Extracto
indoleamine 2,3-dioxigenasa-1 (IDO) es una enzima reguladora inmune humana expresada por la mayoría tumores. los niveles de IDO en las células tumorales se correlaciona con el aumento de la metástasis y mal pronóstico del paciente y IDO está vinculada a la resistencia del tumor de células para inmunoterapia, terapia de radiación, y quimioterapia. El conocimiento de los efectos de las células tumorales autónoma de IDO, independiente de su conocido papel en la regulación y la supresión de las respuestas inmunitarias antitumorales, es limitada. poblaciones clonales de células de adenocarcinoma de pulmón humano A549 transfectadas de forma estable con anti-IDO shRNA o control mezclado shRNA se utilizaron para estudiar los efectos sobre la sensibilidad a las drogas IDO y resistencia. IFN fue utilizado para inducir IDO en esas células. Se demuestra, por primera vez, que IDO media la resistencia de células tumorales humanas a los fármacos candidatos contra el cáncer FK866 (un NAD
+ inhibidor), metoxiamina (MX, una reparación por escisión de base [REC] inhibidor) y medicamentos contra el cáncer aprobados pemetrexed ( un folato anti-metabolito) y gemcitabina (un análogo de nucleósido), y tratamiento combinado con pemetrexed y MX, en ausencia de las células inmunes. caída simultánea de IDO y timidilato sintasa (TS, una enzima clave que limita la velocidad en la síntesis y reparación del ADN) sensibiliza a las células cancerosas de pulmón humano con pemetrexed y 5FUdR en un grado mayor que desmontables de cualquiera de los objetivos por sí sola. Se concluye que la BER en células A549 Ido-expresando juega un papel importante en la mediación de la resistencia a una amplia gama de medicamentos aprobados y contra el cáncer candidato. inhibidores de IDO son sometidos a ensayos clínicos sobre todo para mejorar las respuestas inmunitarias antitumorales. Se demuestra que la orientación IDO solo o en combinación con TS es una estrategia terapéutica potencialmente valiosa para el tratamiento del cáncer, independiente de la actividad inmune y en combinación con la quimioterapia convencional
Visto:. Maleki Vareki S, Chen D, Di Cresce C , Ferguson PJ, Figueredo R, Pampillo M, et al. (2015) IDO regulación a la baja sensibilidad Induce a pemetrexed, gemcitabina, FK866, y metoxiamina en células de cáncer humano. PLoS ONE 10 (11): e0143435. doi: 10.1371 /journal.pone.0143435
Editor: Aamir Ahmad, Escuela de Medicina de la Universidad Estatal de Wayne, Estados Unidos |
Recibido: 24 Junio, 2015; Aceptado: 4 de noviembre de 2015; Publicado: 18 Noviembre 2015
Derechos de Autor © 2015 Maleki Vareki et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel y su archivo de información de apoyo
Financiación:. el trabajo fue financiado por los Institutos canadienses de Investigación en Salud (http://www.cihr-irsc.gc.ca/e/193.html) (RP-827270 y RP-123454). La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el IDO molécula inmunorreguladora es un hemoprotein 45 kDa esencial para el catabolismo oxidativo de triptófano en la vía de quinurenina [1]. IDO cataliza la escisión oxidativa del doble enlace 2,3 en el resto indol de L-triptófano, lo que resulta en la producción de la primera vía de quinurenina metabolito, N-formil quinurenina [2]. El producto final de la vía de quinurenina es el ácido quinolínico (QA) que se puede convertir en NAD
+ en células de mamífero. Nosotros y otros han demostrado que IDO proporciona una fuente de NAD
+ a las células de catabolismo del triptófano [3,4]. IDO puede ser inducida en la mayoría de las células humanas, especialmente células presentadoras de antígeno (APCs), por las citoquinas inflamatorias tales como el interferón gamma (IFN), factor de necrosis tumoral (TNF) -α, y la infección [5,6]. Sin embargo, la mayoría de los tumores humanos expresan [7] IDO, lo que contribuye a la tolerancia y la supresión del sistema inmune inducida por tumor. IDO induce un estado tolerogénico en el microambiente del tumor y los ganglios linfáticos de drenaje del tumor [8].
