Extracto
El fulvestrant (ICI-182780) ha sido recientemente demostrado que suprimir con eficacia el cáncer de próstata tratados-fulvestrant el crecimiento celular
in vitro
y
in vivo
. Pero no está claro si microRNAs juegan un papel en la regulación de la expresión de oncogenes en el cáncer de próstata tratados con fulvestrant. Aquí, este estudio informa
HSA-mir-765
como el primer fulvestrant impulsada, miARN regulado ERβ exhibiendo actividades supresores de tumores significativos como fulvestrant, contra el crecimiento de células de cáncer de próstata mediante el bloqueo de la progresión del ciclo celular en G2 /transición M, y la migración celular y la invasión posiblemente a través de la reducción de la formación de estrés de fibra filopodios /intenso. El fulvestrant se mostró regular al alza
hsa-miR-765
expresión a través de la contratación de ERβ al extremo 5 'de reglamentación región de
hsa-miR-765
. HMGA1, una proteína oncogénica en el cáncer de próstata, fue identificado como un objetivo corriente abajo de
hsa-miR-765
y fulvestrant en experimentos basados en células y en un estudio clínico. Tanto el antiestrógeno y la expresión de la proteína HMGA1
hsa-miR-765
imitan suprimidos. En un estudio neo-adyuvante, los niveles de
hsa-miR-765
se incrementaron y la expresión HMGA1 fue casi completamente perdido en muestras de cáncer de próstata de pacientes tratados con una sola dosis (250 mg) de fulvestrant 28 días antes de la prostatectomía . Estos resultados revelan una cascada de señalización que implica novela fulvestrant mediada por ERβ la regulación positiva de la transcripción de
hsa-miR-765
que suprime la expresión de la proteína HMGA1 como parte del mecanismo que subyace a la acción supresora de tumores de fulvestrant en el cáncer de próstata.
Visto: Leung YK, Chan QK-Y, Ng CF, Ma FM-T, Tse HM, Para KF, et al. (2014) HSA-miRNA-765 como un mediador clave para inhibir el crecimiento, migración e invasión en el cáncer de próstata tratados-fulvestrant. PLoS ONE 9 (5): e98037. doi: 10.1371 /journal.pone.0098037
Editor: Jindan Yu, de la Northwestern University, Estados Unidos de América
Recibido: 21 Enero, 2014; Aceptado: 28 de abril de 2014; Publicado: 16 de mayo de 2014
Derechos de Autor © 2014 Leung et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyada por las subvenciones del Fondo de Hong Kong Universidad Consejo general de Investigación (M469107 a KML) y la Universidad china de Hong Kong ayudas a la Investigación directos (CU2041252 y CU2041563 a KML), un Veterans Affairs Merit Award (I01BX000675 a SMH) y las subvenciones de los Institutos nacionales de salud (ES019480, ES020956, ES015584, ES006096, CA112570, CA015776 a SMH) y una beca del Programa de Estudio Investigador-patrocinados de AstraZeneca (JM). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses: Dra. Jodi Maranchie recibió el programa de estudio del investigador-patrocinados de AstraZeneca. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
El desarrollo normal y el crecimiento maligno de la próstata se regulan no sólo por los andrógenos, sino también por el estrógeno [1]. El receptor de estrógeno (ER) β es el principal receptor expresado en el epitelio prostático y en varias etapas de cáncer de próstata (CaP), incluyendo metástasis óseas [2], [3]. El estrógeno sintético dietilestilbestrol (DES), a través de su acción de privación de andrógenos, que una vez fue el tratamiento de primera línea para el CaP metastásico [1], [4]. DES finalmente perdió favor debido a su alta toxicidad y tromboembólica riesgo cardiovascular [5], [6], con parenteral estradiol-17β (E2) ganando popularidad reciente como una terapia para metastásico, resistente a la castración CaP (CRPC) [7], [ ,,,0],8] debido a su perfil de toxicidad cardiovascular baja y acción protectora contra la osteoporosis [9]. Otros moduladores de ER selectivo (por ejemplo, tamoxifeno, toremifeno, y reloxifene) se han investigado en ensayos clínicos, pero encontró que tienen una eficacia limitada en comparación con DES [10] - [13]. Con la aprobación en 2005 de fulvestrant (ICI 182780), un antagonista de los receptores de estrógenos puros sin efecto agonista conocido, para el tratamiento del cáncer de mama metastásico positivo para el receptor, el interés en su uso para el CRPC ha surgido.
