Extracto
No coinciden los cánceres colorrectales reparación deficiente (CRC) de visualización inestabilidad generalizada en las secuencias de ADN de microsatélites (MSI). Aunque MSI se ha informado de la aparición comúnmente en repeticiones de codificación, dando lugar a alteraciones en la función de un número de genes que codifican proteínas relacionadas con el cáncer, no se sabe nada sobre el impacto putativo de este proceso en microRNAs no codificante. En miRBase V15, hemos identificado muy pocos genes de microARN humanos con mono- o di-nucleótidos se repite (
n
= 27). Un análisis mutacional de estas secuencias en una gran serie de líneas de células MSI CRC y tumores primarios de relieve la inestabilidad en 15 de los 24 genes de microARN estudiados con éxito a frecuencias variables que van desde 2,5% a 100%. Después de un método de máxima probabilidad estadística, genes de microARN se separaron en dos grupos que difieren significativamente en sus frecuencias de mutación y en su tendencia a representar mutaciones que pueden o no estar bajo presiones selectivas durante MSI progresión tumoral. El primer grupo incluye 21 genes que mostraron ninguna o pocas mutaciones en el CCR. El segundo grupo contiene tres genes, es decir,
HSA-mir-1273c
,
HSA-mir-1303
y
HSA-mir-567
, con frecuentes (≥80 %) y, a veces bi-alélicos mutaciones en los tumores MSI. Para el único que expresa en los tejidos del colon,
HSA-mir-1303
, se encontró una relación directa entre la presencia o no de mono o bi-alteraciones alélicas y los niveles de expresión de miR maduro en líneas celulares de MSI , tal como se determina por secuenciación y PCR cuantitativa respectivamente. En general, nuestros resultados proporcionan evidencia de que las repeticiones de ADN contenidas en los genes miARN humanos son relativamente raros y preservado de mutaciones debido a MSI en las células del cáncer MMR-deficientes. Los estudios funcionales se requiere ahora para concluir si miRNAs mutado, y sobre todo el miR-1303, podría tener un papel en la tumorigénesis MSI
Visto:. El-Murr N, Z Abidi, Wanherdrick K, M Svrcek, Gaub MP , Fléjou JF, et al. (2012)
MiRNA
genes constituyan Nuevos objetivos de inestabilidad de microsatélites en el cáncer colorrectal. PLoS ONE 7 (2): e31862. doi: 10.1371 /journal.pone.0031862
Editor: Hoguen Kim, Yonsei University College of Medicine, República de Corea
Recibido: 18 Noviembre 2011; Aceptado: January 13, 2012; Publicado: 14 Febrero 2012
Derechos de Autor © 2012 EL-Murr et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El N -Murr es un receptor de un (Ligue Nationale Contre le Cancer) LNCC comunión. Este trabajo fue apoyado por el Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Durante la última década, microARN (miARN) los genes han sido ampliamente identificado en mamíferos, plantas y virus. Ellos codifican moléculas cortas ($ ~ $ 22 nucleótidos) de una sola cadena de ARN maduros (MIR) que regulan la expresión de genes en su mayoría por el apareamiento de bases con el 3 'UTR del ARNm objetivo [1], [2]. En los seres humanos, se estima que más de mil miRs controlan la expresión de alrededor de 60% de los genes codificantes de proteínas. Numerosos estudios funcionales han informado de la participación de miRs en diversos procesos celulares, y posteriormente, su desregulación en un número de enfermedades humanas incluyendo cáncer [2], [3]. MIRNA genes pueden estar ubicados dentro de los intrones y con menor frecuencia dentro de los exones, o regiones intergénicas, su expresión está regulada por los promotores de genes independientes o de acogida [4]. Con excepción de los genes miARN que surgen por completo de los intrones empalmados a cabo de ARNm de acogida (mirtrons nombrados [5]), cada gen microARN produce tres tipos de moléculas que serán sometidos a las divisiones sucesivas por dos ARNasas, llamado Drosha y Dicer, para dar el MIR completamente funcional: un gran transcrito primario (pri-mir, ~ 500 a 3000 bases), un precursor intermedio horquilla-como (pre-Mir, ~ 60 a 80 bases), y un dúplex miARN transitoria de la que dos miRs maduras diferentes se producen por lo general a diferentes (MIR principal /menor MIR *) o equivalente (miR-5p /miR-3p) cantidades [5], [6]. Cada etapa de maduración depende en gran medida de las características estructurales fundamentales que determinan la biogénesis una correcta y fiable del miARN maduro. Ambas variaciones de tamaño y secuencia en diversas regiones de la horquilla miARN (segmento basal, tronco, miARN dúplex y circular) pueden provocar la desregulación de MIR biogénesis y se cree que tienen consecuencias tumorigénicos [7], [8], [9], [10 ], [11], [12].
