Extracto
Antecedentes
El cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) es una herramienta extremadamente agresiva enfermedad, se presentan comúnmente recaída resistente a la terapia. Hemos identificado previamente neuroendocrino y fenotipos epiteliales en los tumores SCLC y el marcador neuroendocrino, proopiomelanocortina (POMC), en correlación con una peor supervivencia global en pacientes. Sin embargo, el efecto del tratamiento sobre estos fenotipos no se entiende. El presente estudio tuvo como objetivo determinar el efecto del tratamiento de irradiación repetida sobre el fenotipo de células SCLC, centrándose en el marcador neuroendocrino, POMC.
Resultados
se establecieron las células de SCLC humano (DMS 79) como xenoinjerto subcutáneo tumores en ratones desnudos CBA y luego expuestos a irradiación 2Gy repetido. En los animales no tratados, POMC en la sangre refleja estrechamente el crecimiento del tumor; una característica ideal para un biomarcador circulante. Después de la irradiación localizada repetida
in vivo
, circulando POMC disminuyó (P & lt; 0,01), en paralelo con una disminución en el tamaño del tumor, pero se mantuvo bajo, incluso cuando se reestablecieron los tumores. Los tumores extirpados muestran reducida y expresión claramente heterogéneo de POMC en comparación con los tumores no tratados. No hubo diferencia en el marcador epitelial, citoqueratina. Sin embargo, había células positivas significativamente más N-cadherina en los tumores irradiados. Para investigar la respuesta del tumor a la irradiación, las células fueron irradiadas DMS79 repetidamente
in vitro
y las células supervivientes seleccionados. expresión de POMC se redujo, mientras que los marcadores mesenquimales N-cadherina, β1-integrina, proteína específica de fibroblastos 1, β-catenina y expresión ZEB1 fueron amplificados en las células cebadas más de irradiación. No hubo cambios consistentes en la expresión de marcadores epiteliales. La morfología celular cambió drásticamente con células irradiadas en repetidas ocasiones presentan una forma más alargada, lo que sugiere un cambio a un fenotipo más mesenquimales.
Conclusiones
En resumen, la expresión y secreción de biomarcadores POMC se redujeron en los tumores SCLC cuales volvía a crecer después de la irradiación y en repetidas ocasiones la irradiación las células (irradiación-priming). Por lo tanto, POMC ya no era predictivo de la carga tumoral. Esto pone de relieve la importancia de los biomarcadores totalmente evalúan durante y después del tratamiento para evaluar la utilidad clínica. Por otra parte, el aumento en las características mesenquimales en células irradiadas podría ser indicativo de un fenotipo más agresivo
Visto:. Meredith SL, Bryant JL, Babur M, PW Riddell, Behrouzi R, Williams KJ, et al. (2016) La irradiación Disminuye el neuroendocrino biomarcador proopiomelanocortina en Small Cell Lung Cancer Cells
in vitro
y
En Vivo
. PLoS ONE 11 (2): e0148404. doi: 10.1371 /journal.pone.0148404
Editor: Stephanie Filleur, Universidad Tecnológica de Texas Health Sciences Center, Estados Unidos |
Recibido: 28 Octubre, 2015; Aceptado 18 de enero de 2016; Publicado: 5 Febrero 2016
Copyright: © 2016 Meredith et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. los fondos para el MST, JLB, PWR y RB fue proporcionada por el Fondo de Dotación Barbara Mawer, BBSRC, Sociedad de Endocrinología. La financiación también fue proporcionada por el acuerdo UE 7PM Metoxia subvención no. 222.741 (a KJ Williams, M. apoyo Babur)
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer
pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en el mundo occidental y el cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) es la forma más agresiva, lo que representa alrededor del 15% de todos los casos [1]. Este mal pronóstico se debe al rápido crecimiento, el desarrollo temprano de metástasis a distancia y la recaída casi inevitable con enfermedad resistente al tratamiento [2]. El tratamiento estándar actual para el CPCP es una combinación de quimioterapia y radioterapia. Una vez que los tumores primarios y metástasis dejan de responder al tratamiento, el tiempo de supervivencia para los pacientes es extremadamente corto. La falta de eficacia de la quimioterapia y la radioterapia después de la recaída SCLC pone de relieve la importancia de obtener una comprensión más profunda de los cambios celulares y moleculares en tumores resistentes a la terapia que se consideren.