En preclínica modelos, fulvestrant ha demostrado características de una terapia prometedora para CaP. En un modelo CaP inducida por los estrógenos [14] - [17], fulvestrant prevenir la evolución de las lesiones precancerosas, invierte el transcriptoma E2 inducida [16], [17], e indujo su propio gen firma [16]. En DU145, una línea celular humana que expresa CaP ERβ y sin ER, fulvestrant suprimió el crecimiento de células a través del receptor [18] y regulado un conjunto único de genes, posiblemente a través de la diafonía entre ERβ y NFkB [19]. Además, fulvestrant suprimió el crecimiento de DU145 y PC-3 xenoinjertos través de una vía mediada por ERβ KLF5 señalización [20] y el crecimiento celular LNCaP también inhibida por la regulación negativa de los receptores de andrógenos [21].
En la única fase II estudio de fulvestrant hasta ahora realizó [22], 20 pacientes CRPC recibieron un régimen de dosis de carga (500 mg en el día 0 y luego 250 mg en el día 14, día 28, y después mensualmente). Después de seis meses de tratamiento, fulvestrant fue bien tolerado, aunque no se observó respuesta clínica favorable o PSA [22]. Sin embargo, al aumentar la dosis de carga en el primer mes (500 mg cada 14 días), el nivel de PSA se redujo efectivamente por 40-99% dentro de 0.27-2.67 meses en seis de los siete pacientes CRPC altamente pretratados sin ninguna toxicidad evidente [23 ]. Este último hallazgo apoya la realización de más investigaciones en la optimización de dosis y en profundidad estudios sobre el mecanismo de fulvestrant como una terapia para CaP.
Los microARN (miRNA) son pequeñas (17-25 nucleótidos) ARNs no codificantes que regulan la expresión de genes post-transcripcional. Cada miARN se puede unir a una o más secuencias diana en el no traducida-región 3 'de sus transcripciones objetivo y provocar la degradación de mRNA o la supresión de la traducción de proteínas, dependiendo del grado de apareamiento de bases complementarias [24]. Una sola miARN normalmente regula la expresión de un gran número de transcripciones [25] - [27]. La expresión aberrante de miRNAs específicos confiere una ventaja de crecimiento a las células cancerosas más de las células normales mediante la interrupción de múltiples vías oncogénico /supresores de tumores. miRNAs PCA-específicos se han identificado [28] - [30], y algunos están relacionados con los andrógenos-[31]. Hasta la fecha, sin embargo, hay una sola miARN se ha relacionado con los estrógenos o antiestrógenos en el CP.
A continuación, hemos examinado el papel de los genes miARN en la mediación de la acción de este fármaco en el CaP. mundial de perfiles de expresión de los genes miARN en las células DU145 identificados
hsa-miR-765
como un miARN fulvestrant reguladas. Los análisis de promotor define una secuencia mínima en la región reguladora 5 'de
HSA-mir-765
que recluta ERβ y que es fundamental para la regulación de fulvestrant. Los efectos de los miARN en el crecimiento CaP celular, la migración y la invasión se compararon con los de fulvestrant. La dependencia de las acciones de fulvestrant en ERβ se demostró mediante experimentos desmontables. El cambio en la expresión de
hsa-miR-765
y su proteína oncogénica aguas abajo, alta movilidad de grupo AT-gancho 1 (HMGA1), fue evaluada en pacientes sometidos a prostatectomía obtenidas de pacientes después de que habían sido tratados con fulvestrant de un mes.
Materiales y Métodos
tratamiento fulvestrant
DU145 y PC3 líneas celulares se adquirieron de ATCC (Manassas, VA). Se mantuvieron las células DU145 (ATCC) como se describe anteriormente [18]. PC3 (ATCC), las células se cultivaron en RPMI 1640 con FBS inactivado por calor 10% (hiFBS). La identidad de cada línea celular ha sido recientemente autenticado por la ATCC con el método de repetición de perfiles tándem corto. Todas las células se mantuvieron en medio hiFBS con carbón vegetal al 5% durante 24 h antes del tratamiento de drogas. Las células fueron tratadas con fulvestrant ya sea 10
-6 M en 0,1% o 0,1% de etanol. Los cultivos de control fueron tratados sólo con vehículo.
