Extracto
Los microARN (miRNA) juegan un papel importante en el desarrollo del cáncer. Por clonación y secuenciación de un HPV16
+ CaSki pequeña biblioteca de ARN celular, se aisló 174 miRNAs (incluyendo la novela de miR-193c) que podrían ser agrupados en 46 especies diferentes, con miARN miR-21, miR-24, miR 27a y miR-205 es más abundante. Hemos elegido para un estudio más 10 miRNAs en función de su frecuencia de clonación y sus niveles asociados en 10 cáncer- cervical o líneas celulares derivadas de neoplasia intraepitelial cervical. No se observó correlación entre su expresión con la presencia o ausencia de un genoma de HPV integrado o episomal. Todas las líneas celulares examinadas no contenían detectable de miR-143 y miR-145. líneas de células infectadas por el VPH expresan un conjunto diferente de miRNAs cuando se cultiva en balsa organotípicos se cultivaron en comparación con el cultivo de células en monocapa, incluyendo la expresión de miR-143 y miR-145. Esto sugiere una correlación entre la expresión de los genes miARN y la diferenciación de tejidos. El uso conjunto de los genes miARN análisis de cuello uterino normal de la misma edad y tejidos de cáncer de cuello uterino, en combinación con la verificación de transferencia de Northern, hemos identificado miRNAs desregulados significativamente en tejidos de cáncer de cuello uterino, con el miR-126, miR-143, y la regulación a la baja de miR-145 y miR-15b , miR-16, miR-146a, y la regulación al alza de miR-155. Los estudios funcionales mostraron que tanto el miR-143 y miR-145 son supresora de crecimiento celular. Cuando se introduce en líneas celulares, se encontró que el miR-146a para promover la proliferación celular. En conjunto, nuestros datos indican que la regulación a la baja de miR-143 y miR-145 y miR-regulación al alza de 146a jugar un papel en la carcinogénesis cervical
Visto:. Wang X, Tang S, Le SY, Lu R, Rader JS , Meyers C, et al. (2008) la expresión aberrante de oncogénico y microARNs el tumor supresor de cáncer de cuello se requiere para el crecimiento de células cancerígenas. PLoS ONE 3 (7): e2557. doi: 10.1371 /journal.pone.0002557
Editor: Dong-Jin Yan, Universidad de Hong Kong, China
Recibido: Abril 10, 2008; Aceptado 13 de mayo de 2008; Publicado: 2 Julio 2008
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Financiación:. Esta investigación fue apoyada por el Programa de investigación Intramural del NIH, Instituto Nacional del cáncer, Centro de investigación del cáncer y por subvenciones del NIH CA 94141 y CA 95713to JSR y CA 79006 al CM
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El cáncer cervical es uno de los cánceres más comunes en las mujeres en todo el mundo, con una incidencia global estimada de 470.000 nuevos casos y aproximadamente 233.000 muertes por año [1], [2]. El cáncer cervical es la causa principal de muerte por cáncer en muchos países de bajos recursos, donde la revisión generalizada por citología cervical no está disponible. La incidencia es menor en los países desarrollados como consecuencia de la detección cervical y de programas de educación sanitaria activos en curso. tasas de cáncer cervical en los Estados Unidos se estimaron en 10.370 nuevos casos y 3.710 muertes en 2006 [3]. La relación causal entre el VPH de alto riesgo de infección (HR-HPV) y el cáncer cervical ha sido bien documentado en estudios epidemiológicos y funcionales. Los VPH de alto riesgo, tales como HPV16, HPV18, HPV31 y se han detectado hasta en el 99,7% de los carcinomas de células escamosas del cuello uterino y el 94% -100% de los adenocarcinomas de cuello uterino y adenoescamosos [4], [5]. Las oncoproteínas del VPH de alto riesgo, E6 y E7, contribuyen a la carcinogénesis cervical mediante la inactivación celular del tumor supresor de proteínas p53 y pRb, respectivamente [6] - [8].