Varios mecanismos genéticos y epigenéticos que conducen a la alteración de la expresión y función de miR se han descrito en los tumores humanos, incluyendo el cáncer colorrectal (CRC) [13], [14 ], [15]. Una metilación de
miARN-34b /c
islas CpG, por ejemplo, se ha observado con frecuencia en las líneas celulares de CRC y los tumores primarios [16], y un aumento de la expresión de miR-17-92 clúster se ha observado en junto con una inestabilidad cromosómica (CIN) en la banda cromosómica 13q31 que contiene este
miRNA
locus [17]. Es importante destacar que, también llamada CIN MSS (estabilidad de microsatélites) caracteriza el subconjunto principal de CCR (que representan el 80-85% de todos los CRC). Inestabilidad de microsatélites (MSI), por otra parte, una particularidad que resulta de una deficiencia de desajuste de reparación de ADN (MMR), ha sido reportado en el 15-20% restante de CRC [18]. En MSI CRC, que por lo general no muestra CIN, se cree que la progresión del tumor a ser sobre todo a partir de la acumulación de eventos secundarios de mutación (deleción /inserción) que afectan a los microsatélites, secuencias repetidas de ADN motivos corta (1-6 pb), contenido en el cáncer- genes relacionados [19], [20]. Estas mutaciones afectan a los genes diana implicados en diversos procesos biológicos tales como la regulación del ciclo celular y /o la proliferación celular (
TGFBR2, IGF2R, TCF4, AXIN2, PTEN, RIZ
...), la regulación de la apoptosis (
BAX, CASP5, BCL10, APAF1, FAS ...
), o la señalización de daño del ADN y las vías de reparación (
RAD50, BLM, MSH3, MSH6, MBD4, MLH3, CHK1, ATR ...
). En la mayoría de los genes diana, se observaron mutaciones de marco turno en repeticiones exonic, más a menudo mononucleótido extensiones, lo que lleva a la producción de proteínas truncadas. Más raramente, las mutaciones somáticas en repeticiones de mononucleótidos intrónicas de MSI genes diana (
MRE11
y
HSP110
), se mostró a conducir a aberrantes de empalme y para la generación de proteínas alteradas [21], [22 ].
en este estudio, se investigó por primera vez si los genes miARN, independientemente de su localización genómica, que podría constituir nuevas dianas de MSI en el CCR. Todos los genes humanos que contienen los genes miARN mononucleótido (MNR) o repeticiones de dinucleótidos (DNR) (≥7 repite) en sus secuencias de horquilla fueron seleccionados para mutaciones (nucleótidos adiciones /deleciones) utilizando una amplia serie de líneas celulares deficientes MMR-CRC y tumores primarios, como así como líneas celulares linfoblásticas (LBLs) y controles MSS CRC permiten la evaluación de la situación de estas secuencias polimórficas.