Mirna y la expresión génica
Para miARN perfiles, ARN totales se extrajeron y se marcan directamente usando el Sistema Rápido nCode de etiquetar (Invitrogen, Grand Island, NY) y dispuestos en el nCode miARN humano Microarray V3 (Invitrogen).
tejido de expresión de los genes miARN se estudió mediante la extracción de los ARN totales a partir de secciones criogénicas (5-10 micras) utilizando RNAzol RT (Molecular Research Center, Cincinnati, OH), poli (A) y -tailed a transcripción inversa con el cebador universal RT utilizando el kit de ADNc de primera cadena nCode micro ARN (Invitrogen). PCR en tiempo real se realizó con SYBRGreen PCR Master-Mix (Invitrogen) utilizando el
hsa-miR-765
específico o spliceosomal U6 pequeños ARN nucleares (RNU6) específicos de QRT cebador directo (Tabla S2) y una inverso universal de imprimación qPCR (Invitrogen).
ARN totales se prepararon con hexámero aleatorio (Invitrogen). Ribosomal proteína 3 (RPS3, Tabla S2) se utilizó como el control de limpieza. la expresión génica relativa se determinó por el ΔΔC
T método [32].
Muestras clínicas
Los pacientes con diagnóstico histológico, clínicamente localizado CaP se les dio una sola inyección intramuscular de 250 mg de fulvestrant , 28 días antes de una prostatectomía radical retropúbica programado. Los pacientes fueron excluidos si tenían un conteo de glóbulos blancos & lt; 3.000 /l, un recuento de plaquetas & lt; 100.000 /l, hemoglobina & lt; 11 g /dl, INR & gt; 1,6, o bilirrubina AST o creatinina niveles & gt; 1,5 veces la parte superior límite de la normalidad. Los pacientes también fueron excluidos si se requiere corticosteroides para el tratamiento de otras enfermedades sistémicas o tenían antecedentes de insuficiencia cardíaca congestiva, angina activa, infección o segunda neoplasia maligna activa. Todos los sujetos tenían una suma final de Gleason de 6 o 7 de la prostatectomía. Las muestras de los pacientes no tratados con una suma de Gleason similares y todas las muestras de los pacientes tratados con fulvestrant-se obtuvieron de la Universidad de Massachusetts Medical School (UMMS) bajo un protocolo (Pl. Dr. Maranchie) aprobado por el Comité para la Protección de Sujetos Humanos en Investigación y la Junta de Revisión Institucional en UMMS. Todos los sujetos dieron su consentimiento informado por escrito para participar en este estudio y se les aplica el anonimato.
Desmontables de ERβ
SiRNAs para ERβ o scramble siRNA (Invitrogen) se transfectó en células DU145 (2 × 10
5) con X-tremeGENE (Roche, Indianapolis, IN). Las células tratadas con ARNsi fueron tratados con fulvestrant o etanol durante otros 2-4 días y después se sometieron a tiempo real de RT-PCR, análisis de la actividad del promotor, ensayo de crecimiento celular, y la tinción de F-actina.
5 "región-regulador
analiza
El 5 'regiones genómicas aguas arriba de
hsa-miR-765
precursor (Chr1:. 156,906,923-156,906,036 adhesión sin NC_000001.10) -3208-100 fue amplificado y clonado en pGL3-basic (Promega, Madison, WI), el
pGL3-HSA-miR-765
. deleciones en serie a partir del extremo 5 'de la secuencia clonada en el vector se llevaron a cabo para generar pb pGL3-miR-765-Δ1192 (secuencia de ADN -2016-100), pGL3-miR-765-Δ1766 pb (secuencia de ADN a partir de - 1442-100), punto de ebullición pGL3-miR-765-Δ2414 (secuencia de ADN -792 a 100), punto de ebullición pGL3-miR-765-Δ2618 (secuencia de ADN -590 a 100), pGL3-miR-765- Δ2972 pb (secuencia de ADN -236 a 100), y el punto de ebullición pGL3-miR-765-Δ3113 (secuencia de ADN -95 a 100). actividades reportero de otros vectores truncados o mutados en células DU145 se determinaron con o sin fulvestrant y /o ERβ siRNA desmontables utilizando el sistema de ensayo de luciferasa dual (Promega).
