Extracto
La prevalencia de los tumores testiculares de células germinales (TGCT), un tumor maligno de tejido sólido común en hombres jóvenes, cada año se ha aumentado a un ritmo alarmante de 3%. Dado que la mayoría de los cánceres testiculares se derivan de células germinales en la etapa de transformación de células germinales primordiales (PGC) en gonocitos, el aumento ha sido atribuido a la exposición materna /fetal a factores ambientales. Se examinaron los efectos de un estrógeno (dietilestilbestrol, DES), un antiandrógeno (flutamida), o la radiación en la incidencia de tumores de células germinales testiculares en predispuestos genéticamente 129.MOLF-L1 (L1) congenic ratones mediante la exposición a estos agentes en los días 10.5 y 11.5 del embarazo. Ni flutamida ni DES producen aumentos notables en la incidencia de cáncer de testículo a las 4 semanas de edad. En contraste, dos dosis de radiación de 0,8 Gy-aumentó la incidencia de TGCT del 45% al 100% en la descendencia. El porcentaje de ratones con tumores bilaterales, los pesos de los testículos con TGCT, y el porcentaje de tumores que eran claramente teratomas fueron mayores en los ratones irradiados que en los controles, lo que indica que la irradiación induce tumores más agresivos y /o más focos de los sitios de iniciación en cada testículo. Esta dosis de radiación no interrumpió la espermatogénesis, que fue cualitativamente normales en testículos libres de tumor a pesar de que se redujeron en tamaño. Esta es la primera prueba de la inducción de cáncer testicular por un agente ambiental y sugiere que el feto masculino de las mujeres expuestas a la radiación en alrededor de 5-6 semanas de embarazo podría tener un mayor riesgo de desarrollar cáncer testicular. Además, se proporciona una nueva herramienta para estudiar los eventos moleculares y celulares de la patogénesis del cáncer testicular
Visto:. Shetty G, Comish PB, Weng CCY, Matin A, Meistrich ML (2012) exposición a la radiación fetal Induce cáncer testicular en ratones genéticamente susceptibles. PLoS ONE 7 (2): e32064. doi: 10.1371 /journal.pone.0032064
Editor: Austin John Cooney, Baylor College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 28 Octubre, 2011; Aceptado: January 19, 2012; Publicado: 13 Febrero 2012
Derechos de Autor © 2012 Shetty et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por la Florence Thomas M. Cátedra de Investigación del cáncer (Marvin L Meistrich) y el Centro del cáncer de apoyo subvención CA 16672 de los Institutos nacionales de Salud. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los tumores de células germinales testiculares (TGCT) son el tumor maligno más común en los hombres caucásicos de edades comprendidas entre los 15 y los 40 años. TTCG humanos se clasifican principalmente histológicamente en seminomas, que se asemejan a las células germinales primordiales (PGC), y no seminomas, que pueden ser indiferenciado (carcinoma embrionario) o diferenciada de embriones que muestra (teratoma) o extra-embrionario (saco vitelino) que modelan [1 ]. Los teratomas se caracterizan por la diferenciación de una gran variedad de tipos de células y tejidos. La edad media de aparición de diversos tipos de tumores difiere con seminomas que surge en unos 35 años, la mayoría de los no seminomas en 25 años, y la mayoría de los teratomas y tumores de saco vitelino aproximadamente en 1,5 años. Mientras que los tumores que aparecen en los adultos son precedidos por un carcinoma in situ (CIS), que contienen células que se asemejan estrechamente gonocitos, los que aparecen en los niños no están precedidos por la CEI [2]. A pesar de estas diferencias evidencia apoya una patogénesis subyacente común de estos tumores, tales como aberraciones cromosómicas similares, regiones cromosómicas amplificadas, y la expresión de genes de pluripotencia [3]. Todos estos tumores derivan de células con características de las células germinales primordiales (PGC) o gonocitos, aunque en diferentes etapas de desarrollo evaluadas por la medida de la eliminación de la impresión biparental original o de la posterior creación de la impronta paterna.
ha habido un aumento anual del 3% en la incidencia de TTCG en hombres caucásicos jóvenes en todo el mundo en los últimos 50 años [4], pero las razones son difíciles de alcanzar. Esclarecimiento de la causa de este aumento es importante para la posible prevención o reversión de este incremento.
