próstata en estos pacientes. Anteriormente, una línea celular de cáncer de próstata humano, 22Rv1, se ha demostrado que expresan altos niveles de XMRV, un hallazgo que apoya un papel del XMRV en la tumorigénesis del cáncer de próstata [32]. Sin embargo, se informó recientemente que el XMRV expresada por 22Rv1 puede no ser de origen humano, pero lo más probable surgió a través de la recombinación de superposición de dos genomas XMRV como durante el paso del tumor de próstata en ratones endogámicos (T. Paprotka
y col .
18
ª Conferencia sobre Retrovirus e Infecciones oportunistas). Por otra parte, otros han demostrado que los sitios de integración XMRV clonados a partir de tejidos de la próstata de dos de los nueve pacientes puede haber sido el resultado de la contaminación con el ADN de las células DU145 infectados experimentalmente [33], mientras que otros sitios de integración XMRV no son cerca de los genes supresores de tumor o proto- oncogenes [34]. En conjunto, estos resultados plantean preguntas sobre el papel de XRMV en el cáncer de próstata. Sin embargo, se necesita más trabajo para comprender mejor la prevalencia de XMRV y MLV en los seres humanos y su papel en la enfermedad humana.
Materiales y Métodos
Estudio de la población
Anónimo, archivada plasma y tejido de próstata estaban disponibles de 162 pacientes con cáncer de próstata estadounidenses recogidos por el Centro Fox Chase cáncer (CMCC) Fondo para muestras biológicas repositorio central entre 1997 y 2004. las muestras de sangre se recogieron en el momento de la prueba previa a la cirugía o el mismo día de la cirugía antes de la anestesia de pacientes con cáncer de consentir como parte de un estudio aprobado por el Comité de sujetos Humanos CMCC. escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los participantes. El Comité de Ética Sujetos Humanos aprobó FCCC recogida, el almacenamiento, y la prueba futuro de las muestras recogidas de todos los participantes en el estudio que consienten. Una determinación no investigación fue aprobado para las pruebas de las muestras anónimas de los CDC para el XMRV y virus relacionados. La edad al momento del diagnóstico de las 162 participantes varió de 36 a 71 años de edad, con una media y la mediana de 57 años. 86% eran caucásicos, 12% afroamericanos y 1% asiáticos, no registrada, u otro. El antígeno prostático específico en suero promedio y la mediana de los niveles (PSA) fueron 7,22 ng /ml y 5,5 ng /ml, respectivamente. El grado del tumor de 75 de 162 (46%) de los participantes fue moderadamente diferenciado, mientras que el 54% tenían tumores mal diferenciados. Utilizando el sistema de Gleason, el 42% de la población estudiada tenía grado 5-6 del cáncer, el 40% tenía el grado 7 y el 18% tienen adenocarcinoma de grado alto (puntuación de Gleason 8-10). La estadificación patológica clasifica los tumores de próstata como T1C (0,6%), T2A (9,3%), T2B (3,1%), T2C (61,7%), T3A (17,9%), T3B (5,6%), y T4 (1,8%).
preparación de la muestra
El plasma se dividen en partes alícuotas y se almacenaron a -80 ° C dentro de las 4 horas de la extracción de sangre. Las muestras de plasma se tomaron alícuotas de nuevo en el CDC después de la descongelación de las pruebas serológicas; las alícuotas restantes fueron congeladas a -80 ° C. Las muestras de ADN se prepararon mediante extracción con fenol-cloroformo de tejidos de la próstata en FCCC usando procedimientos estándar. Sólo los tejidos humanos son procesados en CMCC. Para muestras seleccionadas se utilizó el minikit de ADN QIAamp (Qiagen, Carlsbad, CA) en la CDC. Para plasma RT-PCR la prueba de un volumen de 0,5-1,0 ml se ultracentrifugó a 45.000 rpm para concentrar virus. 360 ul a 860 ul de plasma sobrenadante fue cuidadosamente eliminado y el sedimento se resuspendió en 140 ul de plasma centrifugado que queda en el tubo y luego se extrajo el ARN usando el minikit QIAamp Viral RNA (Qiagen, Valencia, CA). las concentraciones de ácido nucleico se determinaron por espectrofotometría utilizando el instrumento Nanodrop (Thermo Scientific, Wilmington, DE). Integridad de los especímenes de ADN y ARN se determinó utilizando ß-actina o GAPDH PCR, respectivamente, como se describe [35], [36]. Toda la preparación de muestras, cultivo de tejidos, y las pruebas de PCR se realizaron en salas aisladas físicamente para evitar la contaminación.