Mirna reportero de orientación ensayo
DU145 células fueron transfectadas con luciferasa vector indicador PMIR-miR-765 que fue clonada con la secuencia complementaria de hsa-miR-765 tan perfecta diana de miR-765 y luego tratados con HSA-miR-765-mímica control negativo o imitan. Los lisados se sometieron al ensayo de indicador de luciferasa dual. La región 3 'del gen de la traducción
grupo de movilidad de alto AT-gancho 1 | (
HMGA1
) (+ 8026- + 9332) se generó mediante PCR (cebadores de la Tabla S2) y clonado en PMIR-INFORME (Invitrogen) como
PMIR-HMGA1-3UTR
. El
hsa-miR-765
mímica (secuencia en la Tabla S2) se clonó en PMIR como
PMIR-miR-765
. El efecto de la
hsa-miR-765
imitan en la expresión de luciferasa se determinó mediante el ensayo de luciferasa (Promega), con
PMIR vacío
incluyó como control.
cromatina inmunoprecipitación ensayo
inmunoprecipitación de cromatina (chIP) ensayos se realizaron de acuerdo con los métodos publicados [19]. En resumen, las células DU145 fueron tratados con fulvestrant o de control para 45 min. los complejos ADN-proteína fueron reticulados con 1% de formaldehído. complejos nucleares se sometieron a ultrasonidos (250-500 pb). Cinco microgramos de IgG de ratón (Millipore, Billerica, MA), anti-ARN polimerasa II (Millipore) o anti-ERβ1 (Serotec, Raleigh, NC) anticuerpos se aplicaron para la inmunoprecipitación durante una noche. Los complejos de ADN-proteína se lavaron y se eluyeron. Los ADN inmunoprecipitadas fueron limpiados, entrecruzados inversa, y se purifica. PCR y PCR en tiempo real reveló el reclutamiento de ERβ a una secuencia en la región reguladora 5 'de
HSA-miR765 gratis (primers que figuran en la Tabla S2). El
0N
promotor de ERβ [33] se utilizó como control de la no ERβ vinculante para este experimento.
El crecimiento celular ensayo
Efectos de fulvestrant o
tratamiento de MIMIC en DU145 o crecimiento celular PC3 se determinaron por el CellTiter 96 de célula no radiactivo proliferación de ensayo (Promega) 765 hsa-miR-. Para HMGA1 experimento la expresión ectópica, la longitud total de HMGA1 (pCMV6-AC-HMGA1, OriGene, Rockville, MD) o un control negativo (pCMV6-AC) se transfectaron en células DU145. Las células transfectadas fueron enriquecidos en medio G418-complementado por una semana. el crecimiento relativo de las células DU145 co-tratada
con fulvestrant por 4 días y ya sea la expresión HMGA1 o vector vacío en relación con las células control tratados con etanol y se compararon vector vacío. citometría de flujo
analiza
DU145 Las células fueron tratadas con fulvestrant /etanol o
hsa-miR-765
/control negativo-mímica imitan durante 2 días. Las células tratadas se analizaron de acuerdo con los protocolos publicados [32].
Western blot
analiza
Cinco microgramos de proteína de lisado de células se sometieron a electroforesis en 10 a 12,5% de SDS-PAGE y se sometieron a transferencia de Western análisis. Los anticuerpos primarios que figuran en la Tabla S3 se utilizaron para detectar los niveles de proteína.
migración y la invasión ensayos
células
DU145 o PC3 fueron tratados con fulvestrant o
hsa-miR-765
mímica y sus respectivos controles durante 2 días. Los ensayos de curación de heridas se realizaron como se informó anteriormente [34]. células DU145 se pretrataron con fulvestrant o etanol durante 5 h antes de que se realizaron ensayos de migración y la invasión [34].
filamentosa-actina (F-actina) tinción
F-actina en fulvestrant- o culturas DU145 tratadas con etanol sometidos a la precipitación mediada por ARNi de ERβ, se visualizaron
hsa-miR-765
transfección de MIMIC, o el control del tratamiento como se describe anteriormente [34]. En resumen, las células DU145 de control fulvestrant- y tratadas con etanol, ya sea con o ERβ siRNA de control negativo siRNA se tiñeron con faloidina conjugada con TRITC, y las imágenes de fluorescencia fueron capturados.
predicción computacional de los genes miARN objetivos
Miranda /mirSVR [35] (http://www.microrna.org), R5.2 TargetScan [36] (http://www.targetscan.org), RNAhybrid [37] y [38 EIMMo2 ] se utilizaron para predecir los supuestos objetivos de
hsa-miR-765
. genómica alineaciones, Blat (http://www.ensembl.org), se utilizaron para la validación adicional de los sitios predichos.