En la actualidad, la radioterapia se administra a pacientes con CPCP que presentan con enfermedad limitada y con frecuencia también en la enfermedad extensa. La radioterapia se da en la primera o segunda ciclo de quimioterapia en dosis una o dos veces al día durante 3-5 semanas [3]. Radio y quimio-resistencia se pueden imitar
in vitro
y los estudios han demostrado que las células de SCLC irradiación resistente también adquirir resistencia a otros agentes [4,5]. Sin embargo, las características fenotípicas de las células de SCLC irradiación resistentes no se han documentado. marcadores neuroendocrinos han demostrado ser útiles, pero a menudo están limitados en su detección y estadificación de los pacientes con CPCP; por lo tanto, se buscan biomarcadores más sensibles y fiables para fortalecer el diagnóstico y el pronóstico.
El exceso de circulante POMC, el precursor de la hormona del estrés, la hormona adrenocorticotrópica (ACTH), es más comúnmente documentada en pacientes con tumores de la pituitaria, sino también en pacientes con tumores no pituitarios, particularmente SCLC [6-9]. Estos pacientes pueden presentarse con síntomas leves del síndrome de Cushing a moderada. Hemos demostrado que los niveles circulantes del marcador neuroendocrino, POMC, se correlacionan con una menor tasa de supervivencia en pacientes con tumores SCLC [10]. Sin embargo, si este biomarcador sería tan útil en la predicción de la recidiva del tumor después del tratamiento no se conoce
.
No-SCLC (NSCLC) células tratadas con radioterapia o quimioterapia tienen la capacidad de someterse a transición epitelio mesénquima (EMT) en respuesta a la terapia [11-17] y esto se está convirtiendo en una característica más ampliamente reconocido de metástasis en muchos tipos de cáncer [18,19]. Se sabe menos acerca de si hay una progresión similar en SCLC o si EMT está vinculada a la terapia de resistencia en este tipo de cáncer. Sin embargo, los estudios han demostrado que hay subpoblaciones de células adherentes SCLC
in vitro Windows que son más mesenquimales y presentan un aumento de la quimio-resistencia [20]. Además, hay evidencia de la EMT en los tumores SCLC, que se ha relacionado con una mayor capacidad de invasión y quimiorresistencia [21].
La naturaleza de las transiciones fenotípicas y la función del fenotipo neuroendocrino en los tumores SCLC son poco conocidos. Además, el impacto del tratamiento de irradiación sobre el fenotipo del tumor no se ha descrito en SCLC. Nuestro objetivo era determinar si POMC podría actuar como un biomarcador de la carga tumoral después del tratamiento de irradiación o si se altera como consecuencia de la resistencia a la irradiación, usando el mismo modelo murino como se establece anteriormente [10]. Se encontró que POMC se redujo significativamente en las células resistentes
in vitro
y
in vivo
y no era un buen predictor del crecimiento tumoral después de la irradiación. También había un interruptor mesenquimales distinta
in vitro e
in vivo
después de la irradiación, que podría ser indicativo de células tumorales más agresivas o móviles.
Métodos
cultivo de células
DMS 79 es una línea de células de SCLC originalmente de un derrame pleural tomado de una de 65 años macho de raza caucásica y estableció
in vitro fotos: por el Dr. Pettengill, (Escuela de Medicina de Dartmouth, Hanover, NH, EE.UU.). La línea celular fue donado por ella en 1990 [22]. Las células fueron autenticadas por el Fondo para secuenciación de ADN (Universidad de Manchester) en el momento del estudio y poseen tanto
p53 Opiniones y
Rb1
mutaciones. células DMS 79 crecen como suspendidos libremente agregados y se cultivaron en medio RTISS (RPMI 1640 + L-glutamina suplementado con 2,5% de FBS, 5μg /ml de insulina, 10μg /ml de transferrina, selenito 30 nM de sodio y tampón HEPES 1%) [23].
células DMS 79 se irradiaron usando una máquina de irradiación de rayos x fraccional (corporación de rayos X Faxitron, Suiza) a 2Gy y se dejaron recuperar durante 14-21 días. Este procedimiento se repitió durante 10 ciclos con las evaluaciones de viabilidad realizados antes y 72 horas después de cada tratamiento. El tiempo total en el cultivo fue de 32 semanas y el número total de pasajes de las células fue de entre 30 y 40. La viabilidad celular y tiempos de duplicación fueron evaluados por CellTiterGlo luminiscentes viabilidad celular de ensayo (Promega, WI, EE.UU.). Las células se expusieron a los desafíos 5Gy IR para determinar si las células habían adquirido resistencia a las dosis más altas de irradiación. ciclos de irradiación se llevaron a cabo en 3 culturas individuales para cada experimento.
estudios de xenoinjertos
Declaración de Ética.
Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con el Ministerio del Interior británico animal ( Procedimientos científicos), de 1986, y aprobados por la Universidad de Manchester local del Comité de ética.
se inyectaron células DMS 79 por vía subcutánea en ratones hembra CBA desnuda en 5x10
6 células /ratón en 0,1 ml de suero medio RPMI-1640 libre con la adición de 50% matrigel. Los ratones se obtienen de la Facilidad Universidad de Manchester Servicios Biológica y alojados en jaulas de ventilación internos en grupos de 5, a 22 ° C, en condiciones estériles con ropa de cama de serrín autoclave y enriquecimiento ambiental. El peso medio fue de 24,5 g +/- 0,37 g y ratones fueron de 12 semanas de edad al inicio del estudio. Los animales fueron sometidos a 12:12 ciclo de luz y oscuridad
ad libitum
el acceso a la dieta estándar estéril Chow (SDS) y agua estéril. Los ratones se asignan los grupos de tratamiento de 5 animales /grupo basado en el tiempo tomado por el tumor para alcanzar 250 mm
3. Los tumores fueron irradiados de forma local o sin tratamiento en 250 mm
3 en 2Gy /día durante 3, 5 ó 10 días consecutivos, dando la dosis total de 6, 10 y 20 Gy. Todos los animales fueron monitoreados de cerca para la salud general y el peso diario. Todos los animales se mantuvieron en buen estado de salud durante todo el experimento menos que se indique. Durante la mitad del experimento
in vivo
estudiar un ratón fue sacrificado debido a una hinchazón abdominal y pérdida de peso significativa (del grupo 4 [10] días consecutivos IR) y por lo tanto fue excluido del análisis.
Los ratones fueron sacrificados a las 10:00 am por el aumento de CO
2 y la dislocación cervical cuando los tumores alcanzaron 1.000 mm
3. Los tumores y otros órganos de interés eran entonces la mitad de formalina complemento congelado y la mitad fija y cera de parafina embebido. Las muestras de sangre de máxima 80μl fueron tomadas por la cola nick en los días 0, 13 y cada 7
º día después. plasma de ratón se analizó para POMC por ELISA (véase más adelante).
POMC ELISA
Los niveles circulantes de POMC se midieron en plasma de ratón utilizando una de dos sitios ELISA específico. Este ensayo siguió el mismo protocolo descrito anteriormente [10]. El límite inferior de sensibilidad del ensayo durante el estudio fue de 15 pmol/L.
La inmunohistoquímica /inmunocitoquímica
5μm secciones de cera fijado en formalina incrustados DMS 79 tumores fueron teñidas con POMC (N1C11, el anticuerpo producido en nuestro laboratorio) (ver [10] para más detalles de anticuerpos), enolasa neuronal específica (NSE) (monoclonal de ratón, clon de BBS /NC /VI-H14, Dako número gato M0873, la dilución 1: 100) citoqueratina (monoclonal de ratón, clon AE1 /AE3, Dako, número cat M3515, dilución 1: 100) y N-cadherina (CDH2 monoclonal de ratón, clon 6G11, Dako, número cat M3613, dilución 1:50) usando diaminobenceno (DAB) cromógeno Envision sistema (Dako). El anticuerpo secundario utilizado fue un anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG de ratón conjugado con HRP (Dako, número de Cat P0447, la dilución 1: 200). La recuperación del antígeno se llevó a cabo en todas las secciones usando tampón de citrato (pH 6) a 95ºC durante 30 minutos
imagen análisis
secciones tumorales fueron escaneadas con un aumento de 20x utilizando un escáner CT Aperio (Aperio Systems, Vista, CA) y la tinción citoplasmática DAB se cuantificó usando el Aperio positiva PIXELS v9.1 programa (Sistemas Aperio , Vista, CA). Sólo se analizó el tejido viable de cada sección y se excluyeron las áreas de tejido doblado /dañado y necrosis /pre-necrosis de reducir el sesgo. Los controles negativos se llevaron a cabo para todos los grupos de tratamiento con el fin de determinar los niveles de tinción de fondo que luego podrían ser excluidos mediante el software Aperio. Se analizaron las áreas de células viables de las secciones tumorales completas, los tumores de todos los ratones se incluyeron en el análisis y se analizaron 3 secciones de cada tumor.