Resultados
la detección de microsatélites se repite en las horquillas miARN y determinación de su polimorfismo en MMR líneas celulares -proficient
Entre las 940 secuencias de genes miARN humanos enumerados en miRBase V15, 24 contienen MNR con al menos siete unidades de repetición (2,5%) (tabla 1). DNR (≥ 7 repeticiones) son más raramente se encuentra en secuencias de genes miARN (3/940, 0,3%) (Tabla 1). Estos genes miARN se distribuyen en varios cromosomas. La mayoría se encuentra en los genes codificantes de proteínas (22/27, 81,5%), sobre todo dentro de las secuencias intrónicas (21/22, 95,5%). secuencias repetidas varían en tamaño y pueden alcanzar hasta 18 repeticiones. Más de dos tercios de MNR (17/24; 71%) son pequeñas (7 a 8 pb) y A /T ricos (16/24; 67%). Se abarca muchas regiones del precursor de la horquilla (Figura 1) se consideró importante para la maduración y /o función MIR. Estas regiones se componen de los segmentos basales, la madre, el dúplex miARN y el bucle terminal [7], [8], [9], [10]. Dos miRNAs (
HSA CD -
MIR-511-1
y
HSA CD -
MIR-511-2
) son duplicados del mismo gen y mostrar una secuencia única indistinguibles en nuestro análisis. Excepto
HSA CD -
MIR-1234
y
HSA CD -
MIR-3166
, todos los genes miARN se amplificaron con éxito utilizando un conjunto de cebadores fluorescentes limítrofes la secuencia de horquilla. genes miARN genes fueron analizados primero en individuos sanos (LBLs,
n
= 40) para una evaluación del polimorfismo inherente (Tabla 2). Fuera de 21 MNR analizados en muestras de ADN normales, la mayoría (17 genes) se demostró que era monomórficos (Tabla 2). polimorfismo de la longitud (1 turno pb) en
HSA-mir-1303
se observó con el alelo más pequeños que tienen la frecuencia alélica más alta (Tabla S1, Figura S1). polimorfismos de nucleótido único (SNP)
rs33982250
y
rs34889453
, tanto corresponde a una deleción Adenina, son reportados por
HSA-mir-1303 Opiniones y se encuentran fuera del MNR [ ,,,0],23]. alelos raros con turnos de hasta 3-BP también se identificaron en
HSA-mir-511
,
HSA-mir-543
y
HSA-mir-1302-7
genes (Tabla S1, Figura S1). Resultados similares fueron obtenidos en una serie de 25 tumores colorrectales primarios del SMS y 13 líneas de células MSS CRC (Tabla S1).
El segmento basal (BS, sola hebra de ARN), tallo (S, ARN de doble hebra ) y el terminal de bucle (L) se designan. El dúplex (D, que contiene uno o dos miRs potenciales) se considera como una entidad diferente y por lo tanto se distingue de la región tallo. Regiones de la horquilla cubiertos por MNR o DNR se indican para cada miRNAs. A la izquierda del esquema son los genes miARN cuya secuencia se repite solapar dos regiones.
MiRNA genes con DNR que parecía ser altamente polimórficos (Tabla 2). Dos de 3 genes muestran varios alelos con importantes variaciones de longitud: 6 y 15, respectivamente, para alelos encontrados
HSA-mir-620
y
HSA-mir-558 Hoteles en individuos sanos (Tabla S1, Figura S1). Aquí, se ha informado de polimorfismos de longitud de estar localizado dentro de las repeticiones de microsatélites [23].
El análisis de mutaciones de los genes miARN con el MNR y DNR
La inestabilidad de todas las repeticiones miARN se investigó en una serie CRC de 41 primarias y 14 MSI MSI líneas celulares de CRC (Tabla 2). CRC primaria MSS (
n
= 25) y el SMS CRC líneas celulares (
n
= 13) se utilizan como controles. Con muy pocas excepciones, los controles del SMS no mostraron alteraciones de tamaño en cualquiera de las repeticiones miARN (3/557 y 3/304 eventos de mutación en los tumores primarios y líneas celulares, respectivamente), mientras que 135/913 y 50/326 eventos de mutación eran observado en tumores primarios MSI (
p
= 2,2 × 10
-16) y líneas celulares (
p = 2,28
× 10
-10), respectivamente. Análisis de DNR mostró que 2 miRNAs con 7 (
HSA-mir-1277
) y 11 repeticiones (
HSA-mir-620) no se alteraron en muestras de MSI.