En la mayoría de los estudios del paciente, la expresión de IDO se ha correlacionado con una disminución de la supervivencia global y la disminución de la supervivencia libre de progresión [9] . Por otra parte, IDO se ha relacionado con el aumento de la metástasis en diversos cánceres humanos, incluyendo carcinoma de pulmón no microcítico (CPNM), cáncer de mama y cáncer colorrectal [10-12]. Además, los pacientes con cáncer avanzado de ovario etapa, carcinoma nasofaríngeo y cáncer de endometrio tenían niveles altos IDO en sus tumores [13].
IDO también es importante en el desarrollo de la resistencia a la inmunoterapia. Se ha sugerido que IDO juega un papel importante en la resistencia a ipilimumab [14]. En un modelo de ratón transgénico de cáncer de mama en el que los tumores se indujeron por la expresión del oncogén Neu bajo el control del virus de tumor mamario de ratón (MMTV), la inhibición IDO con 1-metil triptófano (1-MT) se combinó con paclitaxel, un agente quimioterapéutico que se usa comúnmente para tratar el cáncer de mama [15]. La combinación dio lugar a la regresión del tumor en animales portadores de tumores [15]. Sorprendentemente, el agotamiento de CD4
+ T células o el uso de ratones atímicos de células deficientes en T en lugar de ratones inmunocompetentes abolió el efecto del tratamiento combinado, lo que indica un efecto inmune mediada por el bloqueo de IDO en el contexto del tratamiento de paclitaxel [15] .
Varios estudios clínicos han sugerido que los niveles elevados de IDO durante el tratamiento podrían estar relacionados con un mal resultado a la quimioterapia y /o radioterapia y, tal vez, contribuye a la resistencia a la terapia [16-18]. En un estudio de un solo brazo de fase II en pacientes con NSCLC en estadio III, los pacientes fueron tratados con gemcitabina inducción seguida de carboplatino concurrente, paclitaxel y 74 Gray (Gy) de radiación torácica [16]. Los pacientes con cáncer mostraron una alta actividad de IDO como se deduce de quinurenina /ratios de triptófano séricos más altos medidos en comparación con los controles sanos. Esta actividad alta IDO después de la quimioterapia se asocia con un peor pronóstico del paciente, aunque el poder estadístico del estudio estaba limitado por el número relativamente bajo de pacientes [16].
En otro estudio, IDO se asoció positivamente con la quimio-resistencia en un perfil de expresión génica estudio tuvo como objetivo identificar moléculas asociadas con la resistencia a la quimioterapia con paclitaxel en líneas celulares de cáncer de ovario y especímenes quirúrgicos refractarios de cáncer de ovario [17]. IDO fue altamente expresado en ambas líneas celulares resistentes a paclitaxel y tumores ováricos refractarios, pero estuvo ausente en las líneas y los tumores de células sensibles a paclitaxel [17].
En un estudio clínico que analizó la respuesta de pacientes con CPNM a la quimioterapia basada en platino en una pequeña cohorte de pacientes, la expresión de IDO en monocitos y granulocitos se analizó el tratamiento previo y posterior. La población de pacientes que se beneficiaron del tratamiento mostró expresión IDO más bajos en la sangre monocitos después del tratamiento [18].
Hemos demostrado que IDO confiere resistencia al cisplatino, olaparib, y γ-radiación en el A549, Hela, y células H441, independientemente de la participación directa inmune [4]. IDO downregulation también disminuyó intracelulares NAD
+ niveles en células de cáncer [4]. NAD
+ es necesario para la poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) de función [19]. El reclutamiento de la proteína BER andamio de proteínas de reparación de rayos X complementario cruzado de 1 (XRCC1) a la zona dañada del ADN es estrictamente dependiente de poli-ADP-ribosilación [20]. función de PARP, por tanto, afecta directamente a BER, un mediador crítico de la resistencia de las células del cáncer a los efectos genotóxicos de γ-radiación y un número de agentes de quimioterapia incluyendo cisplatino, pemetrexed, y gemcitabina [21,22]. Por lo tanto, la expresión de IDO en células de cáncer potencialmente podría mejorar la BER en estas células e inducir la resistencia a dichos agentes.
Nos muestran, por primera vez, que la expresión de IDO en células de cáncer, independiente del sistema inmunológico, confiere resistencia a la NAD
+ inhibidor de FK866 y el inhibidor de la BER MX. Por otra parte, IDO downregulation sensibiliza las células cancerosas al pemetrexed y gemcitabina, los cuales se dirigen a la timidilato sintasa (TS), pero no el medicamento TS-focalización 5FUdR. IDO regulación a la baja también sensibiliza las células A549 con pemetrexed y el tratamiento combinado MX. Por último, la regulación por disminución simultánea de IDO y TS aumentó la capacidad de regulación a la baja IDO y regulación a la baja de TS para sensibilizar a las células A549 con pemetrexed y 5FUdR, respectivamente.