miRNAs se regulatorio, los ARN no codificante acerca 21-23 nucleótidos de longitud y se expresan en etapas específicas de desarrollo de los tejidos o la diferenciación celular, y tienen efectos a gran escala sobre la expresión de una variedad de genes a nivel post-transcripcional. A través de apareamiento de bases con sus mRNAs específicos, un miARN induce la degradación del ARN o la supresión de la traducción de las transcripciones específicas [9], [10]. miRNAs celulares son transcritos por la ARN polimerasa II transcripciones tan largas, cubiertas, primaria poliadenilado miARN (pri-miARN) que llevan una estructura de horquilla tallo-bucle de ~ 80-n id [11]. miRNAs maduros como resultado de la transformación de pri-miRNAs en dos etapas secuenciales de escisión mediada por dos enzimas RNasa III, Drosha y Dicer [12]. Drosha, en complejo con DGCR8, escinde el pri-miARN en una distancia especificada (aproximadamente 11 pb) a partir de la unión de ARN tallo de una sola cadena en el núcleo para dar un pre-miARN de una horquilla ~ 60-nt con un 2-nt saliente 3 '[13], [14]. Después de la pre-miARN se exporta al citoplasma por exportin 5 [15], [16], entonces se reconoce por Dicer, en complejo con dsRBD que contiene acompañante de la proteína del VIH-1 TIE ARN vinculante (PTRL) [17], para eliminar el bucle terminal, dejando una segunda 2-nt 3 'pendiente [18]. Los 21- y 23-nt miARN productos resultantes contienen voladizo a 2 nt 3 'en cada hebra y actuar como los intermedios funcionales de ARNi que la escisión de ARNm y la traducción de atenuación. Aunque sus funciones biológicas siguen siendo en gran parte desconocido, estudios recientes sugieren que los miRNAs contribuyen al desarrollo de diversos tipos de cáncer [19] y podría funcionar como un componente importante de las defensas naturales de las células contra la infección viral [20] - [22]. Se ha propuesto que un perfil de expresión de los genes miARN único para un cáncer particular sería un biomarcador útil para el diagnóstico del cáncer [23] y el pronóstico [24]. En este estudio, hemos utilizado diversos enfoques para el perfil de expresión de miRNA de tejidos de cáncer de cuello uterino y las líneas celulares de cáncer de cuello uterino derivados, así como de los queratinocitos vaginales infectadas por el VPH. Se demuestra que un subconjunto de miRNAs se desregula significativamente en los cánceres cervicales y lesiones pre-neoplásicas.
Resultados
miARN perfil de expresión en líneas celulares de cáncer de cuello uterino
Para investigar la expresión perfiles de miRNAs en células de cáncer cervical, aislamos ARN total de células a partir de células CaSki C-2 derivados del cáncer de cuello uterino, que contienen $ $ 500 copias del genoma HPV16 por célula. Los ARN fraccionados con tamaños de 15-30 nts fueron clonados y secuenciados en base a un protocolo publicado [25]. En general, hemos clonado un total de 174 miRNAs de 363 clones de cDNA que se clasificaron en 46 especies diferentes miARN (Tabla 1), con el miR-21, miR-24, miR-27a y miR-205 es más abundante. No HPV16 derivado de miARN se clonó en esta prueba de detección, todos los miRNAs eran celular. Curiosamente, encontramos que algunas copias del clonado de miR-21 y miR-205 tenía heterogéneo 3 ', con un nucleótido adicional C en el extremo 3' del 68% de los miR-21 copias y un T extra en el 3 ' final de 33% de las copias miR-205, presumiblemente derivados de la digestión de oscilación de la pre-miRNAs por Dicer (Fig. 1). Además, una nueva subespecie de miR-193, miR-193c (número de acceso al GenBank: EF100863), se identificaron tres veces a partir de la proyección y se verificó mediante transferencia northern. La subespecie de miR-193C se diferencia de miR-193b en un nucleótido en la posición nt 21 y por la falta de tres a nosotros 'final (miR-193b, 5'-aacuggcccucaaagucccgcuuu-3' 3; miR-193c, 5'-aacuggcccucaaagucccga -3 '). El perfil de expresión del miR-193c recién identificado que es 3-nt más pequeño que miR-193b fue similar a la de miR-21 en células HeLa y células 293, pero menos abundante que el miR-27a. HeLa y células 293 no produjeron detectable miR-205 como un doblete como se ve en las células CaSki (Fig. 2A).
Las flechas por encima de la pre-miARN indican los sitios de digestión de oscilación en la pre-miR-21 en una y pre-miR-205 en B, la producción de productos con nucleótidos adicionales en el extremo 3 '. Las secuencias mostradas en rojo corresponden a madurar miARN mientras que se muestra en negro es la porción de pre-miARN que se elimina durante el procesamiento.