HSA-mir-558
con 18 repeticiones apareció mutado en un tercio de las líneas celulares de MSI (4/13; 30,8%) y MSI CRC. (12/38; 31,6%) (Tabla 2)
se realizaron estudios estadísticos sobre miRNAs con el MNR, debido a su mayor número (
n
= 21). Sobre la base de los datos presentados en la Tabla 2, se muestra que la mayoría de los genes miARN son raramente (3/21 con la tasa de mutación ≤15%) o no alterado (14/21, 66%) en líneas celulares de MSI CRC, mientras que muy pocos se encuentran para ser mutado de manera significativa; genes (19%) 4/21. Se obtuvieron resultados similares en MSI CRCs (Tabla 2). Sin embargo, las alteraciones fueron menos frecuentes en tumores MSI en comparación con líneas de células, una observación de acuerdo con lo que se informa de los genes con MNRs de codificación [24]. Además, se observó una correlación significativa entre el tamaño de miARN MNR y la frecuencia de mutación en los tumores MSI (
p & lt; 0,001
, r = 0,76) (Figura 2). Esta correlación se observó ya desde hace muchos secuencias microsatélites independientemente de sus localizaciones genómicas (intergénica, codificación /exonic, codificación /5 '3' no traducidas MNR y intrónicas) (Figura S2).
Tenga en cuenta la correlación altamente significativa observada.
genes miARN con MNR separar en diferentes grupos
el uso de un método de máxima probabilidad estadística como se ha descrito anteriormente (consulte Materiales y Métodos y [24]), se identificaron dos grupos distintos de los genes miARN que contienen MNR que diferían en su mutabilidad en tumores primarios MSI (Figura 3). En pocas palabras, la prueba considera que todos los genes pertenecen a un grupo de la frecuencia y se opone a esta configuración la hipótesis alternativa de dos grupos mutuamente excluyentes de frecuencias. La razón de verosimilitud calcula las probabilidades de cada hipótesis y da el más "probable" que se produzca. La primera, el grupo más grande comprende los genes miARN se encuentran a no ser mucho o no mutado en tumores MSI (18/21; 86%). El segundo grupo contenía 3 genes miARN (
HSA-mir-1273c
,
HSA-mir-567
y
HSA-mir-1303
) frecuentemente mutado en MSI CRC ( ≥75%). Grupos similares se definieron en líneas celulares de CRC MSI (Figura S3)
.
Dos grupos distintos de miRNAs con MNR se establecen en función de sus frecuencias de mutación en los tumores primarios MSI. El valor de corte se calcula por la relación del método estadístico probabilidad y está marcado por una línea vertical discontinua. Tenga en cuenta que
HSA-mir-644
se incluye en el grupo de miRNAs rara vez o no mutado en MSI CRC (
n = 18
, la frecuencia de mutación & lt; 25%), mientras que
HSA-mir-1273c
,
HSA-mir-567
y
HSA-mir-1303
constituyen el grupo de miRNAs frecuentemente alterado (
n = 3,
frecuencia de mutación & gt; 75%) guía empresas
Caracterización de alteraciones y sus efectos sobre la expresión de los genes miARN maduro
Nuestro análisis permitió la identificación de 3 miRNAs específicos en MSI:.
HSA -mir-1273c, HSA-mir-567 y HSA-mir-1303
. Para estos genes, la gran mayoría de las líneas de células MSI presenta hasta 3 deleciones pb (Figura 4, Tabla S2), y rara vez una adición de nucleótidos (Tabla S2). Una mutación bi-alélica también se observó en el 36%, 57% y 83% de las líneas celulares de CRC MSI alterados para MIR-1273c, MIR-MIR-567 o 1303, respectivamente (Figura 4, Tabla S2). alteraciones similares se encontraron en tumores primarios MSI con la excepción de
HSA-mir-1273c
, que por lo general muestra los niveles más pequeños de alteraciones en los tumores (sólo 1 pb-eliminación) (Figura 4, Tabla S2). En cuanto a la polimórfica
HSA-mir-1303
gen, alelo cuya principal muestra un A-deleción (Tabla S1), el precursor de la horquilla fue secuenciado en cada línea celular MSI CRC para determinar el alcance real de la eliminación. Como LBL y las líneas celulares del SMS (Tabla S1), líneas de células MSI parecían ser homocigotos (50%; Dela /Dela) o heterocigotos (50% Dela /A) para el alelo "Dela". La relevancia de la "Dela" SNP en
HSA-mir-1303
se muestra en la Figura 5A que ilustra los cambios en el bucle terminal de las estructuras de horquilla MIR-1303. La dimensión del bucle que contiene el microsatélite disminuye cuando las alteraciones se hacen más grandes y cada vez que la estructura de horquilla contiene la A-Además SNP (Figura 5A).