Los datos generados se expresó como un porcentaje del número de píxeles positivos en comparación con número total de píxeles analizados (fracción número positivo), que puede ser equiparada a la fracción de área positiva [24].
PCR cuantitativa
79 células
DMS expuestos a un total de 21Gy IR
se cosecharon vitro gratis (ciclos 8x2Gy y ciclo 1x5Gy) en que muestran distintos cambios morfológicos de las células no tratadas cultivadas en el mismo período. El ARN se extrajo usando un kit de QIAGEN RNeasy Mini (usando tubos de QIAshredder). la síntesis de ADNc se realizó utilizando el QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen). Los cebadores se obtuvieron de Eurofins MWG, (Londres, Reino Unido) y fueron diseñados a través de fronteras exón. Los genes de interés incluyen;
POMC
,
ENO2 gratis (enolasa específica de las neuronas [NSE]),
NCAM1 gratis (de adhesión celular neural molécula [N-CAM]),
CHGA
(cromogranina A [CGA]),
KRT18 gratis (citoqueratina 18 [CK18]),
KRT19 gratis (citoqueratina 19 [CK19])
CDH1 gratis (cadherina epitelial [E -CAD]),
EPCAM gratis (molécula de adhesión celular epitelial),
CDH2 gratis (cadherina neural [N-Cad]),
ITGB1
(integrina β1),
CTNNB1 gratis (β-catenina),
ZEB1
,
FSP1 gratis (proteína específica de fibroblastos 1) y
ACTA1 gratis (α-actina de músculo liso). PCR cuantitativa se llevó a cabo utilizando Comienzo Acelerado universal SYBR Green (Roche) y se ejecuta /analizados usando la máquina de tiempo real PCR StepOnePlus y el software (Applied Biosystems)
& amp estadístico.; Análisis de Datos
Todos los análisis de datos estadístico se realizó utilizando GraphPad Prism versión de software 5. Los datos presentados es error medio y estándar de la media de un mínimo de tres experimentos individuales. Los coeficientes de correlación de Spearman se evaluaron mediante la prueba de correlación. Los datos cuantitativos de PCR en tiempo real se analizó usando el software StepOne y Microsoft Excel. La expresión génica de evaluación significación estadística se midió utilizando pruebas t no apareado. Utilizó un modelo lineal pruebas estadísticas se utilizaron para comparar múltiples grupos de datos, incluyendo comparaciones múltiples de Bonferroni.
Resultados
POMC es un biomarcador menos eficaz del crecimiento del tumor después de la irradiación
circulantes POMC imitaba con precisión la progresión del tumor en ratones xenoinjertados no tratados (Fig 1A) y había una fuerte correlación (r = 0,82, Fig 1B). Cuando los tumores fueron irradiados a nivel local para los 3 y 5 días también había una fuerte correlación positiva entre el tamaño del tumor y que circula POMC (Fig 1C-1F). Sin embargo las concentraciones de POMC terminales eran inferiores a los de los animales no tratados a pesar de que todos los animales habían sido mantenidas hasta que los tumores alcanzaron el mismo tamaño. Aún más sorprendente, cuando se irradiaron subcutáneos DMS 79 tumores durante 10 días consecutivos en 2Gy /día, POMC no reflejó re-crecimiento del tumor (r = 0,35, Fig 1G y 1H). Circulación POMC de muestras de plasma de terminales, cuando los tumores eran todos a 1.000 mm
3, fue 4 veces menor en el grupo de 20 Gy de irradiación en comparación con aquellos en el grupo no tratado (p = 0,0165 Fig 1I). proteína tumoral POMC también fue menor en el grupo de 20 Gy irradiado (p = 0,0092 figura 1J). Los datos de todos los ratones individuales se muestran en la Fig S1.
