Extracto
modelos de co-cultivo están actualmente reduciendo la brecha entre las culturas clásicas y
y modelos animales in vivo. La exploración de este nuevo enfoque abre la posibilidad de imitar el microambiente tumoral
in vitro
, a través del establecimiento de cáncer-estroma interacciones sinérgicas. En particular, estos modelos organotípicos ofrecen una plataforma ideal para el desarrollo y la evaluación preclínica de candidatos nanoportadores cargadas con fármacos anti-tumorales en un modo de cribado de alto rendimiento, con menores costes y ausencia de problemas éticos. Sin embargo, esta evaluación ha sido hasta ahora limitada a los sistemas de co-cultivo de células establecidas con proporciones precisas, no abordar la heterogeneidad celular natural se encuentra comúnmente en diferentes tumores. Por lo tanto, en el presente documento la eficiencia nanovehículos multifuncional se caracterizó en los diferentes sistemas de fibroblastos-MCF-7 de co-cultivo que contienen diferentes proporciones de células, con el fin de desentrañar los parámetros clave de diseño que influyen en el rendimiento nanotransportador y el resultado terapéutico. El éxito del establecimiento de los modelos de co-cultivo se confirmó por la distribución tisular similar de las diferentes células en cultivo. Las nanopartículas de incubación en los diversos sistemas de co-cultivo revela que estos nanovehículos poseen la orientación especificidad para las células cancerosas, lo que indica su idoneidad para ser utilizado en esta terapia enfermedad. Además, mediante el uso de diferentes proporciones de co-cultivo, se obtuvieron diferentes perfiles de captación de nanopartículas. Estos hallazgos son de importancia crucial para el futuro diseño y optimización de nuevos sistemas de liberación de fármacos, ya que su capacidad real de focalización debe abordarse en las poblaciones de células heterogéneas, tales como las que se encuentran en los tumores
Visto:. Costa CE, Gaspar VM, Marques JG, Coutinho P, Correia IJ (2013) Evaluación de las nanopartículas de captación en modelos de cáncer de co-cultivo. PLoS ONE 8 (7): e70072. doi: 10.1371 /journal.pone.0070072
Editor: Michiya Matsusaki, Universidad de Osaka, Japón
Recibido: 25 de Enero, 2013; Aceptado: 15 de Junio de 2013; Publicado: July 26, 2013
Derechos de Autor © 2013 Costa et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por la Fundación para la Ciencia y la Tecnología (FCT), SFRH /BD /80402/2011, PTDC /EME-TME /103375/2008, PTDC /EBB-BIO /114320/2009 y Pest-OE /EGE /UI4056 /2011. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
en la última década, el desarrollo emergente de la nanomedicina ha animado a su rápida aplicación en el desarrollo de numerosas estrategias para el tratamiento de las plagas que afecten, que todavía son incurables [1]. En la actualidad, los tremendos avances tecnológicos realizados en el diseño y producción de sistemas nanoparticulados para la terapia del cáncer ha originado el resultado de evermore nanoportadores competentes y específicos de la diana, que reducen los efectos secundarios asociados con los tratamientos clásicos contra el cáncer y también aumentan paciente tasa de supervivencia [ ,,,0],2]. A menudo compuesta por materiales inorgánicos u orgánicos biocompatibles, nanovehículos también son capaces de aumentar la biodistribución y biodisponibilidad de los fármacos, que de otro modo sería mal disponible en sus sitios diana [3]. La naturaleza flexible de las nanopartículas se correlaciona íntimamente con los distintos materiales utilizados para su síntesis, tales como metales (oro y plata), cerámica (hidroxiapatita), lípidos (colesterol y no tóxicos, fosfolípidos) y polímeros (alginato, quitosano, PEG,) [4]. Entre éstos, el quitosano ha sido uno de los más ampliamente utilizado para la síntesis de una variedad de sistemas de suministro de fármacos nanoparticulados, debido a sus propiedades únicas como biocompatibilidad, estabilidad, facilidad para ser modificado químicamente y baja inmunogenicidad [5]. Estas características únicas se pueden adaptar aún más por la funcionalización de la superficie de la partícula con las moléculas de células específicas tales como anticuerpos, ácido fólico, biotina, o aptámeros [6], [7], que aumentan significativamente la especificidad nanotransportador hacia las células diana, la protección de las células normales contra las drogas efectos secundarios tóxicos -derivado [8].