Dado que las células de cáncer de testículo se derivan de células germinales primordiales (PGC) o gonocitos [2], el aumento ha sido atribuido a la madre y el exposiciones fetales a los factores ambientales, con la mayor atención que se presta a los disruptores endocrinos, tales como los estrógenos y antiandrógenos [5], [6], [7]. La radiación ionizante, un conocido carcinógeno [8], que aumenta la incidencia de cáncer infantil y otra para adultos en los individuos expuestos durante el desarrollo fetal [9], [10], ha recibido poca estudio. Un estudio de casos y controles mostró que la exposición a las radiaciones ionizantes durante el embarazo aumentó el riesgo de cáncer testicular en los hijos varones [11].
El único modelo murino para TTCG es los teratomas espontáneas que se observaron originalmente en 129 /ratones Sv [12]. Aparecen más similar a los TTCG infantiles en humanos porque las células germinales se desarrollan rápidamente en los tumores después del nacimiento. Sin embargo, como todos los tipos TGCT humanos, los teratomas ratón también se originan a partir de las CGP o gonocitos. Además, los defectos en los mismos genes, kit-ligando (KitL) y DMRT1, aumentan dramáticamente la incidencia de teratoma en ratones [13], [14] y se asocian con o predisponen a los seres humanos a los TTCG adultos [15], [16 ]. Estos ejemplos sugieren que este modelo de ratón teratoma puede ser relevante para las formas adultas de cáncer de testículo humano, así, aunque hay reservas sobre tal extrapolación [1].
En los ratones 129 /Sv, sobre 3- 10% desarrollan TTCG espontáneas. congenic ratones en un fondo de 129 se han desarrollado; los que contienen todos cromosoma 19 derivado de la cepa MOLF tienen una incidencia del 80% de TTCG [17] y aquellas porciones que llevan de pantalla cromosoma 19 niveles variables de la incidencia de tumores [18], [19]. En el presente estudio, se empleó la cepa congenic 129.MOLF-L1 (L1), con un 30% reportado incidencia de TTCG, para maximizar la potencia del estudio. Se utilizó este modelo de ratón para probar el efecto del estrógeno, antiandrógeno y exposición a la radiación ionizante sobre la incidencia de TGCT. Las exposiciones se realizaron en E10.5 y 11.5 que es justo después de que las células germinales primordiales (PGC) colonizan la gónada fetal, y están experimentando grandes cambios epigenéticos que suprimen su potencial para volver a un estado pluripotente y comprometerlos en el desarrollo de células germinales [20 ].
resultados
Hemos examinado los efectos de los tratamientos con un estrógeno (dietilestilbestrol, DES), un antiandrógeno (flutamida), o irradiación sobre la incidencia de TTCG en un modelo animal. Expusimos las mujeres embarazadas L1 a los agentes en el día 10,5 y 11,5 del embarazo.
No hubo efecto de la flutamida, DES o irradiación sobre la capacidad reproductiva de las presas (Tabla 1). Esto fue confirmado por los porcentajes similares de los ratones que producen descendencia después del apareamiento con éxito y los tamaños de las camadas comparables en las presas tratados y de control respectivos.