se muestran perfiles alélicos para varias líneas de células MSI CRC y tumores primarios. perfiles normales se definen en líneas de células LBL y del SMS y tumores primarios. Para los genes monomorfas, una línea vertical discontinua indica el alelo único. La zona polimórficos para
HSA-mir-1303
se define entre dos líneas verticales discontinuas que van a lo largo de los 2 alelos (ver Figura S1). Tamaños (pb) se indican en una caja debajo de cada perfil. Se observaron varias deleciones alélicas que van de 1 a 4 pares de bases en líneas de células MSI CRC y los tumores primarios y se indican en negrita. Las supresiones observados eran a veces bi-alélica en líneas celulares de MSI CRC. En los tumores primarios MSI, los perfiles alélicos también son muy sugestivos de mutaciones bi-alélicas. Debido al polimorfismo inherente que puede modificar la longitud de la secuencia, la secuencia de horquilla de
hsa-miR-1303
se determinó para una evaluación correcta y fiable de las alteraciones en las líneas de células MSI CRC (véase la Tabla S2) .
R: las alteraciones en las secuencias repetidas de
HSA-mir-1303 gratis (a) y su variante (Dela) no parecen afectar en general, la estructura secundaria de la horquilla, pero la dimensión del bucle (anotada en el interior) se reduce ligeramente según lo determinado por software mfold (http://mfold.rna.albany.edu/). MIR madura (negrita) y el MNR (letras subrayadas) se muestran en las dos secuencias de horquilla. Las flechas indican las posiciones posibles de una deleción Adenina que conduce a una ampliación del bucle. B: La comparación de las expresiones relativas de madurez de miR-1303 en el SMS (MNR perfeccionar) y líneas celulares de CRC con MSI ninguno, mono o bi-mutaciones alélicas de
HSA-mir-1303
. la expresión de miR se normalizó a la expresión de RNU48. Medios se muestran para cada grupo (negro línea horizontal). Se observó un aumento significativo en la expresión de miR-1303 entre las líneas celulares del SMS y las mucosas del colon normal (
p = 0,012
). C: La ausencia de correlación entre el tamaño de mir-1303 de bucle y los niveles de madurez de expresión de miR-1303 en líneas celulares de MSI sin (HCT-8, TC7) o mutaciones bi-alélica (LS411, RKO, LIM2405, KM12, LoVo , HCT116) en el MNR de
HSA-mir-1303
. Nota líneas celulares que producen los precursores de la horquilla con el mismo tamaño del bucle no expresar madura de miR-1303 en varios niveles.
Sobre la base de estos resultados, la hipótesis de que las deleciones de nucleótidos encontradas en los genes miARN precursores pueda afectar a la biogénesis de miRs madura, modificando sus niveles de expresión y /o su secuencia según lo informado por algunos otros genes miARN [7], [8], [9], [10]. El uso de tecnologías cuantitativos específicos de RT-PCR, se determinó la expresión relativa de cada maduro de miR en de tipo salvaje (WT) y líneas celulares de CRC mutados en comparación con la expresión en la mucosa del colon sano. La expresión de miR-567 y miR-1273c no era detectable en la mucosa del colon y las líneas celulares de cáncer colorrectal (C
T & gt; 36 ciclos) (datos no mostrados); mientras que miR-1303 parecía estar bastante expresado tanto en las células de colon normales y tumorales (Figura 5B). Teniendo en cuenta el nivel de inestabilidad, el miR-1303 de expresión se analizó por primera vez en líneas celulares de CRC MSI. Con la mucosa normal del colon servir como controles, no se observaron diferencias en la expresión de miR-1303 entre inalterada
HSA-mir-1303
líneas celulares MSI y las líneas de células mutadas MSI heterocigótica (Figura 5B). Un aumento en la expresión de la expresión de miR-1303 fue, sin embargo, se observa en algunos de las líneas celulares de MSI mutados en ambos alelos (Figura 5B). Por otra parte, las líneas celulares supone que tienen estructuras idénticas de horquillas miARN (Figura 5C), no mostraron niveles de expresión comparables. Parece, por lo tanto, siempre que el tamaño del bucle no se correlaciona con los niveles de expresión, que las alteraciones de MSI no tienen repercusión en la expresión de miR maduro. Un aumento significativo de miR-1303 observado en líneas celulares MSS CRC en comparación con la mucosa colónica normal apoyó este resultado (Figura 5B).
