Extracto
Antecedentes
La metástasis es la causa principal de muerte relacionada con el cáncer y la orientación del proceso de la metástasis ha sido propuesto como una estrategia para combatir el cáncer. Por lo tanto, para desarrollar fármacos candidatos que se dirigen al proceso de la metástasis es muy importante. En los estudios preliminares, se encontró que schisandrin B (Sch B), un lignano dibenzocyclooctadiene de origen natural con una toxicidad muy baja, podría suprimir la metástasis del cáncer.
Metodología
se inocularon ratones
BALB /c por vía subcutánea o se inyecta a través de la vena caudal con cáncer de mama murino 4T1 células. Los ratones se dividieron en grupos Sch B tratados y de control. El crecimiento del tumor primario, invasión local, pulmón y metástasis óseas, y el tiempo de supervivencia fueron monitoreados. biopsias de tumores se examinaron inmuno histo-y patológicamente. Se ensayó la actividad inhibidora de Sch B en el TGF-β inducida por la transición epitelio-mesenquimal (EMT) de 4T1 y células de cáncer de mama humanas primarias.
Principales conclusiones
Sch B suprimió significativamente el pulmón espontánea y la metástasis ósea de células 4T1 sc inocula sin efecto significativo en el crecimiento del tumor primario y significativamente extendido el tiempo de supervivencia de estos ratones. Sch B no inhibió la metástasis de pulmón de células 4T1 que fueron inyectados a través de la vena de la cola. Retraso en el inicio del tratamiento con Sch B en ratones con tumores preexistentes no redujo la metástasis de pulmón. Estos resultados sugieren que Sch B actuó en la etapa de la invasión local. evidencias histopatológicas demostraron que los tumores primarios en el grupo B Sch fueron significativamente menos localmente invasivos que los tumores de control. Los ensayos in vitro demostraron que Sch B podría inhibir la EMT inducida por TGF-β de células 4T1 y células de cáncer de mama humanas primarias.
Conclusiones
Sch B suprime significativamente el pulmón y metástasis óseas de células 4T1 a través de la inhibición de la EMT, lo que sugiere su posible aplicación en la orientación del proceso de la metástasis del cáncer
Visto:. Liu Z, B Zhang, Liu K, Ding Z, Hu X (2012) Schisandrin B atenúa cáncer de invasión y metástasis través de la inhibición epitelio-mesenquimal transición. PLoS ONE 7 (7): e40480. doi: 10.1371 /journal.pone.0040480
Editor: Jonas Fuxe, Instituto Karolinska, Suecia |
Recibido: 30 Enero, 2012; Aceptado: June 8, 2012; Publicado: July 25, 2012
Derechos de Autor © 2012 Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo contó con el apoyo del proyecto nacional 863 (2007AA02Z143), proyectos de china Fundación de Ciencias Naturales (30772544, 81071802) y los Fondos de investigación fundamental para las Universidades central, Ministerio de Educación Nacional, china, a X. Hu. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de mama es la principal amenaza para las mujeres, con un estimado de 1,4 millones de nuevos casos y 458.000 muertes en todo el mundo en el año 2008 [1]. Durante las últimas dos décadas, integraciones de la cirugía, la quimioterapia, la radioterapia, la terapia hormonal de la menopausia, y las drogas anti-HER2 contribuyen considerablemente a la reducción de la mortalidad [2]. Sin embargo, a pesar de los avances significativos, la metástasis distante del cáncer de mama a los órganos viscerales y los huesos está siendo mal resuelto [1], [3], [4].
la metástasis del cáncer es un proceso de múltiples pasos que incluye locales invasión, intravasación a los sistemas linfáticos y sanguíneos, la supervivencia en el torrente sanguíneo, la extravasación de los microvasos y la colonización en un sitio secundario [5], [6]. Numerosos estudios han puesto de manifiesto la información sobre los mecanismos de cada paso de la metástasis del cáncer [7], [8]. El de varias etapas de la metástasis del cáncer y la comprensión de los mecanismos asociados ofrecen numerosas oportunidades para las intervenciones químicas [9].
5 × 10
se inocularon 4 4T1 células viables
sc Hoteles en la derecha segunda área almohadilla de grasa mamaria para establecer el modelo de forma espontánea metastásico. Sch B (100 mg /kg de peso corporal) o vehículo (0,5% paraxamer) se dosificó por vía intragástrica todos los días para un total de 7 dosis. Los ratones (n = 20 para cada grupo) se sacrificaron el día 30. (A) Las curvas de crecimiento de tumor primario (B) de ratón peso corporal. (C) el peso del tumor primario en el día sacrificado. (D) El número de nódulos metastásicos de pulmón visibles. (E) El índice de pulmón metastásico. *, P & lt; 0,05, **, P & lt; 0,01
Schisandrin B (Sch B) es el más abundante dibenzocyclooctadiene lignanos presentes en la hierba medicinal china tradicional
Schisandra chinensis gratis (.
Turcz.
)
Baill
. En los últimos años, Sch B se ha puesto de manifiesto que poseen múltiples funciones contra el cáncer. Nosotros y otros ya se ha informado de que Sch B era un inhibidor dual de la P-glicoproteína y proteína de resistencia a múltiples fármacos 1 (MRP1) [10], [11], [12], [13], [14], [15]. Sch B también podría potenciar la apoptosis inducida por la doxorrubicina en las células cancerosas, a través de la activación de la vía apoptótica mitocondrial, sin toxicidades mejoradas obvias hacia las células normales [16], mitigar cardiotoxicidad aguda y crónica inducida por la doxorrubicina [17], [18], atenuar cisplatino inducida por el estrés oxidativo, genotoxicidad y neurotoxicidad [19], e inhibir la actividad de la proteína quinasa ATR en respuesta al daño de ADN [20]. En un estudio piloto que tenía la intención de observar el efecto de Sch B en mejorar el efecto antitumoral de la doxorubicina en el cáncer de mama murino 4T1 células, nos dimos cuenta de que Sch B solo podría reducir significativamente la metástasis de pulmón espontánea de 4T1. Esta observación preliminar nos impulsó a llevar a cabo este estudio para investigar el efecto inhibidor de Sch B en 4T1 metástasis in vivo.
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se inocularon 4 4T1 células viables
Hoteles en sc la segunda área de la almohadilla de grasa mamaria derecha para establecer el modelo de forma espontánea metastásico. Los ratones se trataron con Sch B (100 mg /kg de peso corporal) o vehículo cada día para un total de 7 dosis. Los tumores primarios fueron resecados en día 10. Dos tercios de los ratones (n = 20 para cada grupo) se sacrificaron el día 30 y un tercio de los ratones (n = 10 para cada grupo) fueron para el experimento de supervivencia. (A) El número de metástasis visibles 4T1 pulmón. Índice metastásico (B) Pulmón calculado por H & amp; E tinción. el tiempo de supervivencia (C) de ratón. peso corporal (D) del ratón. (E) El peso del tumor resecado en día 10. *, P & lt; 0,05, **, P & lt;. 0.01
ratones (n = 8 para cada grupo) que recibe Sch B (100, 30, 10 mg /kg de peso corporal) o vehículo todos los días durante un total de 7 dosis, y los tumores primarios fueron resecados en la hora del día 10. (a) la supervivencia del ratón. peso corporal (B) del ratón. (C) El peso del tumor resecado el día 10. *, P & lt; 0,05, **, P & lt; 0,01, Sch B frente al grupo de control
Materiales y Métodos
Productos químicos y anticuerpos.
Sch B fue del Instituto Nacional para el control de Productos Farmacéuticos y biológicos (Pekín, China). factor de crecimiento tumoral-β1 recombinante humano (TGF-β) se adquirió de PeproTech Inc. (Rocky Hill, NJ). Epitelio-mesenquimal kit de toma de muestras de anticuerpos de transición (# 9782, incluyendo la E-cadherina, Snail, Slug & amp; ZEB1 anticuerpos) se adquirió de Señalización Celular Tecnología (Beverly, MA). anticuerpos vimentina (# 550513) y fibronectina (# 610078) eran productos de BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ). rodamina faloidina (# R415) fue comprado de Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA):
Las metástasis óseas de 4T1 en ratones demuestra en la Figura 2 se evaluaron usando H & amp;. E tinción como se describe en Materiales y Métodos. La incidencia de la metástasis ósea se refleja en la osteolisis visible. (A) de fotos representativas de las metástasis óseas. Osteolisis estuvo marcado por la flecha. (B) de fotos representativas de los huesos sin osteolisis. (C) La incidencia de metástasis ósea (n = 20) en comparación usando el análisis de Chi-cuadrado. *, P & lt;. 0.05, Sch B frente al grupo de control
Cell Cultura y
4T1 células eran de la Academia de Ciencias de China Banco de Células de Type Culture Collection (Shanghai, China) y cultivaron en monocapas en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 mg /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina. células MDA-MB-231 se adquirieron de American Tissue Culture Collection (No. HTB-26; ATCC, Manassas, VA) y se mantuvo en medio L-15 con 10% de FBS de Leibovitz, 100 mg /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina (todos de Invitrogen). Tanto las células se mantuvieron en un incubador humidificado a 37 ° C 5% de CO
2 atmósfera
(A) de la vena de la cola modelo de inyección:. Ratones (n = 10 para cada grupo) fueron alimentado a la fuerza con Sch B ( Las dosis diarias: 30 o 100 mg /kg de peso corporal o vehículo) durante 3 días antes de la inoculación de células 4T1. Después, cada ratón se inoculó con 2 × 10
5 4T1 células a través de inyección en vena de cola, seguido de tratamiento con Sch B (dosis diarias: alimentado a la fuerza con 30 o 100 mg /kg de peso corporal o vehículo) para los próximos consecutivos 7 días y se sacrificaron en el día (B) modelo de retraso en el tratamiento 18.. Los ratones (n = 10 para cada grupo) fueron inoculados con 5 × 10
4 células 4T1
s.c.
. en la segunda área de la almohadilla de grasa mamaria derecha, y los tumores primarios fueron resecados en el día 10. Sch B se le dio (100 mg /kg de peso corporal) o vehículo cada día desde el día 13-19 para un total de 7 dosis, y los ratones eran sacrificaron el día 30. La metástasis pulmonar fue marcado por nódulo metastásico macroscópico tal como se describe en Materiales y Métodos. *, P & lt; 0,05, Sch B frente al grupo de control
cultivo de células primarias
tumores de mama frescas fueron obtenidas de pacientes sometidos a cirugía con el consentimiento informado por escrito.. Las muestras fueron seleccionadas de carcinoma infiltrante de mama ductal sin quimioterapia para el cultivo celular como se describe por Speirs et al. [21]. Las células se cultivaron en HuMEC Ready Medio (Invitrogen) suplementado con 2% de FBS en una incubadora humidificada a 37 ° C 5% de CO
2 atmósfera.
Los ratones (n = 20 para cada grupo) fueron tratados con Sch B (100 mg /kg de peso corporal) o vehículo por vía intragástrica al día durante 7 días. (A) Los tumores primarios y los tejidos circundantes se resecó el día 15 de tinción hematoxilina-eosina (superior, × 40, inferior, × 100). (B) inmunotinción de E-cadherina y vimentina. (× 100).
Animales
hembra Balb /c y BALB /c nu /nu ratones (18-22 g) se obtuvieron de Shanghai SLAC animales de laboratorio Co, Ltd (Shanghai, china; certificado Animal: Nº SCXK [Hu] 2007 hasta 0005). Los animales fueron alojados en una jaula de polipropileno estándar que contiene la ropa de cama estéril bajo una condición controlada de temperatura (23 ± 2 ° C), humedad (50 ± 5%), y la luz (10 y 14 h de luz y oscuridad) en la Universidad de Zhejiang Animales de Laboratorio centro (núm SYXK [Zhe] 2007-0029).
4T1 Singenéico modelo de xenoinjerto
el modelo animal se basa en el informe anterior [22]. Cada ratón se inoculó con 5 × 10
4 4T1 células viables
s.c.
. en la segunda área de la almohadilla de grasa mamaria derecha. Los ratones fueron asignados aleatoriamente a B o control de grupo Sch el día siguiente después de la inoculación. Cada ratón fue alimentado a la fuerza, ya sea con Sch B (100, 30, o 10 mg /kg de peso corporal) o vehículo (0,5% paraxamer, Sigma) cada día durante un total de 7 dosis. Para investigar el efecto de Sch B en la metástasis 4T1, utilizamos 3 protocolos. En primer lugar, los ratones fueron gavaged con Sch B (100 mg /kg de peso corporal), y los tumores crecieron de forma ininterrumpida. En segundo lugar, los ratones se dosificaron con Sch B (100 mg /kg de peso corporal) y a continuación, los tumores primarios se resecaron en día 10 como se describe anteriormente [23]. En tercer lugar, los ratones se administraron con tres dosis de Sch B (100, 30, o 10 mg /kg de peso corporal) y los tumores primarios se extirparon el día 10. El volumen del tumor se midió mediante calibradores vernier dos veces o tres veces por semana y calculado por una elipse fórmula del volumen V = (L x W
2) × 0,5, donde L es la longitud y W es la anchura. Las metástasis pulmonares fueron anotados por contar los nódulos metastásicos macroscópicos sobre la base de los informes anteriores [24], [25], y se determinó el número medio de metástasis pulmonares por ratón como un indicador de diseminaciones generales del cáncer [23], [26].