La inmunotinción de HMGA1 y AR
Las secciones congeladas (5 m) de CaP Las muestras de pacientes tratados o no tratados con fulvestrant antes de la prostatectomía se fijaron en formaldehído al 3% a temperatura ambiente y luego con metanol a -20 ° C. HMGA1 y AR se inmunodetectó con 1:100 anticuerpo anti-HMGA1 (sc 8982, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) y anti-AR respectivamente (sc 816, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) de acuerdo con los protocolos publicados [39 ]. Immunopositivity se determinó por el porcentaje de señal positiva (nuclear o citoplasmática) en 3/4 de grado de Gleason focos.
Resultados
A. El fulvestrant inhibe el crecimiento celular, la progresión del ciclo celular, la migración y la invasión de una manera dependiente de ERβ
fulvestrant inhibió el crecimiento de células DU145 por 40% y células PC-3 en un 30% a través de una vía dependiente de ERβ (Figura 1A, la Figura S1A) y detuvo la división celular en la fase G2 /M, como se indica por una disminución significativa en la población de células G0 /G1 y una acumulación de células G2 /M (Figura 1B). La interrupción de la progresión del ciclo celular fue acompañado por un aumento de la expresión de la G2 /marcadores M ciclina A (G2), ciclina B (M), y cdc2 fosforilada (G2), pero no de los marcadores de la fase S-ciclina E y cdc25C (Figura 1C).
(A) el fulvestrant induce la inhibición del crecimiento de células DU145 a través de un mecanismo dependiente de ERβ. El crecimiento de las células DU145 de fulvestrant tratados con o sin ERβ siRNA desmontables para 4 días en relación con las células de control tratadas con etanol con siRNA-control negativo se presenta y se compara (n = 8). ERβ expresión también fue derribado por otro siRNA (siRNA#2) y los resultados similares fueron obtenidos (Figura S5). (B) El fulvestrant induce la detención del ciclo celular DU145 en G2 /M fase. histogramas de ADN representativas de 48 horas fulvestrant -o etanol (control) las células tratadas y las distribuciones porcentuales de las células en G0 /G1 y G2 /M (n = 3) se presentan y comparan. (C) El fulvestrant induce la expresión de marcadores de G2 /M. células DU145 fueron tratados con fulvestrant o etanol durante 2 días (control) y los marcadores del ciclo celular se determinaron por análisis de transferencia Western. Dos experimentos independientes se realizaron y se presentó un conjunto representativo de datos. (D) El fulvestrant suprime la migración celular. Un ensayo de curación de la herida se realizó en las células DU145 tratadas con fulvestrant- y etanol (EtOH) (n = 3). se muestran micrografías representativas de los cultivos de células fulvestrant- y tratados con etanol con arañazos a las 0 h y después de 16 h. La herida está marcada por líneas de puntos. (E) El fulvestrant inhibe la migración transwell (panel izquierdo) y la invasión (panel derecho) en las células DU145 (n = 3) después de 5 horas de tratamiento fulvestrant. (F) Las reducciones de células filopodial y células con fibras de estrés intensos de fulvestrant (tratado con 48 horas) a través de un mecanismo dependiente de ERβ. Micrografías representativas y los porcentajes de las células con fibras de estrés intenso y las células filopodial (n = 3) se presentan. Se realizó la prueba t de Student para determinar la significación con un valor de p de corte de 0,05. ** P & lt; 0,01; bares = SD
El fulvestrant inhibe la migración celular en el ensayo de cicatrización de heridas (Figura 1D), y la migración transwell (Figura 1E, panel izquierdo) y la invasividad celular en el ensayo de invasión Transwell (Figura 1E, a la derecha panel) por ~ 40% (
p
& lt; 0,01, n = 3) en células DU145 (Figura 1E), así como en células PC-3 (Figura S2). El tratamiento con fulvestrant reduce significativamente el porcentaje de células filopodial de 90,1% a 55,9% (
p
& lt; 0,005, n = 5) y de las células con fibra de estrés intenso de 96,4% a 64,2% (
p
& lt; 0,001, n = 5) (Figura 1F). RNAi mediada desmontables de ERβ inviertan de forma efectiva la inhibición inducida por el fulvestrant (Figura 1F).