Sin embargo, antes de la gran cantidad de nanodispositivos actualmente bajo investigación se convierta en adecuado para su uso clínico, tienen que superar rigurosas pruebas establecidas por las agencias reguladoras tales como la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA ) y la Agencia Europea de Medicamentos (EMEA). Incluido en las diversas etapas de evaluación que nanoportadores tienen que superar, los ensayos de seguridad y la actividad biológica asumen relevancia fundamental en el desarrollo de nanopartículas de tuberías [9], [10].
En particular, para estos propósitos de prueba, surgen los cultivos celulares como una herramienta extraordinariamente potente y económico, en comparación con
in vivo y modelos. De hecho, ofrecen una plataforma de prueba única para investigar los efectos de diferentes formulaciones de fármacos y de los diseños de nanopartículas, bajo muy controlado y condiciones reproducibles [11]. Por otra parte, los cultivos celulares proporcionan una manera fácil de manipular numerosas variables experimentales con el fin de reproducir algunos de los
in vivo
condiciones, al tiempo que evita los problemas éticos y legales asociados con el manejo de los animales [12]. Sin embargo, hasta ahora la organización espacial de los tejidos y las interacciones célula-célula se comúnmente se tomarán en cuenta para la mayoría de la disposición
in vitro
modelos [12]. Para superar tales limitaciones una nueva categoría de cultivos de células, denominado co-cultivos, actualmente está siendo desarrollado [13]. Este nuevo concepto fue diseñado con el propósito de cubrir la falta de correlación entre los cultivos celulares clásicos y
in vivo
sistemas (Figura 1) [12]. Mediante el uso de co-cultivos es posible recrear algunos de los
in vivo
nichos de tejidos [14], ya que las interacciones célula-célula se establecen en estrecho contacto. Este parámetro crítico es esencial para el establecimiento de la morfología celular, el fenotipo, el metabolismo y la proliferación, las características que están presentes
in vivo
[15], [16], [17], [18]. Además, co-cultivos también son una herramienta perfecta para analizar la especificidad de orientación de los sistemas de administración de fármacos para las células tumorales [19].
La célula culturas son capaces de imitar
in vivo
tejidos sin las cuestiones éticas y los costos asociados con la experimentación animal.
en la actualidad, el cáncer de mama es una de las neoplasias más investigado [13]. Esta enfermedad es la causa más común de muerte por cáncer en mujeres en todo el mundo [20], [21]. microambiente del cáncer de mama está compuesta no sólo por las células cancerosas, pero también por los fibroblastos, adipocitos, los capilares sanguíneos, células endoteliales, células del sistema inmune y las proteínas de la matriz extracelular (ECM) [13], como el colágeno y la elastina. A pesar de ser aceptada que el cáncer puede surgir en general, a partir de mutaciones genéticas [22], el crecimiento, invasión y metástasis no dependen sólo de estos eventos mutagénicos. En realidad, se reconoce que todas las células presentes en el acto microambiente tumoral sinérgicamente para promover la proliferación y la diseminación tumoral [23], [24]. Por otra parte, se ha informado recientemente por Straussman et al., 2012, que las células estromales son reclutados por las células cancerosas del tumor para provocar resistencia a las drogas y la proliferación [25].
Recientemente, varias terapias contra el cáncer que se dirigen también fibroblastos han mostrado para impedir la progresión de esta enfermedad [26]. Estas células particulares se describen como teniendo un papel crucial en el nicho de tumor [27], con poblaciones heterogéneas y diferente composición relativa existentes en numerosos tumores [26]. Estas células están implicadas en el metabolismo de la ECM, mediante la promoción de la integrina de señalización [28], [29]. Los fibroblastos también secretan e interactuar con varios factores de crecimiento [25], [29], como el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) y factor de crecimiento epitelial (EGF), que son responsable de la activación de los mecanismos que contribuyen a la resistencia a la apoptosis [30], [31], y promover la proliferación de las células malignas [32]. Todas estas características perjudiciales, han atraído la atención a los investigadores a desarrollar co-cultivos que incluyen estos tipos de células en un intento de imitar el microambiente tumoral real [19], [33].