Materiales y Métodos
Cell Culture
células A549 de adenocarcinoma de pulmón humano se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, CCL-185), y se mantuvieron en medio esencial mínimo α (MEMα). Las células A549 se STR huellas digitales y validadas por la prueba Radil de ser libres de micoplasma. medios cultivadas fueron suplementados con 10% de suero fetal bovino (FBS) (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, California, EE.UU., catálogo#325-043-EL), 100 unidades /ml de penicilina y 100 mg de estreptomicina (penicilina /estreptomicina) (Gibco , Life Technologies, Carlsbad, California, EE.UU., catálogo#15140-122) en 70 cm
2 frascos de Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, EE.UU.). Las células se mantuvieron a 37 ° C en 5% de CO2. Para la mayoría de experimentos, se permitió a las células a proliferar a no más de 70 a 80% de ocupación máxima en el plástico de cultivo de tejidos (
i
.
e
., 70-80% de confluencia).
Ensayo de proliferación (Recuento celular)
proliferación de células tumorales después de siRNA transfección y /o tratamiento de drogas se describió anteriormente [23]. Brevemente, las células A549 se lavaron con PBS, se tripsinizaron, y se contaron usando un Coulter Z1 contador de partículas Beckman (Beckman, Mississauga, Ontario) 72 h después del tratamiento. El factor de cambio en el número de células después de 3 días de crecimiento (en relación con el número inicial de células sembradas) se calculó como:
Las diferencias en la proliferación inducida por el tratamiento se expresaron como "Proliferación (% de control)" y se calcularon de acuerdo con la siguiente fórmula:
fármacos citotóxicos
5FUdR se adquirió de Sigma Chemical Co. (St. Louis, Missouri, EE.UU.). El pemetrexed (Alimta, Eli Lilly and Co., Toronto, Ontario, Canadá) se obtuvo de la farmacia London Health Sciences Centre (Londres, Ontario, Canadá). MX y FK866 se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, EE.UU.).
Detección y medición de la proteína TS
A549 células fueron cultivadas en 75 cm
2 frascos. Las células se incubaron durante 96 h post TS siRNA transfección, se lavaron dos veces con PBS enfriado en hielo, se recogieron, y se sonicaron. Las células lisadas se centrifugaron a 20.000 X g durante 15 min a 4 ° C y el sobrenadante se recogieron y se almacenaron a -80 ° C para uso futuro. Los extractos de proteína (20 mg) se cuantificaron por ensayo de proteínas BioRad, separados por electroforesis a través de un gel de poliacrilamida 12%, y entonces transferidos electro a una membrana de nitrocelulosa. TS anticuerpo monoclonal (Taiho Pharmaceutical, Hanno-City, Japón) fue proporcionado amablemente por el doctor Masakazu Fukushima (Taiho productos farmacéuticos, Centro de Investigación Hanno, Hanno-City, Japón). anticuerpo monoclonal actina (Sigma, St. Louis, MO) se utilizó para detectar y cuantificar la actina. anti-ratón secundaria y anti-IgG de conejo (anticuerpos completos peroxidasa ligada; GE Healthcare Life Sciences) se unieron a los anticuerpos primarios IDO y actina, respectivamente. Los complejos anticuerpo-proteína se visualizaron utilizando un escáner Storm (GE Healthcare Life Sciences). Gratis (4 5x10
) se sembraron
El pemetrexed, FK866, metoxiamina y Tratamiento 5FUdR
células A549 en 25 cm
2 frascos de 2 ml de MEMα suplementado con FBS al 10% más penicilina /estreptomicina. El medio se reemplazó con medio de cultivo fresco con o sin IFN (25 ng /ml) 16 a 24 h después de la siembra. Veinticuatro o 48 h después de la adición de IFN, el medio se reemplazó con medio fresco que contiene ya sea pemetrexed (200 nM), FK866 (5 nM), MX (3 mM) o 5FUdR (40 nM). Tres días después de la adición de los fármacos, las células se lavan para eliminar las células muertas y partículas. Las células adherentes se tripsinizaron y se cuentan usando un contador Coulter (Beckman, Mississauga, ON). La viabilidad de las células contadas fue confirmada por exclusión de azul de tripano.