Se establecieron células DMS 79 como xenoinjertos subcutáneos y una vez que estaban 200-250mm
3 o bien deja crecer sin tratar (A) o expuestos a 2Gy IR /día durante 3 días consecutivos (C), 5 días consecutivos (E) o 10 días consecutivos (G). Circulación POMC se monitorizó mediante muestras de sangre en los días 0, 13, 20 y cada 7 días a partir de entonces. barras sombreadas indican el periodo en el que se expusieron los tumores localmente para IR. Que circula POMC y el tamaño tumoral se analizaron mediante análisis de correlación, que se realizó en todos los puntos de tiempo de cada grupo (B, D, F, H). Los resultados presentados (A, C, E, G) son ratones individuales, sino que representan 3-5 ratones /grupo. Todos los datos individuales de los animales se presentan en la Fig S1 circulante POMC se analizó en muestras de terminales (I). proteína entera a partir de muestras tumorales se analizó por ELISA para POMC (J). Los siguientes números de animales alcanzaron 1.000 mm
3 el volumen del tumor dentro de los 120 días a partir de la implantación del tumor; grupo no tratado 5/5, 4/5 3x2Gy, 5x2Gy 5/5, 3/4 10x2Gy * p = & lt; 0,05 ** p = & lt; 0,01. Los controles en la figura 1A originalmente se han descrito en Stovold et al. British Journal of Cancer [10].
POMC se reduce y claramente heterogénea después de la irradiación repetida
in vivo
Los tumores no tratados teñidos uniformemente positivo para POMC (figura 2A -2 C). Sin embargo, los tumores expuestos a 2Gy /día durante diez días muestran claramente menos y heterogénea tinción POMC dentro de las regiones de células viables (Figura 2D-2G). Secciones de todos los tumores se muestran en análisis pixel S2 Fig positiva a través de todos los tumores confirmó que había 23% más fuertemente las células POMC positivos en los tumores no tratados que en el 20 Gy irradiados tumores (Fig 2H). la expresión del gen de POMC también se redujo en los tumores 20 Gy IR (Fig 2I). Al examinar un marcador neuroendocrino alternativa, enolasa neuronal específica (NSE), no hubo diferencias en la tinción entre los tumores no tratados y irradiados (S3 FIG).
Se establecieron células DMS 79 como tumores subcutáneos en ratones desnudos y, o bien no se trata (AC) o expuestos a IR durante 10 días consecutivos en 2Gy /día (DG). Una sección central del tumor estaba manchada de POMC usando nuestro propio anticuerpo N1C11. (A & amp; D) muestran la totalidad del tumor secciones transversales, (B & amp; C) muestran una fuerte tinción homogénea POMC en las zonas tumorales separados en no tratados DMS 79 xenoinjertos. (E-G) muestran regiones de células tumorales viables de un irradiado DMS 79 xenoinjerto revelando (E) tinción fuerte, (F) más débil tinción heterogénea, (G) débil tinción. (H) Evaluación Cuantitativa por análisis de píxeles positivo de los tumores no tratados y los tumores tratados 20 Gy IR teñidas para POMC. (I) la expresión del gen de POMC se analizó en todos los tumores no tratados y 20 Gy de rayos infrarrojos. Los tumores que se presentan son representativos de 3-5 /grupo con el resto de tumores en la figura S2.
El aumento de la N-cadherina
in vivo después de la irradiación
Para determinar si no hubo ningún cambio adicional en el fenotipo, irradiado DMS 79 tumores de xenoinjerto también se analizaron para N-cadherina y citoqueratina (Fig 3). N-cadherina apareció baja o ausente en los tumores no tratados pero la expresión fue más fuerte en los tumores irradiados repetidamente, con la presencia de células N-cadherina fuertemente positivos individuales distribuidos a través de las secciones de tumor (Fig 3A y 3B). Además, algunas áreas fueron pobladas más densamente con las células positivas, la creación de una distribución heterogénea en general. Análisis de píxeles positivos confirmados N-cadherina fue significativamente mayor en los tumores irradiados (baja tinción 9 veces de incremento p = & lt; 0,001, de alta tinción 18 veces de incremento p = 0,0268) en comparación con secciones de tumores no tratados (figura 3C). tinción de citoqueratina, en cambio, mostró tinción positiva uniformemente en no tratada y se irradia secciones de xenoinjerto (Fig 3D y 3E), confirmado por análisis de pixel positivo (Fig 3F).