A partir de este punto de vista, el presente estudio que caracteriza a la captación celular de nanoportadores funcionalizados en los modelos de co-cultivo, con el fin de hacer frente a su selectividad y la actividad biológica de las células cancerosas.
Materiales y Métodos
Materiales
contengan estrógenos dependiente de adenocarcinoma de mama humano (MCF-7) se obtuvo de ATCC (Middlesex, Reino Unido) y normales fibroblastos dérmicos humanos primarios (hFIB) de Promocell (Heidelberg, Alemania). El cultivo celular matraces T se obtuvieron a partir de Orange Scientific (Braine-l'Alleud, Bélgica). placas de imágenes de células fueron adquiridos de ibidi GmbH (ibidi, Munich, Alemania). Rodamina B isotiocianato (RITC), tripsina, cultivo de células de Dulbecco modificado de Medio Eagle F-12 (DMEM-F12), colágeno tipo I, L-histidina, L-arginina,
N CD - hidroxisuccinimida (NHS),
N CD - (3-dimetilaminopropil) -
N
hidrocloruro de etilcarbodiimida (EDC) fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (Sintra, Portugal). Hoescht 33342® y CellLight 2.0® BacMam fueron proporcionados por Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.). hidrocloruro de quitosano ultrapura (CH) (Protasan UP CL 113) se obtuvo de Novamatrix (Sandvika, Noruega). suero bovino fetal (FBS) se adquirió de Biochrom AG (Berlin, Alemania). (4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico) se adquirió de Tokyo Chemical Industry (TCI) (Tokio, Japón). Todos los demás reactivos se utilizaron sin purificación adicional.
Modelos
Co-Cultura y
Establecer fueron cultivadas diferentes células MCF-7 y hFIB modelos de co-cultivo de 75 cm
2 de células T- frascos con medio DMEM-F12 suplementado con 10% (v /v) FBS, y 1% de estreptomicina y gentamicina. Todas las células se incubaron a 37 ° C, en una atmósfera humidificada con 5% de CO
2. Al alcanzar la confluencia, se recogieron tanto las células usando 0,18% de tripsina y EDTA 5 mM para obtener dos suspensiones de células individuales. Las células se tiñeron con azul de tripano 4% y se contaron usando un hemocitómetro. Posteriormente, co-cultivos se sembraron a 01:01, 01:03, 01:05 y 03:01 MCF-7 a las relaciones de hFIB, en placas de 6 pocillos, con un total de 2 × 10
4 de las células por pocillo. culturas homotípicos de control de hFIB y las células MCF-7 se sembraron utilizando el mismo número total de células por pocillo en pocillos separados. Co-cultivos y culturas homotipica se mantuvieron en DMEM-F12 medio completo a lo largo de todos los experimentos. La evolución de los co-cultivos en términos de distribución y morfología celular se analizó utilizando un microscopio óptico Olympus CX41 equipado con una cámara digital Olympus SP-500 UZ.
Síntesis y caracterización de quitosano-histidina-Arginina
Para la síntesis del polímero multifuncional, CH se modificó químicamente con arginina (R) e histidina (H) a través de EDC /NHS acoplamiento [34], [35]. Para este propósito, el quitosano se disolvió (tampón de 10 mM TEMED /HCl, pH 6,0) a una concentración de 1% (w /v). Posteriormente, NHS, EDC (0,6 mol: 1,5 mol) y L-histidina (0,7 mol: 1,0 moles de glucosamina) se añadieron posteriormente a la solución de quitosano. La reacción se realizó durante 24 h, a temperatura ambiente. El polímero funcionalizado se sometió a diálisis frente a agua desionizada (MWCO de 12 000-14 000 Da). A continuación, el polímero de quitosano-H purificada se recuperó por liofilización. El esqueleto del polímero CH-H fue posteriormente modificado con L-arginina como se mencionó anteriormente, para producir CH-HR.