El tratamiento combinado con pemetrexed y metoxiamina
células A549 (5x10
4) fueron cultivados y co-tratados con pemetrexed (30 nM ) y MX (3 mM) tal como se describe anteriormente. Las células se dejaron proliferar en cultivo durante 72 h. Las células fueron entonces con tripsina y las células vivas se contaron usando un contador Coulter.
IDO regulación a la baja
células A549 humanas fueron transfectadas de forma estable con ARN corto horquilla (shRNA) con una secuencia de control mezclado no complementaria a conocidas secuencias de ARN humanos, o antisentido a IDO1 humano o (SuperArray, Mississauga, ON; usando Lipofectamine 2000 (LFA2K) (Invitrogen, Burlington, ON, Canadá), y poblaciones clonales individuales con control mezclado (SCR) shRNA o anti-IDO shRNA aislado como se describe anteriormente [4]. en resumen, un millón de células A549 se sembraron durante la noche en 2 ml de MEMα suplementado con 10% de FBS. las células fueron 70% de confluencia en el día de la transfección. Diez microgramos de anti-IDO shRNA plásmido o el control mezclado shRNA plásmido se mezclaron con 10 LFA2K l y 125 medio libre de suero l Después de 20 min de incubación a temperatura ambiente, la shRNA:. complejo LFA2K se añadió a las células transfección continuó durante 4 h antes de añadir 4 ml de MEMα fresco suplementado con 10%. FBS. Veinticuatro horas después de la transfección, las células se transfirieron a 14 cm placas de cultivo de tejido de plástico que contienen 20 mg de puromicina (Bioshop Canadá, Inc., Burlington, ON). Se seleccionaron colonias individuales y se cultivaron en placas de 48 pocillos en presencia de 2 g de puromicina. IDO ARNm y proteínas se midieron en todos los clones seleccionados después de la inducción con IFN.
TS y BRCA2 siRNA transfección y tratamiento de drogas
TS siRNA número 3 o TS siRNA número 4 (Tabla 1), la orientación diferentes regiones del ARNm humano TS [OnTarget Plus (RNAi Dharmacon Technologies, Lafayette, CO, EE.UU.)] y que la reducción de ARNm diana en aproximadamente un 70% en 24 h después de la transfección, se utilizaron para regular a la baja transitoria TS mRNA en células cancerosas A549. Las concentraciones de siRNAs dirigidos tipo-2 proteína de susceptibilidad al cáncer de mama humano (BRCA2) [OnTarget Plus SmartPool BRCA2 (Dharmacon RNAi Technologies)] (Tabla 1) que transitoriamente reducida ARNm diana en aproximadamente un 70% en 24 h después se determinó la transfección (10 nM) . TS siRNA (5 nM), BRCA2 siRNA (10 nM), y el control de la orientación no siRNA (2,5 o 5 nM) en MEMα libre de suero y LFA2K (2,5 g /ml) se incubaron juntos durante 20 min. A continuación se añadió la mezcla LFA2K a las células A549 que había sido sembrada, por triplicado, a 2 x10
5 células por 25 cm
2 matraz de 24 h de antemano: El siRNA. A las 4 h después de la adición de siRNA: LFA2K, los medios se cambió por medio de cultivo fresco que contiene IFN (25 ng /ml). Medio fue reemplazado 48 h después con medio que contiene pemetrexed fresco o 5FUdR. proliferación de células tumorales se enumeró 72 h más tarde mediante un contador de partículas electrónico (Beckman Coulter).
In vivo Modelo de tumor
clones A549 NC-3 y 2-18 fueron descritas anteriormente [4]. Se inyectaron células tumorales en 50 ciento Matrigel (gel de ECM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) por en los flancos de ratones Fox Chase SCID (1 x 10
7 células por punto de inyección) (n = 5 ratones por grupo ). Una vez que los tumores alcanzaron ~ 300 mm
3 ratones fueron tratados (día 0) con diluido en PBS recombinante humana IFN (100.000 UI, ip, dos veces por semana durante cuatro semanas) (amplificador de investigación y desarrollo; D Systems, 285-IF /CF, Minneapolis, MN) y /o PBS-diluyeron pemetrexed (50 mg /kg, ip, una vez por semana durante cuatro semanas). volúmenes de los tumores se estimaron a partir de medidas de la pinza de longitud y anchura y calculan de acuerdo con la siguiente fórmula: π /6 x (diámetro más largo) x (diámetro menor)
2. manejo y procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con la guía de la experimentación con animales y los protocolos de uso de la Subcomisión de la Universidad de Ontario Occidental animal.