Discusión
Hasta la fecha, el único impacto indirecto establecido de MSI proceso de miARN la biogénesis es la focalización y, por tanto, la interrupción de genes que codifican proteínas implicadas en el procesamiento y el transporte [25] miARN, [26], [27], [28]. Nuestro estudio es el primero que informaron mutaciones somáticas en los genes miARN debido a MSI en los CRC MMR-deficientes. Mediante el cribado de la casi totalidad del MNR y DNR (≥ 7 unidades de repetición) contenida en miRBase-V15-anotada secuencias de genes miARN horquilla,
HSA-mir-1273c, HSA-mir-1303 y HSA-mir-567 fueron
demostrado a mutar a alta frecuencia en ambas líneas celulares de CRC y tumores primarios. Dado que la frecuencia de mutación elevada es el primer criterio que se tiene actualmente en consideración para identificar los genes diana que juegan un papel en la vía impulsada por MSI con el cáncer [19], [20], [29], [30], estos genes miARN puede constituir así verdadero objetivo de MSI. Por el contrario, todas las demás alteraciones miARN que hemos identificado es probable que sean el resultado de los antecedentes de la inestabilidad genética que caracteriza estos tumores. Fueron encontrados a ser afectados a baja frecuencia y puede desempeñar un papel menor en la tumorigénesis de colon, en su caso. Además, se han encontrado algunos genes miARN que contienen microsatélites que no mutado en líneas celulares de CRC y los tumores primarios. Podrían ser considerados como 'Survivor' genes miARN cuyas mutaciones no son seleccionados para durante la progresión tumoral, ya que podría ser muy perjudicial para las células del cáncer [19].
MSI también está influenciada por criterios de secuencia,
por ejemplo, México la longitud de la repetición. Como era de esperar, se observó una correlación positiva entre la longitud total de repeticiones miARN y sus tasas de mutación en MSI CRC, lo que corrobora la observación hecha para la codificación y no de codificación-MNR. Según sea necesario para la codificación de los genes de proteínas [29], [30], los criterios funcionales son necesarios para afirmar que los genes miARN orientados MSI tienen un papel en la tumorigénesis de colon MSI. MiRNAs están profundamente implicadas en la regulación de la expresión génica, siendo, por tanto, asociadas a diversos procesos biológicos. No papel biológico todavía no se ha atribuido a
hsa-miR-1303
es decir, entre estos, el único de miR que se expresó significativamente en la mucosa del colon. Varios cientos de ARNm se pueden asignar
in silico
al MIR-1303 dependiendo del software utilizado, y los análisis adicionales son necesarios para definir aquellos cuyas
in vivo
expresión depende realmente de
HSA -mir-1303
. Por otra parte, la prioridad es demostrar que las alteraciones del MNR debido a MSI pueden afectar la función MIR-1303. Varios equipos ya se han puesto de relieve el importante papel del bucle terminal dentro de la horquilla miARN primaria en miARN la biogénesis y la función [8], [9]. Además, una alteración de una sola base (es decir, SNP) dentro de la misma (primaria, pre y madurar secuencias de genes miARN) de genes miARN es a veces suficiente para alterar la expresión de los genes miARN y /o función en los cánceres, el bloqueo de la transformación de pri-miARN de comprobar la validez -miRNA [23], [31] o, por el contrario, el aumento de la expresión de miR maduro [32]. No pudimos aquí para observar una correlación evidente entre el nivel de expresión de miR-maduro 1303 y la mutación en la repetición de ADN contenida en su bucle terminal en células MSI CRC, independientemente del SNP adyacente al bucle. Se desarrollarán otros estudios utilizando construcciones de plásmidos adecuados para saber si las mutaciones que afectan MNR este gen miRNA podrían modificar el procesamiento de la madurez de miR-1303 generando diferentes MIR [33] o la función de las moléculas pre-miARN o prioridades que se informó recientemente por Trujillo
et al.