La inclusión de los aminoácidos en la cadena principal del quitosano se analizó a través de resonancia magnética nuclear de protones (
1H NMR ) espectroscopia utilizando un espectrómetro de 400 MHz Bruker Avance III (Bruker Scientific Inc., Nueva York, EE.UU.). Todas las muestras se disolvieron en 1 ml de DMSO-d
6 a través de extensa sonicación y la
1H espectros fueron recogidos con un programa de pulso basada en gradiente (zgesgp, Bruker), a 298 K utilizando una ventana espectral de 9 kHz . Los espectros de RMN fueron procesados y analizados con el software TOPSPIN 3.1 (Bruker Scientific Inc., N.Y., EE.UU.). Además, el acoplamiento de aminoácidos también se verificó por reflectancia total atenuada-Fourier Transform Infrared Spectroscopy (ATR-FTIR) (Protocolo de S1 en el Archivo S1 y Figura S1). El grado total de sustitución de la cadena principal del polímero de CH original fue determinada por ATR-FTIR, como se describió anteriormente elsewere [36] (media ± S.D. .: 43,84 ± 6,67%;
n
= 3). Además, el grado de sustitución se determinó también mediante análisis de RMN mediante la integración de la histidina (δ = 8,1 ppm), arginina (δ = 7,41 ppm) y quitosano (δ = 1,3 ppm) picos característicos (relación de histidina = 1,14; Arginina ratio = 0,39).
Nanopartículas Formulación y caracterización físico-química
para garantizar la existencia de material genético para la encapsulación en nanoportadores, el plásmido pVAX1-LacZ se amplifica inicialmente en bacterias recombinantes y se recupera como anteriormente reportados [37]. Brevemente, para la formulación de nanopartículas de quitosano-histidina-arginina /pDNA (CH-H-R /pDNA), el polímero se disolvió en tampón de acetato (pH 4,5) a la concentración deseada. Todos los aminoácidos CH-H-R nanopartículas se formularon a una amina previamente optimizado a la proporción de fosfato (proporción N: P = 60). Las nanopartículas fueron sintetizados por el pDNA Además de la solución de polímero a 01:04 (v /v). Después, la mezcla se mezcló vigorosamente durante 1 min. Después, los complejos se estabilizaron a temperatura ambiente y se recuperaron por centrifugación a 18 000 g, durante 30 min.
tamaño de las nanopartículas y el potencial zeta se determinó mediante el uso de un instrumento Zetasizer Nano Zs (Malvern Instruments, Worcestershire, Reino Unido) como nuestro grupo describió anteriormente [37]. Todos los experimentos se realizaron a 25 ° C, con células capilares desechables plegados, en modo automático. Los datos se procesaron en el software Zetasizer (v 6.2). Además, el potencial zeta de las nanopartículas también se proyectó en una gama de diferentes de pH (5,0 a 7,4), a fin de abordar aún más el comportamiento de respuesta pH de este sistema en diversas condiciones. La proyección pH se llevó a cabo mediante la resuspensión de las nanopartículas en tampones con una capacidad adecuada de amortiguación (tampón de acetato, 10 mM, pH 5,0; tampón de citrato 10 mM, pH 6,0 y pH 6,5; tampón HEPES 10 mM, pH 7,0 y pH 7,4). Todos los tampones se filtraron previamente a través de un filtro de 0,22 micras.
Las nanopartículas fabricadas también se analizaron por microscopía electrónica de barrido (SEM). Antes del análisis SEM, las muestras de nanopartículas se tiñeron con ácido fosfotúngstico 0,1% y se sonicaron. Después, la suspensión de nanopartículas se dispersó en trozos de aluminio, y bombardeo iónico recubierto con oro después de secar a temperatura ambiente. muestras de nanopartículas A continuación, se visualizaron en un Hitachi S-2700 (Tokio, Japón) microscopio electrónico configurado con los valores óptimos para los materiales de tamaño nanométrico de imagen.