Detección molecular del XMRV
Para detectar el XMRV y otras variantes MLV hemos utilizado los ensayos de PCR separadas con cebadores específico para la detección de XMRV, o cebadores conservados para la detección genérica de MLV y XMRV, como se describe anteriormente [21]. muestras de ADN fueron seleccionados utilizando dos ensayos de PCR anidadas. El primer ensayo utiliza la PCR primers GAGOF, Gągor, GAGIF, y GAGIR empleado por Urismann
et al.
Y por Lombardi
et al.
Para detectar el XMRV 413 pb
gag
secuencias en pacientes con cáncer de próstata y en las personas con síndrome de fatiga crónica, respectivamente [7], [18]. El segundo ensayo de PCR detecta genéricamente MLV y XMRV polimerasa (
pol
) sobre secuencias de 216 pb de longitud usando el XPOLOF cebadores, XPOLOR, XPOLIF, y XPOLOR [21]. Tanto el
gag
y
pol
pruebas de PCR puede detectar 10 copias de ADN de plásmido XMRV diluido en un fondo de 1 ug de ADN humano [21]. Muestras que dieron resultados positivos ya sea para
gag
o
pol
secuencias fueron re-probaron con ambos ensayos y también se probaron con una tercera prueba de PCR anidada para el sobre XMRV (
env
) secuencias que también es genérico para XMRV /MLV. El XENVOF externa (5 'GGG GAT CTT GGT GAG GGC AGG AGC 3') y XENVOR (5 'CAG AGA GAA CAG GGT CAC CGG GTC 3') y cebadores XENVIF interna (5 'AGG GCT ACT GTG GCA AAT GGG GAT 3' ) y XENVIR (5 'CCT TTT ACC CGC GTC AGT GAA TTC 3') amplificar un 215-bp
env
secuencia. Además, un subconjunto de muestras (n = 77) para los que se disponía de suficiente ADN fueron analizadas por triplicado utilizando el
pol
ensayo de PCR anidada para mejorar la detección de bajo número de copias XMRV /MLV.
PCR se realizó con 1 ug de ADN de tejido de próstata en un volumen de reacción de 100 ul utilizando condiciones estándar de 94 ° C durante 30 seg, 50 ° C durante 30 seg, y 72 ° C durante 45 seg para 40 ciclos en un ABI 9700 termociclador ( Foster City, CA). Los productos de PCR se visualizaron por electroforesis en un gel de agarosa 1,8% teñido con bromuro de etidio. Para aumentar la sensibilidad y especificidad de los ensayos, se amplifica
gag
,
pol
, y
env
secuencias fueron confirmados por análisis de transferencia de Southern usando las oligosondas biotina XGAGP2 (5 ' ACC TTG CAG CAC TGG GGA GAT GTC 3 '), XPOLP (5' ATG TTG AGG CAC TGC ACA GAG CAC 3 '), y XENVP (5' TGG GCT CCG GTA GCA TCC AGG GTG 3 ') y la detección de quimioluminiscencia. Al igual que el XMRV
gag
y
pol
ensayos de PCR [21], el nuevo XMRV
env
prueba de PCR también fue capaz de detectar 10 copias de plásmido XMRV en un fondo de 1 ug de ADN humano (30/32, 93,8%). No se detectó ninguna XMRV /MLV secuencias de ADN en PBMC de 41 donantes de sangre de los Estados Unidos utilizando cada una de las tres pruebas de PCR anidada [21].
Muestras
XMRV cuantitativa RT-PCR ARN
plasma de las personas con resultados positivos XMRV de PCR en el ADN de tejido de próstata se ensayaron adicionalmente para el ARN viral mediante dos pruebas RT-PCR. El primer ensayo, se denomina q
Pro Trial utiliza MLV /XMRV proteasa genérica (
Pro Trial) cebadores Taqman Pro-UNV-F1 (5 'CCT GAA CCC AGG ATA ACC CT 3') y Pro-UNV-R1 (5 'GTG GTC CAG CGA CGC TAC T 3') y sondas Pro-UNV-P1C (FAM5 'AGA TAC TGG GGC CCA ACA CTC CGT GCT GAC 3'BHQ1) y Pro-UNV-PR1 ( CCT FAM5 'GTA CCA CCG CCT TGG CAC CAG GC 3'BHQ1). Los resultados y conclusiones de este informe son las de los autores y no representan necesariamente los puntos de vista de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades.