Extracto
Es difícil detectar el cáncer de páncreas o el cáncer del tracto biliar en una etapa temprana mediante la tecnología de diagnóstico actual. Utilizando marcadores microARN (miARN) que son presente de forma estable en la sangre periférica, que tuvo como objetivo identificar los cánceres de páncreas y del tracto biliar en pacientes. Con "3D-Gen", un microarray de alta sensibilidad, se examinaron los perfiles completos de expresión de miRNA en 571 muestras de suero obtenidas de pacientes sanos, pacientes con páncreas, tracto biliar, u otros cánceres digestivos, y los pacientes con alteraciones no malignas en el páncreas o del tracto biliar. Las muestras se dividieron aleatoriamente en formación y la prueba de cohortes y los candidatos miARN marcadores fueron evaluados de forma independiente. Hemos encontrado 81 miRNAs para el cáncer de páncreas y 66 miRNAs para el cáncer del tracto biliar que mostraron estadísticamente diferentes de expresión en comparación con los controles sanos. Entre los marcadores, 55 miRNAs eran comunes tanto en el páncreas y las muestras de cáncer del tracto biliar. El ya se ha informado de miR-125a-3p fue uno de los marcadores comunes; sin embargo, también se expresó en otros tipos de cánceres del tracto digestivo, lo que sugiere que no es específico de tipos de cáncer. Con el fin de discriminar los cánceres Pancreato-biliar de todas las otras condiciones clínicas que incluyen los controles sanos, anormalidades no malignas, y otros tipos de cánceres, hemos desarrollado un índice de diagnóstico utilizando perfiles de expresión de los 10 miRNAs más significativos. Una combinación de ocho miRNAs (MIR-6075, MIR-4294, miR-6880-5p, miR-6799-5p, miR-125a-3p, MIR-4530, miR-6836-3p, y MIR-4476) alcanzó una sensibilidad , especificidad, precisión y AUC de 80,3%, 97,6%, 91,6% y 0,953, respectivamente. Por el contrario, CA19-9 y CEA dieron sensibilidad de 65,6% y 40,0%, especificidades de 92,9% y 88,6%, y una precisión de 82,1% y 71,8%, respectivamente, en la misma cohorte de prueba. Este índice de diagnóstico identificó 18/21 cánceres de páncreas operable y 38/48 cánceres del tracto biliar operables en toda la cohorte. Nuestros resultados sugieren que la evaluación de estos marcadores miARN es clínicamente útil para identificar a los pacientes con cánceres Pancreato-biliar que podrían beneficiarse de la intervención quirúrgica
Visto:. M Kojima, Sudo H, J Kawauchi, Takizawa S, S Kondo , Nobumasa H, et al. (2015) microARN marcadores para el diagnóstico de los cánceres de páncreas y tracto biliar. PLoS ONE 10 (2): e0118220. doi: 10.1371 /journal.pone.0118220
Editor Académico: Ajay Goel, Baylor University Medical Center, Estados Unidos |
Recibido: 24 Julio, 2014; Aceptado: January 11, 2015; Publicado: 23 Febrero 2015
Derechos de Autor © 2015 Kojima et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos de microarrays de este estudio están de acuerdo con la información mínima sobre un Microarray Experiment (MIAME) y están a disposición del público a través de la Expresión génica Omnibus (GEO) de bases de datos (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo/) bajo el número de GSE59856
Financiación:. SA, JK, ST, SK y HN fueron empleados a tiempo completo de Toray Industries, Inc. en el momento del estudio. No hay limitaciones de los patrocinadores de uso o difusión de los datos, o la influencia sobre los resultados o conclusiones. Los patrocinadores no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. En el momento del estudio, SA, JK, ST, SK y HN eran empleados a tiempo completo de Toray Industries, Inc. que ofrece productos de microarrays que fueron investigados en este estudio comercializados. Sin embargo, esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
El cáncer de páncreas es uno de los cánceres más letales. La mayoría de los cánceres de páncreas no acompañan a los síntomas clínicos particulares en la primera etapa, permitiendo que los cánceres de progresar sin ser detectados. Además, las imágenes radiológicas ambiguas de las lesiones cancerosas y condiciones inflamatorias en el páncreas prevenir los cánceres de páncreas de ser identificado correctamente. Además, la localización anatómica del páncreas, en el fondo en un espacio retroperitoneal rodeado de muchos otros órganos, dificulta la adquisición de una biopsia. Todos estos factores impiden la detección temprana de cáncer de páncreas. La Asociación Americana del Cáncer estima que 40.000 personas morirán de cáncer de páncreas en 2014 en los Estados Unidos [1]. La tasa de supervivencia a cinco años para los pacientes con cáncer de páncreas exocrino se estima en 14% para el estadio IA, pero se reduce a 1% para el estadio IV [1]. Debido a que el tratamiento más prometedor para el cáncer de páncreas es la resección quirúrgica, la detección de cáncer de páncreas en etapas quirúrgicamente resecables es crucial para mejorar la tasa de supervivencia de los pacientes con cáncer de páncreas. Desde este punto de vista, la proyección de las primeras etapas de cáncer de páncreas o del tracto biliar es imprescindible.