in vitro de nanopartículas
célula captación
El
in vitro
la absorción de nanopartículas en los distintos sistemas de co-cultivo (01:01, 01:03, 01:05, 03:01) se analizó por microscopía confocal de barrido láser (CLSM). Para distinguir las células hFIB de MCF-7, este último se marcaron con el CellLight proteína fluorescente sonda 2.0® BacMam actina-verde (GFP) siguiendo el protocolo del fabricante. Antes de la siembra de células, las placas de formación de imágenes se recubrieron con colágeno I superficie, por 30 min, según lo recomendado por los fabricantes. Después de la aparición de la expresión de GFP, varios MCF-7 /GFP a las relaciones de hFIB fueron sub-cultivadas en 8 pocillos ibidi μ-Slide a una densidad de 2 × 10
4 células por pocillo. Las células se cultivaron en medio DMEM-F12 suplementado con 10% (v /v) FBS, a 37 ° C en atmósfera humidificada con 5% de CO
2. Después de la primera días de co-cultivo, las células se incubaron con nanopartículas CH-H-R cargados con pDNA marcado con RITC (1 g /cm
2) durante 4 h [38]. Las nanopartículas se incubaron también en monocultivos de hFIB, MCF-7 y MCF-7 células GFP-actina. Además, se usaron células MCF-7 teñidas con GFP y se incubaron con desnudo RITC-pDNA como controles (Figura S2). Después de un período de incubación de 4 h, las células se fijaron con 4% de paraformaldehído (PFA) durante 15 min, se lavaron extensamente con PBS y se tiñeron con Hoechst 33342® sonda nuclear a temperatura ambiente. imágenes de células se realizó en un Zeiss LSM 710 microscopio confocal de barrido láser (Carl Zeiss SMT Inc., EE.UU.) mediante el uso de un Plan-Apocromático 40 × /1.4 objetivo aceite DIC. Las imágenes de las muestras se adquirieron en modo z-pila con un grosor de corte de 0,23 micras. seccionamiento ortogonal y la reconstrucción 3D de los diversos z-pilas se llevó a cabo en el software Zeiss LSM Zen (2010).
Flujo Análisis de citometría de captación de nanopartículas
El efecto de diferentes relaciones de co-cultivo de la extensión y especificidad de la absorción de nanopartículas se analizó mediante citometría de flujo mediante el uso de un flujo BD FACSCalibur citómetro (Becton Dickinson Inc., EE.UU.). En pocas palabras, para experimentos de absorción, co-cultivos se sembraron en placas de cultivo de 6 pocillos con un total de 2 × 10
5 células por pocillo. Las células se cultivaron durante 24 h en DMEM-F12-10% FBS antes de todos los experimentos. Además, se utilizaron co-cultivos y monocultivos de hFIB y MCF-7 como controles para establecer los parámetros de activación periódica y adquisición correctas en el FL-1 (530/30 nm (GFP)) y FL-2 (585/42 nm ( RITC)) canales (Figura S3). Para el análisis de la absorción de nanopartículas en los diversos co-cultivos CH-H-R nanopartículas se prepararon con recién marcado RITC-pDNA (1 g /cm
2) y se incubaron con las células durante 4 h. Después, las células se enjuagaron extensivamente con PBS enfriado en hielo y se recogieron con EDTA 0,18% de tripsina /5 mM (ácido etilendiaminotetraacético). Por citometría de flujo análisis, las células se resuspendend en 600 l de PBS fresco. La adquisición de datos se llevó a cabo en el software CellQuest ™ Pro, donde 8 × 10
3 eventos se registraron en las regiones cerradas de interés asignados a hFIB y las células MCF-7. La citometría de flujo de datos se analizó en la versión de prueba del software de FCS v.4 expresa edición investigación (De Novo Software, Ontario, Canadá). Para el cálculo del porcentaje de células de una región cerrada que van desde 10
1-10
se utilizó 4. Esta región está delimitada por un marcador en los histogramas y corresponde al cuadrante R2 en los gráficos de puntos. Todos los histogramas de los controles no tratados fueron restados de los histogramas obtenidos para las diferentes relaciones.
Resultados
Los co-cultivos de células MCF-7 y hFIB
En un principio, diferente modelos de cáncer de mama co-cultivo se establecieron utilizando diferentes proporciones de células que se han descrito previamente en la literatura como descriptiva del
in vivo
-mimicking condiciones, a saber, 01:01; 01:03; 01:05; 03:01, MCF-7 a las células hFIB [19], [39], [40], [41], [42]. La evolución de los modelos de co-cultivo establecidas se presenta en la Figura 2.
Los co-cultivos de células MCF-7 a hFIB de relación: 01:01 (A1-A5), 01:03 (B1-B5) , 01:05 (C1-C5) y 3:01 (D1-D5). Los monocultivos de células MCF-7 (E1-E5) y hFIB (F1-F5) se utilizaron como controles. aumento original × 100.