El marcador mesenquimal N-cadherina (N-Cad) (a & amp; B) y la citoqueratina epitelial marcador (CK) (D & amp; e) fueron analizados en todo no tratada y todo 20 Gy irradiado secciones tumorales. La evaluación cuantitativa ([C] N-Cad, [F] CK) por análisis positivo del pixel de las secciones de tejido teñido. La tinción se cuantifica como bajo, intermedio o alto en el área del tumor viable de (barras negras) no tratados frente a los tumores irradiados (barras grises). flecha roja indica un ejemplo de una célula altamente manchado, flecha amarilla indica un área de baja tinción. Muy fue descontado bajo nivel de tinción de fondo. *** = P & lt; 0,001 * p =. & Lt; 0,05
No hay cambios en las células POMC en DMS79 después de una sola dosis de irradiación
Resultados de la
In in vivo
estudios sugirieron que los tumores después de la radiación han adquirido las características fenotípicas que difieren de los tumores no tratados y que estos cambios se acoplaron con una disminución en la secreción de biomarcador POMC y de expresión y un aumento de la N-cadherina. Para investigar más a fondo, las células DMS79
in vitro
fueron expuestos a la radiación y se controlaron los cambios en el fenotipo. Inicialmente se les dio DMS 79 células una dosis de 2Gy o irradiación 5Gy para determinar si una sola dosis fue suficiente para promover los cambios fenotípicos (fig 4).
células DMS 79 se contaron en el día 0 y luego se irradiaron a 2Gy y 5Gy. Viable cuenta se llevaron a cabo hasta 7 días después de la irradiación antes que las células se tiñeron para POMC, citoqueratina (CK) y N-cadherina. Todos los ciclos de irradiación se llevaron a cabo en 3 cultivos independientes. * P = & lt; 0,05 ** p = & lt; 0,01 *** p = & lt; 0,001
La viabilidad celular se redujo significativamente en las células que fueron irradiados en tanto 2Gy y 5Gy. Sin embargo, las células viables que sobreviven muestran diferencias obvias en la morfología o en la expresión de POMC, citoqueratina y N-cadherina, 7 días después de la irradiación, lo que sugiere que la irradiación repetida se acopla con el cambio fenotípico
in vivo
.
Modificación de la radiación fenotipo
in vitro
DMS 79 células cultivadas
in vitro
a continuación fueron sometidos a una irradiación repetida durante 8 meses hasta que se volvieron más tolerantes al tratamiento (esquemática Fig 5A). Con más ciclos de irradiación en el número de células supervivientes un desafío 2Gy IR aumentó (Fig 5B). Después de 9 ciclos de irradiación se produjo una disminución en el tiempo de duplicación de las células sometidas a la irradiación (Fig 5D) y una disminución en la secreción de POMC (Fig 5E).
células DMS 79 se irradiaron a 2Gy durante 10 ciclos progresivos (esquema [A]). El porcentaje de células supervivientes en los cultivos irradiados se comparó con el "control" es decir, las células no tratadas en ese ciclo particular (B) (correlación de Spearman = p & lt; 0,0001). El experimento se llevó a cabo con estos controles para permitir una mayor la proliferación que irradia las células que aparecen con el tiempo en comparación con las células no tratadas completamente. DMS 79 células también se estimularon con dosis más altas de IR (5Gy) en varios puntos para evaluar la radiosensibilidad (C). Las células restantes se expresaron como porcentaje de los controles (B & amp; C). Cell tiempos de duplicación no tratada vs células 21Gy IR (9 ciclos en total, 8 de 2Gy y 1 de 5Gy) se calcularon más de 5 días (D). la secreción de POMC se evaluó más de 8 días por POMC ELISA y los resultados se normalizaron al número de células (E). La morfología celular de las células DMS 79 no tratados (F). La morfología celular de las células irradiadas a 21Gy, mostrando colonias adherentes y las células adherentes individuales alargada (G) y muy racimos firmemente en suspensión (H) en comparación con los terrones sueltos en suspensión que se muestran en (F).