Como un método de cribado de diagnóstico para el cáncer de páncreas, el ultrasonido es una de las pruebas más comunes realizadas. Sin embargo, este análisis de imagen tiene su dificultad en la diferenciación de tejido no maligno de tejido maligno [2]. Además, muchos antígenos asociados a tumores se han estudiado en relación con el cáncer de páncreas. El biomarcador más validada y clínicamente útil es el antígeno carbohidrato (CA) 19-9; Sin embargo, CA19-9 es conocido por ser hasta reguladas en otras condiciones inflamatorias, y su bajo valor predictivo positivo hace que sea un biomarcador para la detección pobres, lo que limita su uso actual sobre todo para el seguimiento post-quirúrgico de los cánceres de páncreas progresados [3, 4 ]. En la actualidad, no existe un método eficaz para la detección temprana de los cánceres de páncreas, resecables quirúrgicamente con suficiente precisión diagnóstica.
Recientemente, los microARN (miARN) han sido reportados como biomarcadores potenciales para varios tipos de cánceres. El uso de muestras de plasma de 50 pacientes con cáncer y diez sujetos de control sanos, así como líneas de células pancreáticas de quimioterapia resistente, Ali
et al
. sugirieron que el suero de miR-21 y otros miRNAs podían predecir la agresividad del cáncer de páncreas [5]. Ganepola
et al
. examinado una docena de muestras de plasma de cada uno de los pacientes con y sin cáncer de páncreas, y concluyó que tres miRNAs, miR-642b, miR-885-5p, y miR-22, eran más del 90% sensible y específico para el diagnóstico de cáncer de páncreas [6]. Del mismo modo, el grupo de Li examinó 20 o menos muestras de suero de cada uno de los pacientes con cáncer de páncreas y de control, respectivamente, como la cohorte de descubrimiento de biomarcadores, y se encontró que múltiples miRNAs incluyendo miR-1290 eran útiles en la detección temprana de cáncer de páncreas [7]. Más recientemente, los investigadores han analizado más de 100 muestras de sangre de cada uno de los pacientes con cáncer de páncreas y controles, y algunos encontraron el miR-155, miR-181, miR-181b y [8] miR-196a, y otras que se encuentran miR-20a, miR 21, miR-24, miR-25, miR-99a, miR-185 y miR-191 [9] para los marcadores sanguíneos miARN. Cabe señalar que cada uno de los estudios anteriores sugirieron diferentes marcadores circulantes miARN para el cáncer pancreático. Las discrepancias de los estudios anteriores se podrían atribuir a varios factores empíricos que incluyen los tipos de muestras de sangre (PBMC, de plasma o suero), diferentes tecnologías de detección (PCR, microarrays o secuenciador), y la heterogeneidad de las cohortes de muestra. Sobre todo, el tamaño suficiente y la diversidad de las cohortes de muestra son críticos en la investigación de biomarcadores no sólo para el grupo objetivo, sino también para el grupo de control.
A continuación, se examinaron los perfiles de expresión de miRNAs en suero integrales de la más grande cohortes de pacientes que se haya intentado: 100 pacientes con cáncer de páncreas, 98 pacientes con cáncer de las vías biliares, 150 pacientes control sanos, 21 pacientes con alteraciones no malignas en el páncreas o en el tracto biliar, y 202 pacientes con otros tipos de cánceres. Un microarray de alta sensibilidad permite el análisis simultáneo de más de 2.500 miRNAs que se han actualizado recientemente en el miRBase (versión 20), y las muestras de suero de pacientes con las diversas condiciones clínicas nos permitió evaluar una amplia gama de especificidad diagnóstica en la detección de pancreato -biliary cáncer.
Mediante la combinación de ocho marcadores miARN, hemos sido capaces de detectar a los pacientes con cánceres pancreato-biliar entre los que estaban sanos, tenían anormalidades no malignas o tenían otros tipos de cánceres, con una precisión diagnóstica de 91,6% y el AUC de 0,953.
Métodos
declaración de Ética
Esta investigación en seres humanos fue aprobado por la Junta de Revisión del hospital Cancer Center de Oriente Institucional Nacional (2010-096) y por las muestras de tejidos humanos Comité de Ética para el amplificador de I + D;, Toray Industries Inc. (HC2013-4, 128 y HC2014-4). escrito el consentimiento informado se obtuvo de cada participante.
Las muestras clínicas
Las muestras de sangre se obtuvieron de un total de 421 pacientes que fueron admitidos a la japonesa Hospital Nacional del Centro del Cáncer Este durante los años 2010 a 2012 . Un centenar de pacientes con cáncer de páncreas, 98 pacientes con cáncer del tracto biliar, 50 pacientes con cáncer de colon, 50 pacientes con cáncer de estómago, 50 pacientes con cáncer de esófago, 52 pacientes con cáncer de hígado y 21 pacientes con pancreática o biliar no maligno enfermedades -tract se registraron en el Biobanco y seleccionados para su uso en este estudio. Para páncreas y cáncer del tracto biliar, se excluyeron los pacientes con las siguientes características: (i) los pacientes con neoplasia papilar mucinosa intraductal, (ii) los pacientes diagnosticados de forma simultánea o previamente con cáncer avanzado en otro órgano, (iii) los pacientes con cáncer inciertos para ser ya sea pancreática o biliar, y (iv) los pacientes con histología de adenocarcinoma especial distinto. Todos los pacientes fueron confirmados histológicamente, y aquellos con cáncer fueron diagnosticados patológicamente como tener adenocarcinoma. Todas las muestras de sangre de pacientes con cáncer fueron tomadas antes de cualquier tratamiento, excepto un caso de cáncer de páncreas con ypStage I, que había recibido la intervención terapéutica. La información detallada acerca de estos pacientes se muestran en la Tabla 1B-D.
muestras de sangre de control se obtuvieron de individuos sanos reclutados de las empresas filiales japonesas de Toray Industries Inc. en 2013. Los criterios de inclusión para los individuos control sanos fueron la edad mayor de 60 años, sin antecedentes de cualquier tipo de cáncer, y sin hospitalización durante los últimos 3 meses (Tabla 1A).
biomarcadores
Todas las muestras de sangre periférica se procesaron con el suero dentro de un día de la adquisición, y suero incluyendo CA19-9 y CEA se midieron antes de que las muestras de suero restantes se almacenaron a -80 ° C para el análisis de los genes miARN.
incrustadas (FFPE) muestras con formalina de parafina fijo de los tumores de páncreas y tejidos normales adyacentes se obtuvieron de 10 al azar pacientes seleccionados con cáncer de páncreas (un caso de estadio IIA, ocho casos de fase IIB, y un caso de estadio III). En las secciones FFPE con el tamaño de 10 x 10μm, área de tumor se caracterizó por la tinta usando las diapositivas vecinos que eran H.E. manchado. El área del tumor y el tejido normal adyacente macroscópicamente fueron entonces diseccionados.