Las células se trataron con Sch B (5 g /ml) y TGF-β (5 ng /ml) como se describe en Materiales y Métodos. (A) fotos representativos de TGF-β indujo cambios morfológicos de células 4T1 con o sin tratamiento previo de Sch B. (B) de la fluorescencia celular inmunotinción de E-cadherina, vimentina, fibronectina, y F-actina. (C) de Western Blot de E-cadherina, vimentina, caracoles, babosas, ZEB1, con β-actina como control interno. (D) y (E), inducida por TGF-β migración y la invasión de células 4T1 con o sin tratamiento previo de Sch B. (F) fotos representativos de inducida por TGF el cambio morfológico de las células de cáncer de mama primario con o sin tratamiento previo de Sch B y el Western Blot de e-cadherina y vimentina de las células de cáncer de mama primario de tres pacientes individuales.
Retraso Modelo de Tratamiento
Los tumores primarios fueron resecados en el día 10, y Sch B (100 mg /kg de peso corporal) o el vehículo se gavaged en el día 13-19. Todos los animales se sacrificaron el día 30 para la recogida de datos.
vena de la cola de inyección Modelo
Este modelo in vivo se basa en el informe anterior [27]. Antes de la inoculación con células 4T1, cada ratón fue alimentado a la fuerza con Sch B (30, 100 mg /kg) o vehículo (0,5% paraxamer) durante 3 días consecutivos. a continuación, cada ratón se inoculó con 2 × 10
5 células por vía intravenosa mediante inyección en vena de cola, seguido de Sch B o tratamiento con vehículo durante los siguientes 7 días consecutivos. Todos los ratones fueron sacrificados el día 18.
MDA-MB-231 in vivo Modelo Animal
Cada ratón se inoculó con 5 × 10
6 MDA-MB-231 células
sc
. en la segunda área de la almohadilla de grasa mamaria derecha. Los ratones fueron asignados aleatoriamente a B o control de grupo Sch el día siguiente después de la inoculación. Cada ratón fue alimentado a la fuerza, ya sea con Sch B (100 mg /kg de peso corporal) o vehículo (0,5% paraxamer, Sigma) durante los siguientes 7 días consecutivos, con un total de 7 dosis. Los ratones fueron sacrificados en el día 30 después de la inoculación
Criterio para evaluar el ratón moribundo Estado
Un ratón moribundo se define como uno que exhibe más de uno de los siguientes seis signos clínicos:. Incapacidad para comer o beber; letargo grave (renuencia a moverse cuando se pinchó suavemente con fórceps); equilibrio grave o trastorno de la marcha, de acuerdo con el criterio del NIH [28].
Los análisis histológicos
El tejido tumoral era fijo, incrustado y cortados en 5 micras de grosor. Las secciones en parafina se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & amp; E) (Sigma). Para la inmunohistoquímica, la inmunotinción de E-cadherina y vimentina se llevó a cabo usando un protocolo estándar [29]. Los H & amp; E secciones fueron evaluados y se fotografiaron con un microscopio Nikon Eclipse 50i controlado por el software de NIS-Elements (versión 3.22). El área relativa de las metástasis se midió usando el software ImageJ 1.45S (NIH) [30]. Las metástasis pulmonares se cuantificó contando el área total del tejido por sección pulmón (D1) y la metástasis presente en la misma zona (D2). El índice metastásico se calculó por la relación D2 /D1 [31]. Para la metástasis ósea, huesos de la pierna (fémures y tibias) fueron fijadas en 10% formalina tamponada neutra, descalcificadas en HCl 1% durante 24 horas, y embebidos en parafina. Las secciones fueron teñidas con H & amp; E y se examinaron microscópicamente. La incidencia de la metástasis ósea se refleja en la osteolisis visible [32].
toxicidad celular de Sch B en células 4T1
2 × 10
3 células fueron sembradas por pocillo en 96 y placas. se añadió Sch B (5, 10, 20, 40, 80, 160 mg /ml) y se cultivaron durante 60 horas, la viabilidad celular se estimó por exclusión con azul de tripano. Seis pozos fueron medidos para cada concentración. la concentración inhibitoria media (IC
50) se determinó.