t
prueba
Análisis estadístico
de Student ( 2-colas) se utilizó para determinar las diferencias entre los dos medios. Utilizó un modelo lineal se utilizó para evaluar las diferencias entre los múltiples medios. Un
fue seleccionado p
valor de 0,05
a priori
para indicar diferencias significativas. En algunos análisis, los datos se agruparon de poblaciones clonales que expresaban A549 anti-IDO shRNA y se compararon con las mediciones agrupadas de múltiples clones que expresan revueltos control de shRNA. En ciertos casos, la fuerza de la correlación lineal entre la proteína IDO y la proliferación celular se determinó mediante el cálculo del coeficiente de determinación (r
2) entre las 2 variables utilizando GraphPad Prism 6.
Resultados
IDO confiere resistencia a NAD
+ inhibidor de FK866
FK866 es un inhibidor farmacológico de NAD
+ síntesis a partir de la vía de recuperación y se está evaluando para eficacia anticancerosa clínica [24]. IDO-expresando células cancerosas se han elevado NAD
+ [4]. IDO downregulation también disminuye intracelulares NAD
+ niveles en células de cáncer en un 60% [4]. Por lo tanto, hemos examinado si la elevación IDO mediada por NAD
+ niveles tiene el potencial de contrarrestar el efecto terapéutico de FK866. Después de la estimulación IFN de IDO, los clones A549 NC-3, NC-10, y NC-30 (transfectadas establemente con el control, revueltos shRNA) mostró una mayor resistencia al efecto antiproliferativo de FK866 de clones A549 2-6 y 2-8 (transfectadas establemente con anti-IDO shRNA), con la única diferencia entre los clones NC-30 y 2-6 que no alcanzaron la significación (figura 1A y 1B). Cuando los datos de las 3 poblaciones clonales transfectadas de forma estable con control mezclado shRNA se combinaron y se compararon con los datos combinados de las 2 poblaciones clonales transfectadas de forma estable con anti-IDO shRNA, la antigua (
i
.
e
., clones A549 con IDO no reducido) fueron significativamente más resistentes (en aproximadamente un 20%) a FK866 después de IFN inducción de IDO (Fig 1C). No hubo diferencia en la sensibilidad entre los clones que albergan control mezclado shRNA y anti-IDO shRNA antes del tratamiento de IFN, lo que indica que las características clonales basales, no inducidas por IFN, no eran responsables de las diferencias en la sensibilidad a FK866. También había una correlación modesta positivo lineal (R
2 = 0,72) entre los niveles de proteína IDO después de la inducción de IFN medido en los 5 poblaciones clonales, y la resistencia a FK866 (Fig 1D).
proliferación de cada una de 5 células A549 poblaciones clonales individuales antes (Panel A) y después (Panel B) inducción IDO con IFN. poblaciones de células clonales A549 se cultivaron con o sin IFN (25 ng /ml) durante 48 h. a continuación, el medio se reemplazó con medio de crecimiento fresco que contiene FK866 (5 nM) y las células se les permitió proliferar durante 72 h. Las células fueron tripsinizadas y se enumeraron las células vivas. Las barras blancas: clones A549 transfectadas con huevos revueltos, el control no director shRNA. Las barras grises: las células A549 transfectadas con anti-IDO shRNA. Los resultados son normalizados a control de las células no tratadas con FK866, sin (panel A) o con el tratamiento (panel B) IFN. Cada barra representa la media de 3 valores (
n
= 3) ± SD, (*, p = 0.05). Panel C: A549 resistencia clonal a FK866 antes y después de la inducción mediada por IFN IDO. Los resultados agrupados se obtuvieron de 3 o 2 poblaciones A549 independiente clonales transfectadas de manera estable con shRNA (barras blancas) revueltos o 2 anti-IDO shRNA (barras negras), respectivamente, antes y después de la inducción de IDO. Cada barra representa una media de 9 (barras blancas) o 6 (barras negras) Los valores ± SEM, Diferencia significativa, Estudiante de
t-test
,
p Hotel & lt; 0,05. Panel D:. El análisis de correlación de la relación entre el contenido de proteína IDO (con respecto a la actina) y la resistencia de la población clonal a FK866 (proliferación respecto a las células control no tratadas)
IDO en células tumorales humanas media la resistencia a la Base Excision Repair inhibidor metoxiamina
NAD