Después de cada ciclo de la irradiación 2Gy, algunas de las células fueron tomadas para el desafío con 5Gy para determinar si había habido algún cambio en la tolerancia a mayores dosis de radiación (figura 5C). El porcentaje de células supervivientes después del tratamiento (2Gy y 5Gy) mayor que el número de ciclos de IR aumentó (Fig 5B y 5C). Las células que habían sido irradiados a un total de 21Gy (glóbulos IR-cebado) mostraron resistencia a un tratamiento adicional.
morfología Curiosamente, las células cebadas-IR visualizan alteradas drásticamente. Sin tratar células DMS 79 forman agregados en suspensión irregulares de células redondeadas (Fig 5F), mientras que los cultivos cebados-IR presentan como una combinación de grupos adherentes, células adherentes individuales alargada (Fig 5G y 5H) y esferas muy apretado en suspensión (Fig 5H). Este cambio en la morfología sugiere que las células pueden haber sufrido un interruptor fenotípica, es concebible que un estado más mesenquimales.
IR-priming células han disminución de la expresión de POMC
DMS 79 células cebadas IR-que tenían sido sometido a radioterapia fraccionada a una dosis total de 21Gy mostraron una disminución significativa en mRNA POMC (p = 0,033). Sin embargo, no hubo ningún cambio en los otros marcadores neuroendocrinos, de células neuronales molécula de adhesión (N-CAM), cromogranina A (CGA) y enolasa específica de neuronas (NSE) (Fig 6).
expresión mRNA fue analizado en DMS células 79-IR (barras grises) y las células no tratadas que se cultivan en condiciones paralelas a las células tratadas (barras negras). los niveles de mRNA se normalizaron a la expresión de GAPDH. * P & lt; 0,05 *** p =. & Lt; 0,001
El tratamiento de radiación se combina con un cambio a un fenotipo mesenquimal más
En paralelo con el
in vivo
datos, las células de SCLC imprimados-IR no mostraron cambios consistentes en general en los marcadores epiteliales, citoqueratina 18, citoqueratina 19, e-cadherina y epitelial molécula de adhesión celular (EpCAM) (Fig 6). Sin embargo, lo más interesante, cinco de los seis marcadores mesenquimales analizados, se upregulated; p N-cadherina = & lt; 0,001, integrina β1 p = 0,044, proteína-fibroblastos específico 1 p = 0,03, p = ZEB1 & lt; 0,001, β-catenina p = & lt; 0,001. Estos datos son consistentes con las observaciones morfológicas
in vitro
y la cuantificación de
in vivo
tinción.
Discusión
La evaluación de las células tumorales de SCLC
in vivo
y
in vitro
ha identificado un cambio en el fenotipo después de la exposición a la irradiación repetida. expresión de POMC disminuyó en los tumores
in vivo
la irradiación después de repetidas y la disminución de POMC también se encuentra en las células tumorales irradiadas
in vitro
. Además de esto alterada fenotipo neuroendocrino, se observó un aumento en las características mesenquimales después de la irradiación repetida.
Numerosos estudios han identificado biomarcadores candidatos para varios tipos de cáncer, lo que significa su importancia en el diagnóstico, el pronóstico y la detección temprana de recaídas en pacientes. Sin embargo, existe una complejidad significativa en la utilidad de los biomarcadores. En el estudio actual, la irradiación de las células DMS 79
in vivo
produjo una reducción de POMC en la sangre, y la disminución de la proteína POMC y los niveles de expresión de mRNA en tumores a pesar de que los tumores se habían vuelto a crecer. Esto indica que la expresión de biomarcador ha cambiado como resultado de tratamiento y ya no es capaz de predecir con exactitud el nuevo crecimiento del tumor. Hemos descrito previamente POMC como un nuevo marcador biológico en pacientes con SCLC y se la mostró correlacionado con metástasis en el hígado [10]. Podría ser que en los pacientes, la irradiación es la reducción de POMC expresión /producción en el tumor primario, (como se ve en los xenoinjertos) pero cualquier metástasis en los pacientes (especialmente aquellos en el hígado) todavía puede ser secretando altos niveles de POMC en el la circulación.