análisis de la expresión de los genes miARN microarray
Para cada grupo clínico, se realizó el análisis de la expresión de los genes miARN al mismo tiempo, independientemente de la cohorte de entrenamiento o la prueba cohorte. El ARN total se extrajo de cada muestra de suero de 300 l usando el reactivo de extracción de ARN "3D-Gen" de un kit de muestra líquida (Toray Industries, Inc., Tokyo, Japón). El ARN total se obtuvo también a partir de las secciones FFPE utilizando el "Arcturus" "Paradise" Extracción y kit de aislamiento (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Análisis exhaustivo miARN expresión se realizó con un "3D-Gen" kit miARN etiquetado y un "3D-Gen" miARN Humano Oligo Chip (Toray Industries, Inc.), que fue diseñado para detectar miRNAs 2.555 registrados en el miRBase liberar 20 (http : //www.mirbase.org/)
miRNAs individuales fueron considerados como presente si las señales de microarrays correspondientes fueron de más de (la media + 2x desviación estándar) de las señales de control negativo de los cuales la parte superior e inferior. 5% clasificados en orden de intensidad de la señal se eliminaron. Una vez que el miARN fue considerado como presente, la señal de miARN se restó con la señal media de los controles negativos de los cuales fueron retirados de la parte superior e inferior al 5% clasificados en orden de intensidad de la señal. Cuando la señal se convirtió en un valor negativo (o no fue detectado) después de la sustracción de fondo, el valor fue reemplazado por el número que fue la más baja intensidad de la señal en el microarray menos 0,1 en un registro
2 escala. Con el fin de normalizar las señales a través de los diferentes microarrays ensayadas, se llevó a cabo cuantil normalización [10]. Todos los datos de microarrays de este estudio están de acuerdo con la información mínima sobre un Microarray Experiment (MIAME) y están disponibles al público a través de la base de datos de la Expresión Génica Omnibus (GEO) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/. geo /) bajo el número de GSE59856
el análisis estadístico
En este estudio, los perfiles de expresión de miRNA de las cinco condiciones siguientes emparejado-clínicos fueron comparados estadísticamente: i) el cáncer de páncreas en comparación con controles sanos , ii) el cáncer del tracto biliar versus control sano, iii) pancreato-biliar cáncer frente a anomalías no malignas, iv) el cáncer de pancreato-biliares versus otros tipos de cáncer, y v) cáncer de pancreato-biliares frente a todas las otras condiciones clínicas (control sano , anormalidades no malignas, y otros tipos de cáncer). Para cada condición, los pacientes con páncreas y /o cáncer de las vías biliares eran considerados como el grupo de cáncer, y los otros grupos fueron considerados como control.
Después se llevaron a cabo todos los experimentos de microarrays, las muestras de cada condición clínica fueron divididos aleatoriamente en una cohorte de formación (2/3 de las muestras) y una cohorte de prueba (un tercio de las muestras) mediante cálculo. Las características clínicas de la cohorte de la formación y la cohorte de prueba se examinaron y confirmaron que no había ninguna diferencia significativa en estas dos cohortes. La cohorte de formación se utilizó para seleccionar los marcadores miARN significativos y definir sus funciones discriminantes, y la cohorte de prueba que es independiente de la cohorte de formación se utilizó para validar el rendimiento diagnóstico de los marcadores de genes miARN seleccionados en base a la misma significación estadística. Los análisis de la cohorte de la formación y la cohorte de prueba fueron programadas de antemano y realizan secuencialmente sin overcrossing esas cohortes. En el proceso de selección de los marcadores de genes miARN, cualquiera de los dos grupos clínicos se compararon mediante la prueba t de Student bilateral, y un p-valor corregido de Bonferroni-& lt; 0,01 se consideró estadísticamente significativa. Para el análisis de FFPE, ya que se analizó sólo ocho miRNAs que fueron preseleccionadas, la corrección de Bonferroni no se aplicó a la p-valor. Con el fin de obtener biomarcadores robustos, sólo miRNAs que mostraron un valor de señal de 2
6 en más de un 50% en ninguno de los grupos que se comparan clínica fueron seleccionados para su posterior análisis. El uso de estos miRNAs, se realizó un análisis discriminante lineal de Fisher, y la consiguiente sensibilidad diagnóstica, especificidad y precisión se calcularon para cada marcador miARN o combinación de marcadores de genes miARN.
Cuando se utilizan expresiones de múltiples miRNAs en el desarrollo de algoritmos , las funciones discriminantes fueron creados con el análisis discriminante lineal de Fisher. Los valores resultantes de las funciones discriminantes fueron llamados como índices de diagnóstico. Las muestras clínicas que mostraron la puntuación indexada por encima de 0 se clasificaron para el cáncer de pancreato-biliares, y las muestras que mostraban la puntuación indexada por debajo de 0 se clasificaron para el cáncer no pancreato-biliar (u otras condiciones clínicas). Como otra herramienta estadística para analizar el rendimiento diagnóstico de biomarcadores ', característico análisis de funcionamiento del receptor (ROC) y su área bajo la curva también se utilizaron los valores (AUC).