Efecto de Sch B en el TGF-β EMT inducida
El murino 4T1 células y las células de cáncer de mama primarios humanos fueron pretratados con Sch B (5 mg /ml) durante 24 horas, después se añadió TGF-β (5 ng /ml) y se cultivaron durante otras 36 horas. Los lisados celulares se utilizaron en el análisis de transferencia Western como se describe anteriormente [33]. inmunotinción de fluorescencia se realizó de acuerdo con nuestro método reportado anterior [34].
La migración celular y la invasión ensayos
Para los ensayos de migración, 2 × 10
5 células se sembraron en placas de seis pocillos . Después del pretratamiento de Sch B (5 g /ml) durante 24 horas, la concentración de FBS del medio de cultivo se cambió a 2% y una herida es una incisión como se describe anteriormente [35]. Después, se añadió TGF-β (5 ng /ml) y se cultivaron durante otras 24 horas, las fotografías fueron tomadas por microscopía de contraste de fase. Transwell (Corning Costar, Cambridge, MA) con un filtro revestido con Matrigel (BD Biosciences) se utilizó para ensayos de invasión. 4 × 10
3 células en suero libre de RPMI-1640 se sembraron en el pozo 24 transwell cámara superior, las cámaras inferiores se rellenaron con medio RPMI-1640 suplementado con 10% de FBS como un quimioatrayente. Después de 12 horas de tratamiento previo de Sch B (5 g /ml), tanto en la cámara superior y la cámara inferior, se añadió TGF-β (5 ng /ml) y se trató durante otras 12 horas. Al final de los ensayos, el lado del filtro de la cámara superior se limpió con un hisopo de algodón y el filtro se tiñeron durante una hora con cristal violeta (Sigma) en 2% de etanol y luego se enjuaga en agua. A continuación, las células en el filtro se contaron al menos 10 campos bajo el punto de vista de un microscopio de contraste de fase.
Análisis estadístico
Los datos se expresan como la media ± desviación estándar. supervivencia de los ratones se evaluó mediante el análisis de Kaplan-Meier y la prueba de log-rank. Se utilizó el análisis de chi-cuadrado para la comparación de las metástasis óseas. pruebas t de Student se utilizaron para la comparación entre los dos valores medios. Los valores de p inferior a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.
Declaración de Ética
El estudio en animales fue aprobado por el comité de ética de los animales institucional de la Universidad de Zhejiang, con la aprobación Nº zju-2009-1-01- 028. Los tumores humanos se obtuvieron con consentimiento informado por escrito de los pacientes y siguiendo un protocolo aprobado por el Comité de Ética del Segundo Hospital Afiliado de la Universidad de Zhejiang.
Resultados
Sch B reduce significativamente 4T1 metástasis de pulmón sin inhibición de tumor primario
4T1 modelo de xenoinjerto singénico es un ampliamente utilizado para estudiar la metástasis espontánea del cáncer [36]. El sitio de metástasis importante de este modelo es de pulmón [22]. Usando este modelo, se encontró que Sch B reduce significativamente 4T1 metástasis de pulmón pero sin inhibición significativa en los tumores primarios (Fig. 1).
Sch B aumenta de forma significativa de supervivencia de los ratones 4T1 través de la inhibición de pulmón Metástasis
Para excluir el efecto del tumor primario en el tiempo de supervivencia de ratones, que elimina el tumor primario mediante la resección quirúrgica en el día 10 después de la inoculación 4T1. Luego, dos experimentos con diferentes propósitos se realizaron en estos ratones. Experimento 1 fue observar la metástasis de pulmón. Los ratones se sacrificaron el día 30 después de la inoculación y la metástasis pulmonar fue examinada. Los resultados mostraron que Sch B inhibió significativamente 4T1 metástasis de pulmón (Figura 2 A & amp;. B & amp; Fig. S1). Experimento 2 fue observar el tiempo de supervivencia. Higo. 2C demostró que los ratones que recibieron Sch B vivieron significativamente más largo que el control y este efecto fue dependiente de la dosis (Fig. 3A). Las curvas de crecimiento de los ratones y el peso de los tumores fueron comparables entre Sch B y el grupo control (Fig 2D & amp;.. E, Fig 3B & amp; C).