POMC podría ser un marcador biológico muy específico y sensible para un subconjunto de pacientes con CPCP que no han sido tratados. Sin embargo, es importante tener en cuenta que la medición POMC puede resultar engañosa para la mayoría de los pacientes que han tenido la irradiación y con recaída, porque las concentraciones circulantes de POMC producidos por el tumor primario permanecen suprimidas. Por lo tanto POMC muestra una relación marcadamente diferente con volumen tumoral en tumores no tratados frente irradiados. Si bien es cierto que un aumento de POMC indicaría la recaída después de la radioterapia, la carga tumoral con la que esto está asociado sería mucho mayor que la observada sin el tratamiento de radiación. En la figura 1 un tumor sin tratar de 200 mm3 produce 300pmol /l de POMC pero un tumor tratado con 20 Gy sería 1000cm3 antes de que produce la misma cantidad de POMC. Si esto se tradujo a los pacientes, sería influir en la forma bien POMC podría ser utilizado porque en el momento de un tumor dado recaída radioterapia es lo suficientemente grande para ser detectado por POMC, que podría ser más allá del tamaño para el que una intervención alternativa podría ser útil. Situaciones similares es probable que existan otros biomarcadores, donde los estudios no han considerado el tipo y grado de tratamiento
.
A pesar de que hubo una disminución significativa en la POMC
in vitro
y
in vivo
después de la irradiación, no hubo ningún cambio en N-CAM, NSE o cromogranina a la expresión del gen
in vitro
. Esto indica que los aspectos del fenotipo neuroendocrino persisten después de la irradiación. Esto sugeriría que la irradiación repetida puede ser como resultado cambios en el gen de POMC o la vía de POMC que conducen a la disminución de la secreción de POMC, pero no está alterando el fenotipo neuroendocrino en general. Estos resultados demuestran que la hora de analizar un nuevo marcador biológico, es muy importante ser consciente de la plasticidad de la expresión de biomarcador de post-tratamiento.
En paralelo con los cambios en la expresión de POMC no había una regulación al alza de los marcadores mesenquimales N- cadherina, β1-integrina, ZEB1, fibroblastos-proteína específica 1 y β-catenina en el ARNm. Esto proporciona información sobre los mecanismos implicados en la respuesta de las células tumorales al tratamiento. Transición epitelial a mesenquimal se sabe que está asociada con la resistencia a la terapia. En este estudio, la resistencia adquirida se acompaña de una disminución de la POMC y una regulación al alza de los marcadores mesenquimales. La resistencia a la irradiación de las células de SCLC previamente se ha identificado con N-acetylglucoaminyltransferase V (GnT-V) más de expresión y la regulación positiva de GnT-V
in vivo
causando un aumento en N-cadherina, vimentina y ZEB2, de nuevo lo que sugiere una relación entre la radiosensibilidad y el cambio de EMT-como [25]. los niveles de N-cadherina son conocidos por aumentar después de la irradiación en células de NSCLC [16,17], y en tumores de xenoinjertos de tiroides folicular [26]. EMT también se activa en células de cáncer de mama que reciben dosis bajas de radiación [27]. Además, se observó que las células de SCLC cuando se expone a la irradiación repetidas rondas de
in vitro
fueron más separado de otras células y se muestra una morfología alargada que está en consonancia con un fenotipo mesenquimal.
Aunque la irradiación es reducir significativamente la carga tumoral en los pacientes, que podría ser células conduce hacia un fenotipo más agresivo, mesenquimales. El mecanismo para esto no se conoce, aunque las especies reactivas de oxígeno (ROS) generados como consecuencia de la radioterapia o la continuación de fumar puede alterar la adhesión celular y estimular la invasión de células [28]. ROS puede también inducir la EMT a través de la regulación positiva del represor E-cadherina, Caracol [29]. Sin embargo, este mecanismo es menos probable que los niveles de E-cadherina se mantuvieron sin cambios en las células irradiadas en nuestro
in vitro
modelo. La expresión del gen E-cadherina sin cambios sugiere que en lugar de un mecanismo de EMT clásica que se observa a menudo en NSCLC [11,12,14,15], las células de SCLC son solamente upregulating características mesenquimales. Es el fenotipo mesenquimal que se considera responsable de la invasión y colonización secundaria de las células tumorales [30]. En este modelo particular, sin embargo, el tratamiento de irradiación no pudo producir metástasis en los pulmones, el cerebro o hígado de estos ratones (datos no presentados). La ausencia de metástasis en el
in vivo
modelo podría atribuirse al entorno de acogida, las dificultades en la señalización entre las especies (SCLC células humanas en ratones), la falta de factores inmunes, o tiempo suficiente para que las células colonizan secundaria órganos.