Los testículos se recogieron de la descendencia masculina y muchos de ellos contenía tumores visibles (Figura 1A y B). El examen histológico confirmó que la mayoría de éstos eran los teratomas con tejidos desde múltiples orígenes dérmicos, pero algunos sólo contenía células neuroepiteliales (Figura 1C y D). Flutamida no aumentó significativamente la incidencia de TCGT totales (30% de testículos tenía tumores en comparación con 21% en el control). Sin embargo, se aumentó ligeramente la incidencia de TCGT que fueron confirmados a ser teratomas por la presencia de tipos de células dérmicas origen múltiple (24% de los testículos vs. 14% en el control,
P
= 0,04) (Tabla 2 ).
morfología testicular bilateral mostrando (A) y B) TTCG unilaterales (de los ratones irradiados. Tenga en cuenta que el testículo sin TGCT después
in utero
exposición a la radiación (B) es menor que el testículo no tratado normal a partir de un ratón de 4 semanas de edad (insertar en B). Testículo secciones que muestran teratoma contiene tejidos aparentemente de varios orígenes dérmicos identificadas por la morfología (C), y TGCT que contienen sólo células neuroepiteliales (NE) (D). CA: cartílago; BM: médula ósea; MS: muscular, AEA: epitelio endodérmico. ST: túbulos seminíferos; BV: vaso sanguíneo. Secciones de testículos de 4 semanas de edad irradiado (E) y ratones contol (F) sin TGCT muestra espermatogénesis cualitativamente normal. Bar: 0,5 cm de A & amp; B, y 50 micras de C-F.
La dosis de DES que se dio fue eficaz en actuar sobre el embrión ya que causó la criptorquidia en el 16% de los testículos. Sin embargo, no había ninguna indicación de que el cáncer inducido (sólo 3 de 24 testículos analizados contenían TTCG). Del mismo modo, en un estudio que implica el tratamiento de 129 ratones embarazadas, una dosis de etinilestradiol que el aumento de la criptorquidia en la descendencia no indujo un cambio significativo en la incidencia de teratomas [21].
En contraste, la irradiación de los machos durante el desarrollo fetal con dos dosis, cada una de 0,8 Gy, llevado a TTCG en 80% de los testículos (en comparación con 28% en el control) y en 100% de la descendencia masculina (Tabla 2). El número de ratones con tumores unilaterales y bilaterales en todos los grupos se distribuyeron de forma binomial, lo que confirma un informe anterior de que la aparición de un tumor en cada testículo era un evento independiente [18]. Los pesos de los testículos con TTCG y el porcentaje de tumores que fueron confirmados teratomas fueron mayores en los ratones irradiados que en los controles, lo que indica que la irradiación induce tumores más agresivos y /o más focos de los sitios de iniciación en cada testículo.
las dos dosis de radiación de 0,8 Gy no interrumpen la espermatogénesis, que fue cualitativamente normales en testículos que no contenían teratoma (Figura 1E y F). Sin embargo, estos testículos libres de tumor de los ratones irradiados habían reducido peso en comparación con los de los controles (Tabla 2), lo que sugiere que la irradiación había causado alguna pérdida o inhibición de la proliferación de PGCs y /o células somáticas.
Discusión
en el presente estudio hemos demostrado de manera inequívoca que la exposición a la radiación fetal durante E10.5-E11.5 induce cánceres de células germinales testiculares, la mayoría de las cuales muestran las múltiples orígenes dérmicos típicos de los teratomas, en un modelo de ratón genéticamente susceptibles. Esta es la primera demostración de la inducción de cáncer testicular por un agente ambiental cuando se exponen durante el periodo embrionario. Se necesita más caracterización del modelo para determinar el tiempo óptimo de exposición o intervalos, la relación dosis-respuesta y los efectos sobre las cepas de ratón menos susceptibles a iniciar estudios sobre el mecanismo y la estimación del riesgo.