A través del análisis de la figura 2, se puede ver claramente que las células son adherentes y capaz de permanecer en el co-cultivo durante varios días sin desprendimiento o muerte celular anormal. Curiosamente, en co-cultivos que se establecieron con más fibroblastos que las células de cáncer de mama (Figura 2 B1-B5 y C1-C5), MCF-7 células desarrollaron una ligera tendencia a formar aglomerados rodeadas por los fibroblastos. Esta aglomeración es particularmente evidente después de 8 días de co-cultivo (Figura 3) y se asocia con las características fenotípicas de las células del cáncer de mama que se organizan en estructuras acinares [43].
Los co-cultivos de MCF 7 y hFIB 01:01 (A, B) y 1:05 (C, D). aumento original × 100.
Síntesis y Caracterización de CH-H-R multifuncional Polímeros
La adición de residuos de aminoácidos a la cadena principal quitosano fue confirmada por
espectroscopia 1H NMR. Los resultados en la Figura 4 A y B demuestran la presencia de picos de protones adicionales en δ≈1.5 ppm (-CH
2-, L-arginina y L-histidina, número 1) y ppm δ≈2.8-3.0 (-CH
2NH-, L-arginina, número 2) en comparación con los espectros de quitosano solo. Las señales que corresponden a C
3-C
6 carbonos de quitosano están enmascarados por picos de disolvente. las señales de carbono anomérico El quitosano se obtienen entre δ≈4.6-4.9 (número 7 y 7 *) [44]. La señal de protón a δ≈1.9 ppm (número 6) corresponde a los -CH
3 grupos vinculados a los restos de quitosano acetamido [44]. La existencia de la característica de pico de protones δ≈7.41 ppm (-NHCH = NHNH
2, número 3) asignado al grupo funcional de guanidina [45] presente en L-arginina sugiere la inclusión exitosa de este aminoácido. Además, la aparición de picos característicos de protones del anillo de imidazol de L-histidina ppm δ≈8.0-8.5 (-N = CH-NH-, número 5) también indica su inclusión en el polímero de quitosano. La histidina también presenta picos de protones en δ≈7.1-7.2 ppm que corresponden a la de hidrógeno H2 (HN-CH-C, número 4) en el anillo de imidazol. Estos resultados están de acuerdo con los obtenidos por análisis de ATR-FTIR (Figura S2).
1H NMR de CH no modificado (A) y CH-H-R (B y D). El potencial zeta (C) y el análisis SEM (D) de las nanopartículas CH-HR /pADN, respectivamente.
Nanopartículas Formulación y caracterización físico-química
La síntesis de nanopartículas CH-HR /pDNA fue promovida por el establecimiento de fuerzas electrostáticas de atracción entre el esqueleto del polímero cargado positivamente y las biomoléculas pDNA con carga negativa. Caracterización tamaño de las nanopartículas a través de la dispersión de luz dinámica (DLS) reveló que los nanodispositivos manufacturados por este proceso tienen un tamaño subcelular en la escala nanométrica (Figura 4C), una característica valiosa si se prevén aplicaciones terapéuticas. El análisis SEM también demostró que las partículas presentan una morfología esférica similar (Figura 4D). Además, el análisis del potencial zeta reveló que la carga superficial de las nanopartículas es altamente positivo y en el intervalo de estabilidad de las partículas,
es decir., España no se observó agregación de partículas (Figura 4 C y D). La modificación del potencial zeta de las nanopartículas con pH ambiental también se investigó con el fin de apoyar aún más la adquisición de un comportamiento sensible pH cuando los restos de aminoácidos fueron injertados en quitosán nativo (Figura 5). Los resultados obtenidos demuestran que las nanopartículas poseen una elevada carga positiva en el intervalo de pH lisosomal (pH 5,0 a 6,0). Curiosamente, a un pH superior, la carga superficial de las nanopartículas disminuye, que ilustra la desprotonación de las aminas primarias de quitosano y del grupo imidazol de la histidina cargada positivamente (Figura 5).