Se observa que 10% de los ratones que recibieron Sch B (100 mg /kg de peso corporal, la figura 2C & amp;. 3A) sobrevivió durante 3 meses, después de lo cual se dio por terminado el experimento. Este fenómeno se observó en tres experimentos independientes. Estos ratones fueron ejecutados y se examinaron patológicamente. No hubo metástasis pulmonares visibles en estos ratones (datos no presentados). Se ha demostrado por Pulaski y Demaria [37], [38] que la metástasis de 4T1 tumor singénico podría ocurrir en etapa muy temprana (por ejemplo, dentro de la primera semana después de la inoculación sc), y nuestro estudio sugiere que Sch B podría interferir con principios metástasis. Consistentemente, demostramos que Sch B podría atenuar 4T1 invasión local in vivo e in vitro inhibir la EMT (ver más abajo). Los resultados sugieren que la cirugía temprana (por ejemplo, cirugía que se realiza dentro de los 10 días después de la inoculación) en combinación con el tratamiento Sch B puede bloquear completamente la metástasis in vivo de células 4T1.
Sch B Atenúa 4T1 metástasis a hueso
El modelo de ratón 4T1 se utiliza comúnmente como un modelo de metástasis de cáncer de mama al hueso [32], [39]. La inhibición de la metástasis de tumor de mama en el pulmón puede desviar las células tumorales a la metástasis a los órganos alternativos tales como hueso [32]. Con el fin de descartar esta posibilidad, se investigó si Sch B desviaría 4T1 a la metástasis ósea. Nuestros datos demostraron que Sch B redujo significativamente 4T1 metástasis al hueso (Figura 4), como se refleja por la severidad de la osteólisis.
Sch B inhibe la invasión de local de células 4T1
Aunque los resultados anteriores indicaban que Sch B podría inhibir 4T1 de pulmón y las metástasis de hueso, no se sabía cómo Sch B interfirió con 4T1 metástasis. Desde la metástasis del cáncer es un proceso complejo que implica la invasión local, intravasación, la supervivencia en el torrente sanguíneo, la extravasación y la colonización en un sitio secundario, sería importante identificar en qué etapa Sch B interfiere con 4T1 metástasis. Pensamos que el modelo a través de la inyección en la vena caudal de las células cancerosas puede ayudar a saber si Sch B perturba la metástasis en el paso de la invasión local o no. Si Sch B no inhibe la metástasis de pulmón de células 4T1 inyectados a través de la vena de la cola, se debe interferir con 4T1 metástasis en el momento del paso de la invasión local. Los resultados mostraron que Sch B no tuvo efectos inhibitorios significativos en la metástasis de pulmón de células 4T1 mediante inyección en vena de cola (Fig. 5A)
.
Con el fin de confirmar aún si Sch B afecta 4T1 metástasis en el momento del paso de la primera etapa , se realizó un experimento de tratamiento retrasado con Sch B en ratones con tumores preexistentes. Los resultados mostraron que el tratamiento retrasado con Sch B no tuvo un efecto significativo en la metástasis 4T1 (Fig. 5B).
A partir de los resultados anteriores, se realizó el examen histopatológico. Como se muestra en la figura 6A, las células tumorales habían invadido profundamente en los músculos de la mayor parte de los tumores primarios en el grupo control (13 de 20), mientras que en el grupo B Sch, la mayoría de los tumores mostraron una clara línea divisoria entre la región de las células tumorales y músculos (14 sobre 20). Además, las células en el margen del tumor en el grupo control fueron en forma de huso, más como células mesenquimales, mientras que en el grupo B Sch, las células tumorales mantienen la morfología "de adoquines", más como células epiteliales. Estas observaciones sugieren que Sch B podría inhibir la transición epitelial mesynchymal (EMT).
Además de los cambios morfológicos, EMT también se acompaña de cambios expresivos de algunos biomarcadores, tales como E-cadherina, vimentina, etc [6], [ ,,,0],40], [41]. Cuando las células están bajo esta transición, E-cadherina se downregulated y upregulated vimentina. Se examinó la expresión de E-cadherina y vimentina en los tumores. Figura 6B mostró células tumorales en el grupo Sch B tenían una mayor expresión de cadherina E (un biomarcador epitelial) pero menor expresión de vimentina (un biomarcador mesenquimal) que los de control, lo que sugiere que Sch B inhibe la metástasis 4T1 probablemente a través de la orientación EMT.
además de 4T1 modelo, también se investigó el efecto de Sch B sobre la metástasis in vivo de la línea celular de cáncer de mama humano MDA-MB-231 (Fig. S2). 30 días después de la inoculación, se sacrificaron los ratones. Se encontró que no había ni nódulos metastásicos de pulmón ni macroscópicos en la metástasis ósea en ratones control y Sch B tratados. Los informes sobre la capacidad metastásica de esta línea celular de diferentes laboratorios parece mixta: mientras que varios grupos informaron de una pobre capacidad metastásica de esta célula [42], [43], [44], otros [45], a través de la selección vigorosa, adquirido varios subclones (hueso de búsqueda de MDA-231BO y el cerebro en busca de MDA-231BR) con alta capacidad metastásica. Sin embargo, a pesar de no hay metástasis obvio, nos dimos cuenta de que, de forma similar a las células 4T1, MDA-MB-231 células invadieron más profundamente en los músculos en la mayoría de los tumores primarios en el control que en el grupo tratado Sch B.