Todos los cálculos se realizaron utilizando la versión 3.0.2 R (R Fundación para la Computación de estadística, http://www.R-project.org), MASS paquete de la versión 7,3 a 30 [11] y la versión del paquete de abejas enjambre 0.1.6 [12].
resultados
características clínicas de los individuos de control sanos y los pacientes con cáncer de páncreas, cáncer de las vías biliares, otros tipos de cáncer o alteraciones no malignas en pancreato-tracto biliar
las características de 150 individuos sanos de control, 100 pacientes con cáncer de páncreas, 98 pacientes con cáncer del tracto biliar, 21 pacientes con alteraciones no malignas en esos órganos, y 202 pacientes con otros tipos de cáncer se presentan en la Tabla 1A-e. La edad media de los controles sanos fue ligeramente menor (62 años de edad) que la de los pacientes con cáncer de páncreas (68 años de edad) o con el cáncer del tracto biliar (67 años de edad). Además, el grupo de control sano fue claramente dominado por los hombres (91%), mientras que los pacientes con cáncer fueron por lo menos (64% hombres, tanto para los grupos de páncreas y tracto biliar-cancerosas).
Todo 100 de páncreas pacientes con cáncer tenían adenocarcinoma ductal pancreático. Veintiuno de 100 pacientes con cáncer de páncreas fueron sometidos a resección quirúrgica (1 ypStage I, 1 ypStage IIB, 17 pStage II, III y cStage 1 1 cStage IV). El resto de los pacientes con cáncer de páncreas que no se sometieron a resección quirúrgica se clasificaron como cStage III o IV. Por otra parte, los casos de cáncer del tracto biliar, se clasificaron simplemente casos operables y inoperable, debido al sistema de estadificación TNM complejo y las identidades biológicas distintas a través de diferentes sitios primarios (conducto biliar intrahepática, de las vías biliares extrahepáticas, vesícula biliar, etc.) dentro de las vías biliares.
Comparación de cáncer de páncreas o el cáncer del tracto biliar con control de
sanos
el uso de la cohorte de formación, los pacientes con cáncer de páncreas se compararon estadísticamente con los individuos control sanos, y 120 miRNAs mostró un potencial para separar esos dos grupos clínicos con p-valor de corrección de Bonferroni de menos de 0,01 por la prueba t de Student. De los 120 seleccionados miRNAs en la cohorte de formación, 81 miRNAs se validaron estadísticamente en la cohorte de prueba (p & lt; 0,01). Entre ellos, 40 miRNAs fueron reguladas y 41 miRNAs se redujeron regulado en el cáncer de páncreas. La lista de estos miRNAs seleccionados, sus p-valores, los niveles de expresión y el rendimiento diagnóstico se presenta en la Tabla S1. Higo. 1A muestra señales de expresión de miR-125a-3p y miR-6893-5p que mostró los valores p más pequeños en comparación con los pacientes con cáncer de páncreas y los individuos control sanos de la cohorte de formación, y también fueron validados en la cohorte de prueba.
Las barras de error indican el error estándar. Los valores de p se corrigieron Bonferroni.
El mejor marcador, miR-125a-3p, fue capaz de detectar 30 de 33 (90,9%) cánceres pancreáticos en la cohorte de prueba. En contraste, los biomarcadores de sangre ampliamente utilizados para el cáncer pancreático, CEA y CA19-9, detectaron 52 (52,0%) o 77 (77,0%), respectivamente, de 100 tipos de cáncer de páncreas en toda la cohorte. En general, 40 de 81 validadas marcador candidatos miARN para el cáncer de páncreas mostraron sensibilidades más altas que la de CA 19-9 en la cohorte de prueba (S1 Tabla).