Representación esquemática de disminución potencial zeta como una función del pH. Los datos se presentan como media ± DE
Efecto de la proporción de células en la eficiencia de nanopartículas de Absorción celular
Después de confirmar la síntesis exitosa de los sistemas nanoparticulados y que el MCF-7-hFIB las células se mantuvieron estables en co-cultivo, diferentes proporciones de células fueron entonces establecidos en co-cultivo con el fin de proporcionar una plataforma para evaluar los eventos de la captación celular de un sistema de nanopartículas multifuncional compuesto por CH-HR y pDNA. La captación celular de las nanopartículas se caracterizó inicialmente por microscopía confocal para evaluar su capacidad de internalización celular. El análisis de la reconstrucción en 3D de los modelos de co-cultivo demuestran que los nanovehículos son ampliamente presente en el citoplasma (Figura 6 A). Las nanopartículas cargadas con pDNA también se localizan en el núcleo de la célula como se muestra en cortes ortogonales (Figura 6 B, B1, B2, flechas blancas) y secciones nucleares (Figura 6 C, flechas blancas). Por otra parte, también se realizó un análisis de colocalización de corroborar estos hallazgos. Como se muestra en la Figura 6 D (canal de colocalización - Color gris) existe una colocalización visible entre las nanovehículos marcadas con RITC y el compartimiento intracelular (flecha de color púrpura). Además, la colocalización nuclear también ilustra la existencia de nanovehículos en el compartimento nuclear.
Imágenes de microscopía confocal de células de cáncer de mama MCF-7 después de 4 h de incubación con nanovehículos (A, B), de corte ortogonal en xy eje (B1, B2), la reconstrucción 3D del núcleo de la célula (C). Colocalización de los canales verde (D) y la Red. Colocalización de los canales rojo y azul. canal rojo - RITC etiquetado pADN /CH-H-R; canal verde - tinción de actina-GFP de las células MCF-7 Canal Azul - Hoechst 33342® tinción nuclear. canales de Grey: análisis de colocalización.
nanodevice capacidad de orientación también se evaluó en los diferentes modelos de co-cultivo mediante microscopía confocal y citometría de flujo marcando el pDNA presente en nanopartículas con RITC y también las células cancerosas con una GFP sonda de actina. A través de este enfoque hemos sido capaces de distinguir la absorción de nanopartículas en ambos tipos de células (Figura 7). El análisis de las diversas imágenes CLSM, se observa que para las diferentes relaciones del co-cultivo, la internalización de nanopartículas es marcadamente mayor en células MCF-7 en comparación con hFIB (Figura 7). De hecho, el análisis de citometría de flujo confirma las observaciones de imágenes CLSM. La Figura 8 muestra que las nanopartículas CH-R-H /pDNA entran preferentemente en las células de cáncer de MCF-7, en detrimento de hFIB, para todas las proporciones de co-cultivo. Este hallazgo pone de relieve una posible selectividad de este sistema hacia las células malignas en microambientes heterogéneos. Además, experimentos de absorción de nanopartículas en monocultivado células MCF-7 y hFIB indican que los nanovehículos están más internalizados en las células malignas que en las células normales (Figura S4), haciendo hincapié además en los resultados obtenidos para los experimentos de co-cultivo.
co-cultivos de células MCF-7 a hFIB en proporciones de: 01:01 (a-C), 01:03 (D-F), 01:05 (G-I) y 03:07 (J-L) después de 4 h de incubación con nanopartículas. Red de canal - nanopartículas pADN /CH-H-R-RITC marcado; canal verde - tinción de actina-GFP de las células MCF-7; Canal Blue - Hoechst 33342® tinción nuclear; Canal Gris: DIC; Fusionada -. La superposición de todos los canales
parcelas representativas de puntos de la absorción de nanopartículas en las diferentes relaciones de co-cultivo (A-D). El cuadrante R2 se utilizó como una puerta para el análisis de histograma. histogramas representativos de la absorción de nanopartículas en las poblaciones de células MCF-7 (E-H) y hFIB (I-L) con diferentes relaciones de co-cultivo después de 4 h de incubación con marcadas con nanopartículas RITC /CH-recursos humanos pDNA.