B. fulvestrant regula al alza
hsa-miR-765
expresión en células de CaP
Entre los 211 miRNAs detectables, 6 miRNAs altamente abundantes incluyendo hsa-miR-185, hsa-let-7b, hsa-miR 765, hsa-let-7a, hsa-miR-601, y hsa-miR-768-5p (& gt; 300 relativa intensidad de la señal normalizada) se upregulated después de fulvestrant-tratamiento (& gt; 2 veces;
p
& lt; 0,005) (Figura 2A).
HSA-mir-765
fue uno de los MIR que mostraron el mayor incremento relativo (3,8 veces) y el nivel máximo absoluto de la expresión en células DU145 tratadas con fulvestrant (Tabla S1). Fulvestrant también indujo un aumento significativo en la expresión de este MIR en las células PC3 de manera ERβ-dependiente (Figura 2B, Figura S1 B).
(A)
HSA-mir-765 es
altamente expresado en células DU145 de fulvestrant tratados. ARN totales de las células tratadas fueron etiquetados directamente y dispuestos en el nCode humano miARN microarrays. Los datos de regresión normalizada-mediana y lineales se presentan en un diagrama de dispersión. (B)
HSA-mir-765
es inducida por el fulvestrant en líneas celulares de cáncer de próstata dos. La HSA-miR-765 en el control de DU145 fulvestrant- y etanol tratadas y células PC-3 se cuantificó mediante análisis de miARN QRT-PCR. veces los cambios relativos entre la expresión de
hsa-miR-765 Hoteles en las células tratadas con fulvestrant y de control se presentan. Se realizó la prueba t de Student para determinar su significado utilizando un valor de p de corte de 0,05 (n = 3). ** P & lt; 0,01; bares = S. D.
C.
HSA-mir-765
inhibe el crecimiento celular, la progresión del ciclo celular, la migración y la invasión
hsa-miR-765
imitan o un control negativo se expresa en DU145 células que portan el vector informador de luciferasa
PMIR-miR-765
. La expresión ectópica de la
hsa-miR-765
mímica, pero no el control negativo, la actividad luciferasa efectivamente suprimida por & gt; 70% en las células DU145 (Figura 3A). La sobreexpresión de la
hsa-miR-765
imitar en las células DU145 inducidos inhibición del crecimiento celular (40%; Figura 3B) y la detención del ciclo celular en G2 /M (G0 /G1 a G2 /M proporción disminuyó de 3,5 ± 0,26 2,7 ± a la 0.10,
p = 0,0074
) (Figura 3C) y regulada al alza la expresión de la ciclina A, ciclina B, y fosforilados-cdc2 pero no ciclina e o cdc25C (Figura 3D). Finalmente, se redujo la migración celular y la invasión (~ 80%; Figura 3E), y la formación de filopodios /fibra de estrés intenso (Figura 3F) a niveles mayores que o comparables a las inducidas por fulvestrant (ver las figuras 1C & amp; 1D). En general, las acciones de los
hsa-miR-765 en células DU145
son muy similares a los de fulvestrant. Además de las células DU145, los efectos inhibitorios de HAS-miR-765 imitan también se observaron en PC-3 células (Figura S3).
(A)
HSA-mir-765
mímica reconoce efectivamente reportero con la secuencia complementaria de
hsa-miR-765 en células DU145
. Doblar los cambios de actividades de luciferasa de las células de la
hsa-miR-765
imitar tratados en relación con las células tratadas con el control negativo imitador se presenta (n = 3). reactivos de transfección se utilizaron como control. (B)
HSA-mir-765
imitan reduce el crecimiento de células DU145. ensayo de MTS se realizó en las células tratadas con
hsa-miR-765
imitan o control negativo imitar o control de transfección durante 4 días (n = 8). (C)
HSA-mir-765
imitan significativa reduce G0 /G1 a la relación de G2 /M en DU145. histogramas de ADN representativos (n = 3) se presentan. (D)
HSA-mir-765
tratamiento imitan provoca la sobre regulación de la ciclina A, ciclina B, y la expresión fosforilada-cdc2 en las células DU145. los niveles de expresión de proteínas de proteínas reguladoras del ciclo celular se determinaron por análisis de transferencia Western. Dos experimentos independientes se realizaron y se presentó un conjunto representativo de datos. (E)
HSA-mir-765
imitan suprime la migración celular y la invasión DU145 como se muestra en transwell ensayo de migración (arriba a la izquierda) y el ensayo de invasión (arriba a la derecha), respectivamente. Se presentan micrografías representativas de las células después de la migración transwell (arriba a la izquierda) o ensayo de invasión (arriba a la derecha). Doblar los cambios de la migración (parte inferior izquierda) y la invasión (abajo derecha) de las células DU145, ya sea con
hsa-miR-765
imitar o mímica control negativo con respecto a las células control con el control negativo imitador se presenta (n = 3). (F)
HSA-mir-765
imitar reduce significativamente las fibras de estrés y las formaciones de filopodios en las células DU145. Micrografías representativas y los porcentajes de las células con fibras de estrés intenso y las células filopodial (n = 3) se presentan. Se utilizó la prueba t de Student para la comparación con un valor p de corte de 0,05. ** P & lt; 0,01; bar = S. D.