B Sch inhibido TGF-β EMT inducida del 4T1 y células cancerosas de mama humanos primarios
in vitro
TGF-β es un inductor de EMT fuerte que puede agravar la migración de células tumorales & amp; invasión
in vitro
[46]. En el ensayo de inhibición de EMT, 5 mg /ml Sch B, una concentración muy por debajo de su IC
50 hacia 4T1 células (Fig. S3), se utilizó.
células 4T1 se hicieron en forma de huso o mesenchymal- como después del tratamiento de TGF-β, acompañado de una disminución de la expresión de e-cadherina y expresiones de vimentina /barra //ZEB1 aumentado. Este efecto fue atenuada significativamente por el pretratamiento de las células con Sch B (Fig. 7A, 7B, 7C).
Consistentemente, en el ensayo de curación de heridas, el TGF-β se incrementó la tasa de migración de células 4T1 por cerca de dos pliegues más que la de control, que fue también inhibida por el pretratamiento de las células con Sch B (Fig. 7D, la Fig. S4A). Del mismo modo, la capacidad de invasión de las células 4T1 mejoradas por el TGF-β fue significativamente atenuada por Sch B (Fig. 7E, Fig. S4B), que es la única afectada ni la migración celular, ni la invasión.
Sch B también inhibe el efecto TGF-β de las células de cáncer de mama humanas primarias (Fig. 7F).
Discusión
Como el cáncer de la mortalidad relacionada es causada en gran medida por la metástasis del cáncer, para reducir la metástasis es una importante estrategia para el combate cáncer. Se propone por un grupo de científicos conocidos que "dado el hecho de que los tumores primarios menudo se pueden controlar con terapias convencionales, podrían agentes que actúan específicamente sobre el proceso de metástasis ser más probable que aumente la supervivencia del paciente a largo plazo" [47] . En este estudio, hemos demostrado (1) Sch B atenúa significativamente la metástasis 4T1 extendiendo así el tiempo de supervivencia de los ratones; (2) B Sch atenúa la metástasis 4T1 en la etapa de la invasión local; y (3) Sch B inhibe EMT de células 4T1, así como células de cáncer de mama humanos primarios. Llegamos a la conclusión de que Sch B puede atenuar la metástasis de células 4T1 a través de la inhibición de la EMT.
Otro posible mecanismo para Sch B para inhibir la metástasis podría ser su efecto citotóxico sobre las células 4T1. Esto parece poco probable. Los estudios en animales mostraron que Sch B no afectó significativamente el crecimiento de tumores 4T1 primarios (Fig. 1, 2, 3), lo que sugiere ningún efecto citotóxico. Esto es en general agradable con los informes anteriores de que este compuesto tiene una baja citotoxicidad hacia las células de cáncer en comparación con los fármacos anticancerígenos clínicos [17], [48], [49]. Para apoyar aún más que la citotoxicidad no jugó un papel importante en la atenuación de la metástasis de células 4T1, incluimos doxorubicina (Dox), un medicamento contra el cáncer altamente citotóxicos, en nuestro diseño experimental. Aunque la citotoxicidad de Dox hacia 4T1 es tres órdenes de magnitud más fuerte que la de Sch B (datos no mostrados), metástasis de pulmón 4T1 fueron significativamente menor en el grupo Sch B que en el grupo Dox o control, pero sin diferencia significativa entre los dos últimos grupos (Fig. S5A). Colectivamente, Sch B inhibir la metástasis 4T1 es poco probable a través de sus efectos citotóxicos.