Del mismo modo, se realizó un análisis comparativo de los pacientes con tracto biliar el cáncer y los individuos control sanos. Ciento veinticuatro miRNAs mostraron significación estadística (p & lt; 0,01) en la cohorte de formación, y fuera de los 124 miRNAs, 66 miRNAs fueron validados en la cohorte de prueba (S1 Tabla). Entre ellos, 30 miRNAs fueron reguladas y 36 miRNAs se redujeron regulado en el cáncer del tracto biliar. señales de expresión de miR-125a-3p y miR-6893-5p que mostraron los valores p más pequeños en comparación con el cáncer de las vías biliares y control sano en la cohorte de formación y también fueron validados en la cohorte de prueba se muestra en la Fig. 1B. Una vez más, el mejor marcador para detectar el cáncer del tracto biliar fue miR-125a-3p, y fue capaz de detectar 32 de 33 (97,0%) en la cohorte de prueba. En contraste, CEA y CA19-9 detectaron 30 (30,6%) y 62 (63,3%), respectivamente, de los 98 tipos de cáncer del tracto biliar en toda la cohorte. En general, 61 de 66 validadas marcador candidatos miARN para el cáncer del tracto biliar, mostró una sensibilidad superior a la de CA 19-9 (57,1%) en la cohorte de prueba (S1 Tabla).
También encontramos que, a pesar de evidentes diferencias histológicas, se seleccionaron una serie de miRNAs como marcadores no sólo para el cáncer de páncreas, pero también para el cáncer del tracto biliar; de los 81 miRNAs seleccionados como candidatos marcador para el cáncer de páncreas, 55 (67,9%) también fueron seleccionados como candidatos marcador para el cáncer del tracto biliar. En contraste, cuando se buscaron miRNAs que podrían discriminar cáncer de páncreas de cáncer del tracto biliar, ninguno alcanzó significación estadística. El miARN que mostró el más mínimo valor de p corrección de Bonferroni (0,071) en comparación con el cáncer de páncreas y tracto biliar fue miR-1227-5p; sin embargo, que miARN fue seleccionado como un marcador tanto para el cáncer de páncreas (en el puesto 78) y para el cáncer del tracto biliar (en el puesto 46) (Tabla S1). Esos resultados nos llevaron a concluir que la diferenciación de cáncer de páncreas y cáncer del tracto biliar por miRNAs suero sería difícil.
Esta fuerte superposición en los perfiles de expresión de genes miARN entre el cáncer de páncreas y cáncer del tracto biliar llevados sospechar que estos marcadores miARN se vieron afectados por la ictericia, una condición clínica común sobre el páncreas y el tracto biliar. Por lo tanto, hemos examinado un marcador de la ictericia, la sangre D-bilirrubina, en pacientes con cáncer Pancreato-biliar. El ochenta y uno de 100 pacientes con cáncer de páncreas y 78 de 98 pacientes con cáncer del tracto biliar tenía sangre D-bilirrubina bajo el valor de corte de 0,8 mg /dl, y el valor medio de la concentración en sangre D-bilirrubina fue 0,2 mg /dl, tanto para pancreático y los pacientes con cáncer de las vías biliares, lo que sugiere que la mayoría de estos pacientes eran no-ictericia. Además, ninguno de los 55 marcadores miARN que se superponen en el cáncer del tracto biliar y el cáncer de páncreas se correlacionó con el nivel D-bilirrubina (correlación de Pearson el más alto fue -0.37). Estos resultados confirmaron que los miRNAs común seleccionada no era probable un marcador para la ictericia, pero un marcador para el cáncer de pancreato-biliar.
Sobre la base de estas observaciones, por lo que decidió seguir los marcadores que pueda detectar de forma simultánea tanto de páncreas y cánceres del tracto biliar.
Comparación de cáncer pancreato-biliar con alteraciones no malignas, o con otros tipos de cánceres
El biomarcador ideal para el cáncer pancreato-biliar debe demostrar su especificidad no sólo contra sana control, sino también contra las condiciones de enfermedades no malignas, así como otros tipos de cánceres. Con el fin de probar esta tesis, se compararon 198 pacientes con cáncer de Pancreato-biliar con 21 pacientes que tenían algunas anormalidades en el páncreas o las vías biliares, pero no hay rastro de malignidad (Tabla 1D). Asumimos que los miRNAs obtenidos en esta comparación debería haber representado marcadores de malignidad, particularmente en los órganos Pancreato-biliar. Treinta y nueve miRNAs mostraron significativamente diferentes expresiones (p & lt; 0,01) en estos dos grupos en la cohorte de formación, y de esos 39 miRNAs, 4 miRNAs fueron validados en la cohorte de prueba. Estos 4 miRNAs (miR-6826-5p, miR-6757-5p, MIR-MIR-3131 y 1343-3p) eran únicas y no se han identificado en nuestro análisis previo de cáncer pancreato-biliar en contraste con el control sano (Tabla S1 ). Sus mediana de los niveles de expresión en el grupo de cáncer pancreato-biliar y el grupo anormalidad no maligna se presentan en la Fig. 2A. El mejor marcador, miR-6826-5p, identificó correctamente no sólo el 77,3% cánceres Pancreato-biliares, pero también identificó 85,7% alteraciones no malignas como control negativo en la cohorte de prueba. En contraste, CEA y CA19-9 correctamente identificados 41,4% y 70,2% cánceres Pancreato-biliares, y 81,0% y 81,0% anormalidades no malignas, respectivamente, en toda la cohorte.