D. Fulvestrant induce la regulación positiva de
hsa-miR-765
expresión a través de la contratación de ERβ a un elemento regulador putativo
DU145 células fueron sometidas a siRNAs caída mediada por ERβ fulvestrant tratamiento previo. ARNsi efectivamente golpeó abajo la expresión de ERβ (figura S4). Esta caída bloqueó completamente la mejora fulvestrant-inducida de
hsa-miR-765
expresión (Figura 4A) y abolió las actividades de transactivación de fulvestrant en una secuencia reguladora 5 'de
hsa-miR-765
(entre -3208 y 100; 3,3 kb) (Figura 4B). análisis de deleción de serie identifica una secuencia de 141 pb (entre -236 y -95) dentro de la 3,3-kb secuencia 5'-regulador esencial en la mediación del efecto estimulador de fulvestrant en
hsa-miR-765
transcripción. Chip ensayos demostraron además reclutamiento de ERβ a esta secuencia corta después de la estimulación fulvestrant (Figura 4D). Estos datos apoyan un papel de ERβ en la mediación de fulvestrant-inducida por
hsa-miR-765
regulación al alza.
(A) ERβ siRNA desmontables bloquea la sobrerregulación-fulvestrant inducida de
hsa-miR 765
expresión en células DU145. Los niveles de expresión de
hsa-miR-765
determinados por QRT-PCR análisis de las células tratadas con fulvestrant con ERβ-siRNA (siERβ) o revuelven-control negativo (SINEG) se compararon (n = 3). (B) siRNA desmontables de ERβ bloquea la transactivación de la región reguladora aguas arriba 5 'de
hsa-miR-765
fulvestrant-inducida en células DU145. 5 'región reguladora aguas arriba de
hsa-miR-765
se clonó en un vector de luciferasa. Se compararon las actividades reportero con ERβ-desmontables (siERβ) o scramble-control negativo (SINEG) en presencia de fulvestrant (n = 3). (C) Supresión análisis de mapeo define un segmento de fulvestrant sensible en
hsa-miR-765
región reguladora en células DU145. secuencia de ADN aguas arriba 5 'de
hsa-miR-765 En venta nt. -3208-100 se analizó utilizando el sistema indicador de luciferasa. Se realizaron deleciones en serie a partir del extremo 5 'de la secuencia clonada en el vector. actividades Reporter se compararon entre las células tratadas con fulvestrant (fulvestrant) y control (EtOH) para cada vector reportero (n = 3). (D) El fulvestrant-induce el reclutamiento de ERβ en el
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región reguladora putativo. Cromatina inmunoprecipitación reveló el reclutamiento de ERβ a una secuencia en la región reguladora 5 'de
HSA-miR765
. IgG de ratón y la ARN polimerasa II sirven como control negativo y positivo, respectivamente. El fulvestrant inducido 17 veces de incremento en el reclutamiento ERβ en comparación con la región de unión no ERβ (el promotor 0N de ERβ [33], [41]). Se realizó la prueba t de Student para determinar la significación de entre los grupos utilizando un valor de corte de 0,05 p. ** P & lt; 0,01; bar = S. D.