[34] para ser biológicamente activos.
en conclusión, nuestros resultados tienen dos implicaciones principales para el papel de los genes miARN en la carcinogénesis impulsado por MSI. Ellos primero proporcionan pruebas de que la pantalla MSI CRCs sólo unas pocas mutaciones somáticas que afectan a un pequeño número de genes miARN que contienen repeticiones de ADN con consecuencia aún no está claro en el procesamiento y la función de estas moléculas. Los estudios funcionales están obligados a hacer cumplir la idea de que el MIR-1303 podría tener un papel en la tumorigénesis MSI. En segundo lugar, muestran que las repeticiones de ADN contenidas en genes miARN son relativamente raras y por lo general conservado de mutaciones debido a MSI en células de cáncer MMR-deficientes. Este estudio se centra en las repeticiones de nucleótidos situados en las secuencias de horquilla que contienen al menos el pre-miARN, y podría ampliarse a MNR se encuentra en otras regiones de los genes miARN importantes para la transcripción y el procesamiento de grandes transcripciones miARN primaria (pri-miRNAs ).
Materiales y Métodos
muestras de ADN
ADN normal se obtiene a partir de 40 individuos sanos (líneas celulares linfoblastoides) proporcionados por CEPH (Centre d'Etude du polymorphisme Humain, París, Francia). tejidos tumorales primarios (41 MSI y 25 tumores MSS) de los pacientes sometidos a cirugía para el CRC, ya sea en el hospital Saint-Antoine (París, Francia) o el hospital de Hautepierre (Estrasburgo, Francia) se recogieron en los Centros de Recursos Biológicos de cada institución. Escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes. Ética aprobación se obtuvo del Comité de Ética de Investigación Humanos (París, Francia) y del "Comité pour la Protection des Personnes de Strasbourg" (CPPEST IV, Estrasburgo, Francia). El estado de MSI se determinó por múltiplex fluorescente PCR, como se describe anteriormente [35], y se dejó la evaluación del porcentaje de tejido de carcinoma epitelial en las muestras de MSI. Sólo los tumores con al menos un 40% de material tumoral se han incluido en nuestro estudio. Se extrajo ADN de 14 MSI y 13 líneas celulares de CRC SMS utilizando QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Courtaboeuf, Francia) según las instrucciones del fabricante.
Identificación de mono- y dinucleótidos repeticiones
Una sistemática la detección de mono y dinucleótidos repeticiones se realizó en miRBase (versión 15, abril 2010 release) (http://www.mirbase.org/) [6]. Esta base de datos proporciona secuencias de precursores horquilla miARN y miARN maduros de varias especies. Hemos seleccionado miRNAs humanos que tienen al menos 7 unidades de repetición. Este número mínimo se eligió porque microsatélites se encuentran raramente a ser inestable por debajo de 7 repeticiones (se refiere a SelTarbase, http://www.seltarbase.org/).
análisis de la mutación
Los cebadores específicos que flanquean los horquilla secuencias fueron diseñados utilizando el software Amplifix para cada candidato miARN. La amplificación por PCR se realizó en un volumen final de 25 l con 5 ng de DNA, alto o bajo MgCl
2 la concentración, con o sin solución de Q, y Taq ADN polimerasa (Qiagen). Primer secuencias se enumeran en la Tabla S3. Las condiciones de ciclado térmico comprendían una etapa de desnaturalización inicial a 94 ° C durante 3 min, seguido de 35 ciclos a 94 ° C durante 45 seg; 60 ° C durante 60 segundos y 72 ° C durante 60 segundos. ADN Finnzyme Phusion de alta fidelidad de la polimerasa (Thermo Fisher Scientific, Illkirch, Francia) se usó también en algunos casos de acuerdo con el protocolo del fabricante. diluciones adecuadas de los productos de PCR fluorescentes se mezclaron con formamida y tamaño GeneScan ™ 400HD ROX ™ estándar (Life Technologies, Courtaboeuf, Francia), con el calor desnaturaliza y se ejecutará en un corto capilar que contiene GS rendimiento optimizado Polímero 7 en el ABI 3100 Genetic Analyzer. Los datos se visualizan y se anotarán en el software GeneMapper 3,7 (Life Technologies).