El hallazgo de que la radiación aumenta dramáticamente la incidencia de cáncer testicular en ratones ofrece una nueva herramienta para investigar el mecanismo por el que las CGP vuelven a las células embrionarias pluripotentes. Cuando llegan las PGC de ratón en la gónada en E10.5, son potencialmente pluripotentes. Sin embargo, a día 15.5, son gonocitos y han suprimido la expresión de los genes pluripotencia (
Oct4, Nanog
,
Sox2
), la detención del ciclo celular sufrido, están expresando los genes de células germinales (
Nanos3, DAZL, Dnd1, Mvh
) [22], [23], y se comprometen a la célula germinal de auto-renovación y diferenciación vía [12]. Entre día E10.5 & amp; 11.5 Se someten a cambios epigenéticos que incluyen tanto la desmetilación del ADN global que implica un solo capítulo rompe (SSBS) y la activación de la vía de reparación de base escisión con la localización de la cromatina de las proteínas implicadas, así como remodelación de la cromatina que implica la pérdida y sustitución de las histonas y los cambios en sus modificaciones [24]. La radiación ionizante en sí induce un mayor número de bebidas azucaradas y produce bases dañadas. Este daño inducido por la radiación podría perturbar vías de participación de SSBs endógenas y base de reparación por escisión que regulan esta transformación epigenética señalización y permitir que las células conservan la pluripotencia como células madre embrionarias como que posteriormente forman las TTCG.
alteraciones genéticas en Anteriormente las células germinales, incluido el
ter
mutación en el
Dnd1
de genes [25], la pérdida de
Dmrt1
[14], o la pérdida de
PTEN
[26] produce una alta incidencia de TTCG (en particular los teratomas) en ratones. El análisis de los cambios en la expresión de estos genes o productos génicos en PGCs y gonocitos de embriones de ratones irradiados podría elucidar el mecanismo por el que la radiación actúa para inducir a los tumores
.
Aunque la extrapolación de los teratomas en ratones a la tumores testiculares esporádicos en adultos jóvenes varones humanos es aún discutible, los presentes resultados en
in utero
la irradiación de ratones sugieren que el feto masculino de las mujeres expuestas a la radiación en alrededor de 5-6 semanas de embarazo podría tener un mayor riesgo de desarrollar cáncer testicular. es improbable que sean capaces de comprobar si existe una asociación entre dicha exposición y el cáncer de testículo ya que las dosis de rayos X en los procedimientos de diagnóstico han ido disminuyendo [9], el número de mujeres embarazadas en las poblaciones expuestas a la radiación son los estudios de cohorte pequeña [10] , es probable una ventana de desarrollo limitado de la sensibilidad, la incidencia de cáncer de testículo en humana es baja, y varias décadas transcurrir entre la exposición y el aspecto de los tumores. Sin embargo, hay un informe de una asociación entre la exposición a la radiación ionizante materna durante el embarazo y el cáncer de testículo en su descendencia [11]. El conocimiento adquirido sobre los mecanismos de ionización cáncer testicular inducida por la radiación en los ratones pueden ser utilizados para identificar otros factores ambientales o de estilo de vida que podrían causar un daño similar a las células germinales fetales y será responsable de los actuales aumentos en la incidencia de cáncer testicular en los hombres.
Materiales y Métodos
Ratones y cría
a descrito recientemente endogámica, congenic cepa de ratón, 129.MOLF-L1 [19], referidos como se usa L1. Estos se originaron a partir de cruces entre la cepa 129 (129S1 /SvImJ) y ratones endogámicos MOLF /Ei de la
Mus m. molossinus subespecies
ratón. Para crear ratones L1 129 ratones consomic con ratones MOLF-Chr19 se retrocruzaron a 129, la selección de una región del cromosoma 19 MOLF 7,6 Mb, y luego hizo homocigotos para la región de origen MOLF por cruzamiento la progenie. Alrededor del 30% de los varones L1 se informó a desarrollar tumores testiculares espontáneos y los genes que contribuyen a este molf alta incidencia de tumores aún no se conocen [19].
apareamientos programados se realizaron con pares de ratones L1. Las hembras embarazadas en día 10,5 y 11,5 del embarazo se trataron con dos dosis diarias del químico o físico tal como se describe a continuación. En algunos casos se utilizaron hembras para una segunda o tercera ronda de tratamientos durante los embarazos consecutivos, con un período de espera de unas pocas semanas entre embarazos. En tales casos de múltiples tratamientos, las mujeres embarazadas recibieron el mismo agente o que recibieron tratamiento de control en cada embarazo.
Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo MD Anderson Cancer Center Institucional con los números de protocolos aprobados 110712631 y 110712632. Todas las instalaciones para el alojamiento de los animales se registran por el USDA y acreditados por la Asociación Americana para la Acreditación de Laboratorio Animal Care.
Tratamientos
Flutamida.
la flutamida (Sigma Aldrich, St. Louis, MO), disuelto en aceite de sésamo /etanol absoluto (1:01), se administra por vía subcutánea en 2 dosis de 40 mg /kg. Esta dosis se ha demostrado que bloquean la acción de los andrógenos en ratones machos [27] y es más alta que la dosis oral clínica diaria humana de ~ 10 mg /kg.
dietilestilbestrol (DES).
DES (Sigma Aldrich, St. Louis, MO), disuelto en aceite de maíz, se administra por vía subcutánea en dos dosis de 5 mg /kg. ratones preñados de control recibieron sólo el vehículo. Sobre la base de un informe anterior [28], hemos realizado experimentos iniciales con dos dosis de 20 mg /kg, pero redujo la dosis después de muchas de las mujeres embarazadas no pudo entregar descendencia.
Radiación.
L1 ratones hembras embarazadas fueron irradiados con radiación Co
60-gamma (8 Eldorado unidad de radiación, Atomic Energy of Canada Ltd., Ottawa, Canadá). Un máximo de 3 ratones sin anestesiar a la vez se colocaron en una caja de metacrilato ventilado (4,1 cm x 11,7 cm x 8,2 cm) sobre una base de un mínimo de 13 cm de madera prensada, a una distancia de 80 cm de la fuente de radiación. Con un tamaño de campo de 20 × 20 cm, una dosis de 0,8 Gy de radiación de todo el cuerpo se administró a 10-11 AM en día 10,5 y 11,5 del embarazo a una tasa de dosis de aproximadamente 70 cGy /min. Las presas de control L1 de la misma colonia de cría no recibieron ninguno de estos tratamientos o manipulaciones y la descendencia masculina de estos ratones fueron analizados simultáneamente con las de las tratadas.
Análisis
La
en el útero
expuesta y controlar la descendencia masculina en el brazo flutamida se sacrificaron a la edad de 4-5 semanas; los machos expuestos y de control en la radiación y los brazos DES se sacrificaron a la edad de 4 semanas. Se eligió este momento ya que los tumores en ratones L1 se observan visualmente en estas edades [19]. Los testículos se examinaron para la presencia de tumores mediante la observación visual y después se fijaron en solución de Bouin para su examen histológico. Como algunos tumores pequeños no fueron evidentes por examen visual todos los tumores fueron identificados por el análisis de hematoxilina y secciones de 5 micras eosina-manchado. Los tumores con tejidos de varios tipos dérmicos fueron reconocidos como los teratomas. Cada vez, la sección inicial testículo contenía solamente las células cancerosas neuroepiteliales, los bloques fueron re-seccionadas para identificar o descartar la presencia de otros tipos de tejidos cancerosos en otros lugares.
Análisis estadístico
Los datos se presentan como media ± SEM. La significación de las diferencias entre los pesos de los testículos de los ratones de la misma edad se evaluó de Student
t-test
. La significación de las diferencias en la frecuencia de TTCG entre los ratones tratados y de control se determinó mediante la prueba de Chi-cuadrado.
Reconocimientos
Agradecemos a Walter Pagel (MD Anderson Cancer Center) por su ayuda editorial .