E. HMGA1 es un objetivo de
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análisis bioinformático con múltiples programas de predicción de genes miARN objetivo sugerido HMGA1 como un objetivo de
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; un sitio de reconocimiento conservada en 8982-9002 con -22,6 kcal /mol de mínimo de energía libre se predijo (Figura 5A, Tabla S4). Reportero ensayos demostraron que la transfección de
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mímica, pero no de un control negativo mímica, disminuyó significativamente
HMGA1 3 'UTR
actividad luciferasa dependiente (Figura 5B); no se observó diferencia en las células DU145 que llevan el vector PMIR vacío. Es importante destacar que la transfección de los
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imitador bloqueó completamente la expresión de la proteína HMGA1 (panel superior Figura 5C), junto con una ligera reducción en el nivel de mRNA (Figura 5C, panel inferior). De interés, el tratamiento con fulvestrant también cerró efectivamente la expresión de la proteína HMGA1 (Figura 5D). Estos datos apoyan un papel inhibitorio de
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sobre la expresión HMGA1 a nivel de proteínas y un papel mediador en la acción fulvestrant en células de CaP. Por último, la expresión ectópica de HMGA1 reduce eficazmente el efecto inhibidor del crecimiento de fulvestrant en las células DU145 (Figura 5E), un resultado que concuerda con la acción oncogénica informado de HMGA1 en la próstata [40]
.
(A) El 3 'UTR de
HMGA1 En venta 8.910 a 8.929 mil se prevé que sea
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sitio de unión. (B)
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interactúa con 3'UTR de
HMGA1
en un ensayo indicador de focalización. DU145 células fueron transfectadas con cualquiera PMIR-vacío o PMIR-HMGA1-3UTR en la que 3 'UTR de
HMGA1 gratis (+ + 8026- 9332) se clonó en el extremo 3' de la luciferasa. reportero actividades de las células transfectadas PMIR-HMGA1-3UTR tratados con
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imitan o control negativo imitador se comparan (n = 3). (C)
HSA-mir-765
imitan reducen la expresión de proteínas en las células DU145 HMGA1. Las proteínas y los niveles de mRNA de HMGA1 en el
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mimic- y células-mímica con tratamiento de control negativo se determinaron mediante análisis de transferencia Western (superior) y análisis por RT-PCR en tiempo real (inferior), respectivamente. Los resultados de
miR-765
imitan vs control negativo imitador se comparan (n = 3). (D) El fulvestrant reduce la expresión de proteínas en las células DU145 HMGA1. nivel de proteína de HMGA1 y β-actina en las células de control-fulvestrant tratados y tratados con etanol (CTL) se determinaron por análisis de transferencia Western. (E) La expresión ectópica de bloques HMGA1 inhibición del crecimiento celular inducida fulvestrant DU145. Se determinó el crecimiento celular relativa después de 4 días de tratamiento con fulvestrant o etanol después de la transfección estable de
HMGA1
(o vector vacío para control) durante una semana. Los niveles de proteína de HMGA1 se muestran en la Figura S6. El crecimiento celular de células de fulvestrant tratados con sobreexpresión HMGA1 vs vector vacío se compara (n = 8). Se realizó la prueba t de Student para determinar la significación entre los grupos utilizando un valor de corte de 0,05 p. ** P & lt; 0,01; bar = S. D.
F.
HSA-mir-765
es elevada pero la proteína HMGA1 se reduce en el CaP tratados con fulvestrant especímenes
tejidos de prostatectomía se obtuvieron de pacientes con CaP localizado que recibieron o no recibieron tratamiento fulvestrant (250 mg, im 28 días antes de la prostatectomía). Los análisis en tiempo real RT-PCR mostró la regulación positiva de
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ARNm (de 2,7 veces,
p Hotel & lt; 0,05, n = 7) en el CaP muestras de pacientes de fulvestrant tratados en comparación con los de los controles no tratados (n = 7) (Figura 6A). En contraste, los análisis inmunohistoquímico reveló una marcada reducción en immunopositivity HMGA1 en muestras de pacientes tratados con fulvestrant (Figura 6B). HMGA1 fue localizada principalmente en los núcleos de células de CaP en los focos de cáncer, con sólo el débil tinción citoplásmica en las células del estroma. La inmunotinción fue insignificante en los especímenes tratados con fulvestrant en casi todos los focos de cáncer (Figura 6C,
p
& lt; 0,01, n = 5). receptor de andrógenos se había demostrado que ser regulados a la baja por el fulvestrant en un roedor [41] y un modelo celular [21]. Aquí, demostramos AR también se downregulated significativamente en nuestro estudio clínico (Figura 6B y C).