Las barras de error indican el error estándar . Los valores de p se Bonferroni-corregidos.
Además, con el fin de examinar órgano-especificidad de los marcadores séricos en miARN ambiente maligno, un total de 202 muestras de suero obtenidas de pacientes con cáncer de colon, estómago, esófago , fueron analizados y los cánceres de hígado (Tabla 1E), y se definen como otro control contra el cáncer pancreato-biliar. Este análisis comparativo seleccionado 193 miRNAs en la cohorte de formación, y entre ellos, 120 miRNAs fueron validados en la cohorte de prueba. Fuera de 120 miRNAs validados, 26 miRNAs se han identificado en el análisis previo de cáncer de pancreato-biliar con control sano (S1 Tabla), 4 miRNAs se han identificado en el análisis de cáncer de pancreato-biliar con anormalidades no malignas (Fig. 2A ), y el resto de los 90 miRNAs eran únicas. La expresión de miRNAs (4 miR-6880-5p, MIR-6075, MIR-4294, miR-187-5p) que fueron significativamente diferentes entre el cáncer pancreato-biliares y otros tipos de cáncer se presenta en la Fig. 2B. Estos cuatro miRNAs han sido también identificado en nuestro análisis previo de cáncer pancreato-biliar con controles sanos (Tabla S1), sugiriendo que son marcadores altamente específicos para el cáncer de pancreato-biliar. En términos de rendimiento diagnóstico, miR-6880-5p identificó correctamente no sólo el 66,7% del cáncer pancreato-biliares, sino también el 85,7% otros tipos de cáncer como control negativo en la cohorte de prueba. Por el contrario, CEA y CA 19-9 identificaron correctamente el 41,4% y el 70,2% cánceres Pancreato-biliares, como se ha dicho, y 82,0% y 84,4% otros tipos de cáncer en toda la cohorte.
El análisis comparativo en lo que va sugirió que los marcadores de genes miARN resultantes para los cánceres pancreato-biliares serían en gran medida afectado por las características clínicas de la población de control. Higo. La figura 3 muestra cómo se distribuyen los importantes niveles de los marcadores de genes miARN que se obtuvieron hasta ahora en función de los tipos de las poblaciones de control utilizados.
Los valores absolutos de los exponentes de los valores de p en un registro
10 se representaron escala; Por lo tanto, los miRNAs que se encontraban en el exterior aún son más estadísticamente significativa. Los diez miARN utilizados en los índices de diagnóstico fueron especificados.