+ es importante para la función de PARP y PARP es esencial para el reclutamiento de la proteína XRCC1 BER andamio de ADN dañado [20]. A la luz de nuestro informe anterior que IDO juega un papel en la mediación de la resistencia a la olaparib inhibidor de PARP [4], la capacidad de IDO para mediar resistencia al inhibidor de BER MX fue examinado. Antisentido desmontables de IDO sensibilizado IFN inducida clones A549 2-6 y 2-18 (que albergan anti-IDO shRNA) para MX, mientras que los clones A549 NC-3, NC-10, y NC-30 (transfectadas con control mezclado shRNA) eran no sensibilizados (Fig 2A y 2B). Cuando los datos de las 3 poblaciones clonales con control de shRNA se combinaron y se compararon con los datos combinados de los 2 poblaciones clonales con anti-IDO shRNA, IDO inducida por IFN mediada un aumento de 6 veces en la resistencia a los efectos anti-proliferativos de MX y la presencia de anti-IDO shRNA abolió ese aumento (Fig 2C). Hubo una correlación moderada entre el nivel IDO y resistencia MX entre los 5 inducida por IFN poblaciones clonales [R
2 = 0,83] (Figura 2D). Estos resultados sugieren que IDO en células de cáncer mejora la función de las proteínas de BER, y la reducción mediada por antisentido de bloques IDO que mejora.
proliferación de cada una de las poblaciones clonales de células A549 5 individual antes (Panel A) y después ( El panel B) inducción con IFN IDO. poblaciones clonales A549 se cultivaron con o sin IFN (25 ng /ml) durante 48 h. a continuación medio de cultivo fue reemplazado con medio fresco de cultivo que contiene metoxiamina (MX) (3 mM) y las células se les permitió proliferar durante 72 h. Las células fueron tripsinizadas y se enumeraron las células vivas. Las barras blancas: clones A549 transfectadas con huevos revueltos, el control no director shRNA. Las barras grises: las células A549 transfectadas con anti-IDO shRNA. Cada barra representa la media de 3 valores (
n = 3
para la determinación de cada valor) ± SD. Los resultados son normalizados a control de las células no tratadas con metoxiamina, sin (panel A) o con el tratamiento (panel B) IFN. Panel C: Inducción de IDO en las poblaciones de células clonales A549 induce resistencia a MX (3 mM). Los resultados se obtuvieron a partir de 3 o 2 poblaciones celulares clonales independientes con huevos revueltos, no de metas de control de shRNA o anti-IDO shRNA, respectivamente. Cada barra representa una media de 9 (barras blancas) o 6 (barras negras) Los valores ± SEM, * Diferencia significativa, Estudiante de
t-test
,
p Hotel & lt; 0,05. Panel D: Relación entre el nivel de proteína IDO (con respecto a la actina) y resistencia a metoxiamina (MX) (proliferación respecto a las células control no tratadas). El R
2 valor de 0,83 representa una relación positiva moderada.
IDO en células tumorales humanas media la resistencia a la TS-dirigida de fármacos pemetrexed
TS es importante en la reparación del ADN y la síntesis de ADN y se sobreexpresa en la mayoría de los cánceres humanos [25]. El pemetrexed drogas TS-focalización se utiliza comúnmente para tratar varios tipos de cánceres humanos, incluyendo NSCLC y mesotelioma pleural [26]. BER es informado de que importante en la resistencia de células de cáncer a este fármaco. Hemos demostrado que antes de IDO aumentó NAD
+ niveles en las células del cáncer [4]. A la luz de nuestros hallazgos que IDO confiere resistencia al inhibidor de BER MX (figura 2), nos pusimos a examinar si la presencia de IDO afectó a la sensibilidad de las poblaciones de células clonales A549 a la expresión IDO pemetrexed, lo que podría vincular con la función de BER mejorado en las células cancerosas . poblaciones de células A549 clonales que albergan control mezclado shRNA (3 clones) o anti-IDO shRNA (2 clones) fueron tratadas con o sin IFN para 48 h y luego con pemetrexed (200 nM) y se dejó proliferar durante 72 h. No hubo diferencias significativas en la sensibilidad a pemetrexed entre los 5 clones antes de la inducción de IFN, si los clones fueron evaluados de forma individual (Fig 3A) o significan sensibilidad relativa de las 3 de control de clones ARNhc (n = 3 evaluaciones de cada clon) se comparó con la significa sensibilidad relativa de los 2 clones anti-shRNA (n = 3 evaluaciones de cada clon) (figura 3C). regulación a la baja antisentido mediada de IDO inducida por IFN, en contraste, sensibilizadas cada uno de los 2 clones que albergan anti-IDO shRNA al pemetrexed, en comparación con los 3 clones albergar revuelto control de shRNA (Fig 3B). Cuando proliferación media de clones control y anti-IDO shRNA después de la inducción de IFN se comparó, aquellos que alberga anti-IDO shRNA fueron aproximadamente dos veces más sensible al pemetrexed (figura 3C). reducción antisentido mediada en IDO, por lo tanto, sensibilizadas poblaciones clonales A549 al pemetrexed.