La secuenciación de HSA-mir-1303 horquilla precursor
Una secuencia que contiene el precursor de la horquilla HSA-mir-1303 se amplificó por la ADN polimerasa de alta fidelidad Finnzyme Phusion (Thermo Fisher Scientific) usando los siguientes cebadores: F-GTGAACTAAACGCTGCCTCTGCTA y R-TGCAGGAACCGTACTAAGCACT (Tm = 66 ° C). Productos de PCR fueron purificados en 96 pocillos Multiscreen-PCR plats de filtración (Millipore, Molsheim, Francia). reacción de secuenciación se realizó utilizando el Kit V3.1 Big Dye Terminator (Life Technologies) de acuerdo con el protocolo del fabricante y por separado utilizando el avance o retroceso cebadores. Secuencias productos fueron entonces purificados en placas de 96 pocillos Multiscreen-DV (Millipore) con Sephadex G-50 fino y analizados en un ABI 3100 Genetic Analyzer (Life Technologies)
transcripción inversa y PCR en tiempo real cuantitativa
se preparó ARN total a partir de células cultivadas de forma exponencial (9 del SMS y 14 células MSI CRC) y la mucosa colónica normal de pacientes con CRC (
n
= 7) usando el reactivo TRIzol (Life Technologies) a continuación, cuantifica utilizando un espectrofotómetro NanoDrop. ADNc se generan a partir de 10 ng o 100 ng de ARN total usando cebadores RT-miARN tallo bucle específicos (Life Technologies) para MIR-1303 o el miR-1273c, respectivamente. ensayos de RT-qPCR se realizaron por triplicado en un sistema de detección de secuencias ABI 7900 usando el ensayo de TaqMan MicroARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Life Technologies). Para la detección de miR-567, el sistema miScript PCR (RT miScript y miScript SYBR Green PCR kits) se utilizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Qiagen). Con ambas tecnologías, CT, el ciclo en el cual la cantidad de diana amplificada llega a un umbral fijo, se determinó. CT por encima de 36 se considera como falsos positivos. la expresión de los genes miARN maduro se normalizó a la de RNU48 (Life Technologies) o RNU6B (Qiagen) (Ct = CT
miR-CT
UNR). cuantificación comparativo se realizó con una muestra de calibrador. miARN expresión relativa se expresa como 2
-ΔΔCT (2
- (? Ct de la muestra-ΔCTcalibrator)). Las condiciones térmicas de ciclo comprendidos 45 ciclos a 95 ° C durante 15 s y 60 ° C durante 1 min (Life Technologies) o 45 ciclos a 94 ° C durante 15 s, 55ºC durante 30 s y 70 ° C durante 30 s, precedida por una etapa de activación inicial a 95 ° C durante 15 minutos (Qiagen).
análisis estadísticos
las diferencias entre las variables se evaluaron con la
Chi-2
o de Fisher La prueba exacta, cuando sea necesario. Se utilizó la prueba t de Student para evaluar las diferencias en los niveles de expresión de miR.
Como se ha descrito anteriormente por Duval
et al.
, una relación de probabilidad se calcula para asignar a cada miARN a un grupo de frecuencias [ ,,,0],24]. Con
N
i
, el número de tumores analizados en el locus
i
y
n
i
, el número de tumores inestables en este locus, el
H1
hipótesis alternativa supone la presencia de dos tipos de loci (es decir, los genes miARN.) que difieren en sus frecuencias de mutación (un grupo "estable" con una baja tasa de mutación,
p
1
; y un grupo "inestable", con una alta tasa de mutación,
p
2
α y 1-α son las proporciones de los sitios con el
p
1