Comparación de los cánceres Pancreato-biliar con todos los otros grupos clínicos como el control que incluyeron individuos sanos y pacientes con otros tipos de cáncer o alteraciones no malignas en los órganos pancreato-biliares
con el fin de obtener marcadores más robustos y universales que pudieran identificar a los pacientes con cáncer pancreato-biliar de la población clínicamente heterogénea, el supuesto control: individuo sano, los pacientes con alteraciones no malignas, y pacientes con otros tipos de cáncer, todos fueron combinadas, y se compararon con pacientes con cáncer pancrato-biliares por análisis discriminante. El análisis identificó 143 miRNAs que mostraron expresión diferencial en la cohorte de formación. Entre ellos, 98 miRNAs se validaron estadísticamente en la cohorte de prueba. Noventa y uno de los 98 miRNAs validados ya fueron identificados en los análisis previos de cáncer de pancreato-biliar, ya sea con controles sanos, con alteraciones no malignas, o con otros tipos de cáncer. Los 10 miRNAs que mostraron los valores de p corrección de Bonferroni más pequeños se enumeran en la Tabla 2. Todos los 10 marcadores fueron seleccionados previamente como marcadores para detectar el cáncer de páncreas y cáncer del tracto biliar en contra de los individuos sanos de control (S1 Tabla). El mejor marcador miARN para detectar cánceres Pancreato-biliar entre las otras condiciones clínicas era el miR-6075, que se ocupa el cuarto lugar entre los marcadores para detectar el cáncer de páncreas y XVII entre los marcadores para detectar el cáncer del tracto biliar (S1 Tabla) en contra de los controles sanos . miR-6075 mostró una sensibilidad, una especificidad y una precisión de 63,6%, 93,5% y 83,2%, respectivamente (Fig. 4A). De manera similar, el segundo-mejor marcador para la detección de cánceres Pancreato-biliares en contra de las otras condiciones clínicas era miR-4294, que fue clasificado séptimo entre los marcadores para detectar el cáncer de páncreas y cuarto entre los marcadores para detectar el cáncer del tracto biliar (S1 Tabla). Resultó que el miR-125a-3p, que era el mejor marcador para la detección de ambos tipos de cáncer de páncreas y del tracto biliar en contra de los controles sanos, también se comportó de manera similar para el colon, el estómago, el hígado y los cánceres de esófago (Fig. 4B), lo que resulta en una caída en su rango de quinta cuando los controles incluidos los pacientes con anormalidades no malignos y otros tipos de cáncer (S1 Tabla y Tabla 2). Este resultado indica que el miR-125a-3p no era un marcador que es específico de los cánceres Pancreato-biliares sino que era uno que sea eficaz para una amplia gama de tipos de cáncer.
Un diagnóstico índice de miARN que diferenciaba cánceres pancreato-biliar de todas las otras condiciones clínicas que incluyen controles sanos y pacientes con otros tipos de cáncer o alteraciones no malignas en los órganos pancreato-biliares
de acuerdo con los datos anteriores, una sola miARN suero logrado la detección de los cánceres de páncreas y del tracto biliar con & gt; 80% de precisión. El objetivo fue lograr un mayor rendimiento discriminante mediante la combinación de múltiples miRNAs significativos. El 10 miRNAs (MIR-6075, MIR-4294, miR-6880-5p, miR-6799-5p, miR-125a-3p, MIR-4530, miR-6836-3p, MIR-4634, miR-7114-5p, y miR-4476) que figuran en la Tabla 2 se seleccionaron como marcadores potenciales de la cohorte de la formación, y sus señales de expresión se utilizaron en el desarrollo de los índices de diagnóstico. El uso de análisis discriminante lineal de Fisher, todas las 1.023 combinaciones que incluían una cualquiera o más de los 10 miRNAs se calcularon y validados en la cohorte de prueba. Las combinaciones de genes miARN que mostró la mejor precisión con cada número de miRNAs usados (de 1 a 10) en este algoritmo se enumeran en la Tabla 3, y sus funciones discriminantes se proporcionan en la Tabla S2. Resultó que usando solamente la mejor miARN, MIR-6075, dio una precisión del 84,7% en la detección de cánceres Pancreato-biliares en la cohorte de prueba; Sin embargo, la precisión aumenta cuando el número de miRNAs utilizados en el algoritmo aumentó, y alcanzó un máximo de 91,6% cuando cuatro miRNAs, MIR-6075, miR-6799-5p, miR-125a-3p y miR-6836-3p, fueron usados. Esta combinación también dio una sensibilidad del 81,8% y una especificidad del 96,8%. La función discriminante compuesta por estos cuatro miRNAs es: 1,20 x MIR-6075 hasta 0,93 x miR-6799-5p-0.22 x miR-125a-3p + 0,71 x miR-6836-3p-8,55 (Tabla S2), y la discriminación resultante de cada uno de las muestras clínicas se muestra en la Fig. 5. El mismo nivel de precisión se mantuvo cuando el número de miRNAs utilizados en el algoritmo se aumentó hasta ocho, y luego comenzó a disminuir cuando los miRNAs en el noveno lugar (con una precisión del 90,0%) y el décimo se añadieron (con una precisión del 88,9%). Al lado de precisión obtenida por análisis discriminatorio lineal de Fisher, ROC análisis dio resultado ligeramente diferente (Tabla 3);