proliferación de cada una de las poblaciones clonales de células A549 5 individual antes (Panel A) y después (Panel B) inducción IDO con IFN. poblaciones clonales A549 se cultivaron con o sin IFN (25 ng /ml) durante 48 h, a continuación, con pemetrexed (200 nM), y se enumeran 72 h más tarde. Las barras blancas: clones A549 transfectadas con huevos revueltos, el control no director shRNA. Las barras grises: las células A549 transfectadas con anti-IDO shRNA. Cada barra representa la media de 3 valores (
n
= 3) ± SD. Los resultados son normalizados a las células de control no tratados con pemetrexed, sin (panel A) o con el tratamiento (panel B) IFN. Panel C: Inducción de IDO en células clonal A549 induce resistencia a pemetrexed (200 nM). Los resultados se obtuvieron a partir de 3 o 2 poblaciones celulares clonales independientes con huevos revueltos, no de metas de control de shRNA o anti-IDO shRNA, respectivamente. Cada barra representa una media de 9 (barras blancas) o 6 (barras negras) los valores ± SEM. * Diferencia significativa, de Student
t-test
,
p
. & Lt; 0,05
IDO en células tumorales humanas media la resistencia al tratamiento combinado de pemetrexed y metoxiamina
Una fase I de ensayos clínicos del combinado MX y pemetrexed se ha completado (NCT00692159) y la fase II de ensayos clínicos de que la combinación de fármacos en múltiples indicaciones, incluyendo CPNM se han previsto (NCT01851369, NCT02395692, NCT02535325 y NCT02535312) [26] . En vista de nuestra observación de la resistencia IDO mediada a ambos pemetrexed y MX, se planteó la hipótesis de que IDO podría inducir resistencia a combinada MX y tratamiento pemetrexed. Para probar esta hipótesis, IDO se indujo en las poblaciones de células clonal A549 y entonces esas poblaciones fueron tratados con una combinación de pemetrexed (30 nM) y MX (3 mM) y la proliferación evaluado después de 72 h. Similar a lo que se observó después del tratamiento con MX o pemetrexed como agentes únicos, downregulation sensibilizado células cancerosas IDO a tratamiento combinado (Fig 4A y 4B). Además, después de IFN inducción de IDO y la exposición a pemetrexed y MX combinada, cuando se compararon los valores medios de proliferación para los 3 clones de control en el sentido de los valores de proliferación para los 2 clones de control (n = 3 evaluaciones para cada clon), células que albergan anti-IDO shRNA fueron 7 veces más sensible al tratamiento farmacológico combinado de células con control mezclado shRNA (Fig 4C). Antes de la inducción de la expresión de IFN IDO, no hubo diferencias (Fig 4C). Hubo una relación positiva entre la modesta cantidad de IDO en células tumorales inducida por IFN y su resistencia al tratamiento combinado con estos dos fármacos (figura 4D, R
2 = 0,70). Estos datos indican la importancia de IDO en la mediación de la resistencia a los agentes terapéuticos, tanto solos y en combinación.