Discusión
En la actualidad, la necesidad de mejorar la eficacia de la terapéutica contra el cáncer ha fomentado el desarrollo de sistemas de administración de dominio nanoescala que son capaces de reducir los efectos secundarios localizadas y sistémicas de agentes quimioterapéuticos convencionales [8]. Estos nanodispositivos poseen un conjunto de propiedades únicas que mejoran el perfil farmacocinético y farmacodinámico de moléculas bioactivas, aumentando su biodisponibilidad en los sitios diana [6]. En realidad, debido a su versatilidad, nanovehículos pueden ser diseñados para reconocer selectivamente células diana tumorales y evadir metabolismo de primer paso, la fagocitosis o la separación rápida de sangre, disminuyendo la probabilidad de eventos fuera de objetivo [3]. Además, una vez localizado en el compartimento celular, nanovehículos proteger su carga de los mecanismos de resistencia a fármacos natural en células tumorales, tales como los que dependen de los transportadores ABC, y también guían las moléculas terapéuticas a sus dianas intracelulares [46]. Todas estas características clave dependen de las diferentes etapas de diseño nanotransportador y montaje altamente. Por lo tanto, una evaluación adecuada durante el proceso de desarrollo de nanopartículas es crucial para el éxito de su aplicación
in vivo.
De hecho, la evaluación de los nuevos sistemas de suministro debe realizarse a fondo con el fin de evitar la potencial para la salud riesgos e identificar las características óptimas [9]. En general, la evaluación preclínica de la actuación biológica de un nanodevice se lleva a cabo tanto en
in vitro
, utilizando cultivos de células, y
in vivo, Chat con modelos animales. Sin embargo, la demanda actual para reducir la experimentación con animales debido a las cuestiones éticas y económicas conexas ha impulsado el desarrollo de enfoques alternativos, tales como cultivos celulares. Sin embargo, con el fin de liberar todo el potencial de los modelos de cultivo celular y obtener resultados más realistas, la diferencia entre los cultivos de células simples y
in vivo
tejidos tiene que ser reducida. Por lo tanto, el desarrollo de modelos nuevos basados en co-cultivos ha sacado la posibilidad de imitar los tejidos tumorales de una manera tal que el ambiente fisiológico encontró
in vivo
puede ser replicado
in vitro
. Prueba de candidatos nanotransportador en estos sistemas de co-cultivos, proporciona resultados más precisos, ya que estos se reproducen progresión tumoral, resistencia a los medicamentos y también la comunicación entre células [47]. Todos estos acontecimientos en última instancia afectan al rendimiento biológico de un sistema nanotransportador dado y sus moléculas bioactivas cargadas.
Por lo tanto, se convierte en valiosa para caracterizar la absorción celular de nanopartículas en los modelos de co-cultivo para evaluar su especificidad de orientación. Sin embargo, ya que la acción de nanopartículas podría cambiar de acuerdo con las características de los microambientes tumorales, la evaluación de diversas condiciones es un requisito crucial en el desarrollo pre-clínico. A través de este análisis la acción de nanopartículas funcionalizadas contra las células malignas a continuación, se puede ajustar dependiendo del nicho de tumor y sus células normales circundantes. Para ello, se hace imprescindible desarrollar varios modelos de co-cultivo que reproducen entornos dinámicos. Por lo tanto, las nanopartículas de quitosano funcionalizados en el presente documento se probaron en co-cultivos con diferentes proporciones de células malignas a normal. Para llevar a cabo estos ensayos, se utilizaron diferentes proporciones de hFIB y células de cáncer de mama (MCF-7). Estos modelos se establecieron teniendo en cuenta los informes anteriores en los que se usaron estas relaciones de células particulares para imitar los ambientes de cáncer [19], [39], [40], [41], [42]. La Figura 2 muestra la alta tasa de proliferación de ambos tipos de células, sin la muerte celular anormal, en comparación con sus homólogos de monocultivos. Por otra parte, los resultados que se muestran en la Figura 2 confirman las buenas interacciones entre las células MCF-7 de cáncer de mama y hFIB, y por lo tanto el establecimiento exitoso de estos modelos de co-cultivo.
En cuanto a morfología celular, las imágenes ópticas (Figura 2 ) demuestran que ambos tipos de células conservan sus rasgos fenotípicos. Las células cancerosas mantuvieron su morfología epitelial, con una forma poligonal [48], [49].