Mientras se extiende la vida de los pacientes con cáncer es la primera prioridad en la quimioterapia, la calidad de vida de los pacientes con cáncer es también muy importante. Muchos medicamentos contra el cáncer clínicos tienen efectos secundarios graves, tales como neurotoxicidad, reacción gastrointestinal, la inhibición de la médula ósea, pérdida de cabello, etc., que reducen sustancialmente la calidad de vida de pacientes con cáncer. Por lo tanto, el alivio del dolor se reconoce cada vez más en la quimioterapia del cáncer. En este sentido, el desarrollo de fármacos que tienen muy baja toxicidad sistemática para el cuerpo humano sería más ideal. La seguridad de Sch B ha sido bien documentado. Los informes anteriores de otros laboratorios indican que en sus protocolos utilizando Sch B para proteger la hepatotoxicidad tetracloruro inducida de carbono en ratones, la dosis de Sch B es 3 mmol /kg (1,2 g /kg), lo que implica el pozo de tolerancia de este compuesto [ ,,,0],50]. Los datos toxicológicos como revisados por Hanke
et al.
Reveló la alta seguridad de este compuesto [51]. Además, hay una cantidad suficiente de pruebas que demuestran que este compuesto es seguro para la salud humana. Sch B es el derivado dibenzocyclooctadiene más abundante en
S. chinensis gratis (Turcz.) Baill, una hierba medicinal china tradicional. Esta hierba se ha utilizado como medicina desde hace varios miles de años y todavía está siendo practicado activamente en China, Corea del Sur y Japón, sin efectos secundarios graves jamás reportados.
Además de su inhibición de las células del cáncer metástasis, Sch B combinado con otros medicamentos contra el cáncer puede traer otros beneficios potenciales. Se ha informado de que algunos agentes anticancerígenos pueden mejorar la metástasis a través de la activación de la invasividad y metástasis de las células cancerosas. Para ejemplos, la inhibición de la angiogénesis reducirá el crecimiento del tumor primario y la densidad de los microvasos, pero se aceleró la invasión tumoral y la metástasis [52], [53]; ciclofosfamida y la Hsp90 inhibidor de 17-AAG inhibe tumores primarios pero promueve la invasión tumoral y la metástasis [54], [55]; doxorrubicina promueve la metástasis ósea de células 4T1 de cáncer de mama [32]. Nuestra idea es que la combinación de Sch B con estos agentes podrían traer beneficios para controlar tanto del tumor primario y la metástasis.
Apoyo a la Información
Figura S1.
Efectos de Sch B en metástasis de pulmón de células 4T1. Pulmón metástasis de 4T1 en ratones demuestra en la Figura 2 se evaluaron usando H & amp; E de tinción como se describe en Materiales y Métodos. Los ratones (n = 20 para cada grupo) se sacrificaron el día 30 y la metástasis se cuantificó con H & amp; E tinción contando el área total del tejido por sección de pulmón y metástasis presente en la misma zona. (A) Las fotografías representativas de los nódulos pulmonares visibles en la superficie. (B) H & amp; E tinción de las metástasis pulmonares. Bajo el microscopio, que no fueron capaces de tomar una imagen completa con una sola foto, por lo que tomamos varias fotos que luego se combinaron
doi:. 10.1371 /journal.pone.0040480.s001 gratis (TIF)
Figura S2.
Efectos de Sch B en modelo animal MDA-MB-231. 5 × 10
6 células viables MDA-MB-231 se inocularon por vía subcutánea en la segunda área de la almohadilla de grasa mamaria derecha. Los ratones fueron gavaged con Sch B (100 mg /kg de peso corporal) todos los días durante un total de 7 dosis. Los ratones se sacrificaron el día 30 después de la inoculación. Los tumores primarios, los huesos y los tejidos circundantes se examinaron patológicamente usando H & amp; E. (A) Las fotografías representativas de frente invasivo, en el que las células tumorales invadieron en el músculo circundante en el grupo control, mientras que la invasión fue atenuado en el grupo tratado Sch B. curvas (B) Crecimiento del tumor primario. (C) las curvas de peso corporal. (D) El peso del tumor en el día del sacrificio. (E) fotos representativas de los pulmones que no tienen nódulos metastásicos visibles. huesos (F) en la pierna (fémur y tibia) fueron fijadas en 10% formalina tamponada neutra, descalcificación en HCl al 1% durante 24 horas y se incluyeron en parafina. Las secciones fueron teñidas con H & amp; E, que no muestra la metástasis observables
doi: 10.1371 /journal.pone.0040480.s002 gratis (TIF)
Figura S3.. Francia El citotoxicidad de Sch B hacia células 4T1. 2 × 10
3 Las células se sembraron por pocillo en placas de 96 pocillos. Se añadió Sch B (5, 10, 20, 40, 80, 160 mg /ml) y las células se cultivaron durante 60 horas. La viabilidad celular se estimó por el ensayo de exclusión de azul de tripano.