proliferación de cada una de las poblaciones clonales de células A549 5 individual antes (Panel A) y después (Panel B) inducción IDO con IFN . poblaciones clonales A549 se cultivaron con o sin IFN (25 ng /ml) durante 48 h. a continuación medio de cultivo se reemplazó con medio de cultivo fresco que contiene pemetrexed (30 nM) y metoxiamina (MX) (3 mM). Las células tumorales se dejaron proliferar durante 72 h, a continuación enumerados. Las barras blancas: clones A549 transfectadas con huevos revueltos, el control no director shRNA. Las barras grises: las células A549 transfectadas con anti-IDO shRNA. Cada barra representa la media de 3 valores (
n
= 3) ± SD. * Diferencia significativa, Estudiante de
t-test
,
p Hotel & lt; 0,05. Los resultados son normalizados a las células de control no tratados con pemetrexed y metoxiamina, sin (panel A) o con el tratamiento (panel B) IFN. Panel C: Inducción de IDO en células clonal A549 induce resistencia a pemetrexed combinado (30 nM) y el tratamiento MX (3 mM). Los resultados se obtuvieron a partir de 3 poblaciones celulares clonales independientes con control mezclado shRNA o anti-IDO shRNA, y cada barra representa una media de 9 (barras blancas) o 6 (barras negras) los valores ± SEM (*
p Hotel & lt ; 0,05). Panel D: relación entre la proteína IDO (con respecto a la actina) y la resistencia de la población clonal a pemetrexed combinado y la proliferación tratamiento MX relación con las células de control no tratadas). El R
2 valor de 0,72 representa una relación positiva moderada.
IDO regulación a la baja sensibiliza las células tumorales humanas a la gemcitabina
IDO downregulation sensibiliza a las células cancerosas a la droga pemetrexed TS-focalización (Fig 3). BER también se considera que desempeñan un papel importante en la resistencia a otro TS-dirección de fármaco, gemcitabina [27]. Por lo tanto, la hipótesis de que IDO regulación a la baja sería sensibilizar a las células A549 a gemcitabina y, como se describe para pemetrexed y MX, este fue el caso (Fig 5A y 5B). Cuando los datos de las 3 de control de las poblaciones de células clonal se combinaron y se compararon con los datos combinados de las 2 poblaciones clonales anti-contiene-ido-(n = 3 evaluaciones de la proliferación para cada clon), células con anti-IDO shRNA fueron dos veces más sensible a la gemcitabina después de la inducción de IFN como células de control (Fig 5C). No hubo diferencias entre las células de control y anti-IDO shRNA en la sensibilidad a la gemcitabina antes del tratamiento IFN, ni hubo una diferencia de sensibilidad entre las células de control tratadas y no tratadas con IFN (Figura 5C). Estos datos sugieren que IDO regulación a la baja puede reducir la resistencia al tratamiento BER mediada en células de cáncer.
proliferación de cada una de las poblaciones clonales de células A549 5 individual antes (Panel A y C) y después (Panel B y C) IDO inducción con IFN. poblaciones clonales A549 se cultivaron con o sin IFN (25 ng /ml) durante 48 h, se trató con gemcitabina (10 nM) durante 72 h y, a continuación enumerados. Las barras blancas: clones A549 transfectadas con huevos revueltos, el control no director shRNA. Las barras grises: las células A549 transfectadas con anti-IDO shRNA. Cada barra representa una media de 9 (barras blancas) o 6 (barras negras) Los valores ± SD para paneles A y B y SEM para el panel C, (*
p Hotel & lt; 0,05). Los resultados son normalizados a las células de control no tratados con gemcitabina, sin (panel A) o con el tratamiento (panel B) IFN. Paneles D-F: Proliferación de cada uno de 5 poblaciones clonales de células A549 individuales antes y después de la inducción con IFN IDO. poblaciones clonales A549 se cultivaron con o sin IFN (25 ng /ml) durante 48 h y, 5FUdR (200 nM) durante 72 h y, a continuación enumerados. Las barras blancas: clones A549 transfectadas con huevos revueltos, el control no director shRNA. Las barras grises: las células A549 transfectadas con anti-IDO shRNA. Cada barra representa una media de 9 (barras blancas) o 6 (barras negras) Los valores ± SD para paneles D y E y SEM para el panel F ± SD. * Diferencia significativa, Estudiante de
t-test
,
p Hotel & lt; 0,05. Los resultados se normalizan con las células control no tratadas con 5FUdR, sin (grupo A) o con (panel B) de tratamiento IFN.
IDO regulación a la baja ¿No sensibilizar a las células tumorales humanas a 5FUdR
en contraste con el papel de la BER en respuesta a pemetrexed, MX, y gemcitabina, BER se ha sugerido para mejorar en lugar de inhibir 5FUdR citotoxicidad en las células cancerosas, debido a su participación en un ciclo de reparación inútil que potencia la toxicidad 5FUdR [28].