A. la expresión de miR-193c en CaSki, HeLa y 293 células. CaSki y sus subclones C-V y C-2 células [72] se compararon con células HeLa (HPV18
+) y 293 (VPH
-) para la expresión de miR-193c mediante transferencia northern. El ARN total (30 g) a partir de CaSki, HeLa, y células 293 se separó en un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 15%, se transfirieron a una membrana de Gene Screen-Plus, y luego probaron por separado con un sentido (s) o un antisentido (AS) de miR -193c sonda. Posteriormente, la membrana se volvió a sondear con sondas antisentido para el miR-21, miR-27a, miR-205, o U6, respectivamente. B. Expresión de los genes miARN en líneas celulares de cáncer de cuello uterino derivados. ARN celular total (30 g) se extrajo a partir de diversas líneas de células con o sin infección por VPH. transferencia de Northern se utilizó para examinar la expresión de 10 miRNAs de ocho líneas celulares de cáncer, dos W12 subclones de células, las células HaCaT, cuello uterino normal y tejidos de cáncer de cuello uterino (Ambion). C. regulación a la baja de miR-143 en tejidos de cáncer de cuello uterino. Total de ARN a partir de dos pares de (NT) cuello uterino normal vs tejidos de cáncer cervical (CA) a partir de muestras clínicas y un par de cuello uterino normal y cáncer de cuello uterino adquirido de Ambion se compararon para la expresión de miR-143 por transferencia de Northern. U6 también se transfirió como un control interno para la carga de la muestra en el panel A, B, y C.
Sobre la base de estos resultados de clonación, que exhibió más varias líneas celulares de cáncer de cuello uterino disponibles con o sin la infección por VPH mediante transferencia northern para la expresión de miRNAs 8 con una frecuencia relativamente alta clonación y 2 miRNAs (miR-143 y miR-145), que no fueron aislados en nuestro clonación (Tabla 1). Ocho líneas celulares de cáncer de cuello uterino; dos aislados de la línea celular W12 (20861 con genomas HPV16 integrados y 20863 con genomas episomal HPV16) originalmente aisladas de una neoplasia intraepitelial cervical (CIN) tejidos de biopsia [26] y las células HaCaT (una línea de queratinocitos de la piel contra el VPH-negativas inmortalizado) [27 ] se examinaron para la expresión de los 10 miRNAs. También se comparó un ARN totales emparejados por cáncer de cuello uterino y tejidos cervicales normales adyacentes obtenidos comercialmente de Ambion. Todas las líneas celulares y tejidos de cáncer de cuello uterino mostraron un perfil de expresión de los genes miARN similar. Este perfil miARN se diferenció de los tejidos normales del cuello uterino con una expresión reducida de miR-27a, miR-143 y miR-145 (Fig. 2B). En contraste, el tejido de cáncer de cuello uterino y las líneas celulares, excepto SiHa (HPV16
+), HeLa (HPV18
+) y células C33A (HPV
-), había aumentado la expresión de miR-205 cuando en comparación con el tejido cervical normal (Fig. 2B). SiHa, HeLa y células C33A tienen ninguna expresión de miR-205. En todas las líneas celulares, la expresión del miR-143 y -145 era menos de lo que se observó en el tejido de cáncer cervical. A pesar de la presencia de algunas diferencias en la expresión de los genes miARN individuo de una línea celular a otra, no fuimos capaces de especificar un perfil de expresión de estos miRNAs detectado en correlación con la presencia de los genomas de HPV integradas o episomales. La regulación a la baja de miR-143, que se deriva de la misma precursor de miARN de miR-145 [28], se confirmó además que ser específica para el cáncer mediante la comparación de su expresión en tejidos de cáncer cervical para el cuello uterino normal (Fig. 2C).
perfil de expresión de miRNA en los tejidos cervicales normales y cancerosas
Dado que nuestro sistema de clonación tiene una limitación en el aislamiento de bajos miRNAs abundantes y el norte de secante está limitado por la sonda elegida, los dos métodos no pueden ser la la mejor manera de distinguir una diferencia de una línea celular a otra en el perfil de expresión de los genes miARN. Para investigar más a fondo si miRNAs se expresan diferencialmente en los tejidos de cáncer de cuello uterino, se recogieron los cinco pares de tejidos cervicales normales y cancerosas de la misma edad y se compararon sus perfiles de expresión utilizando una serie de análisis que contiene 455 miARN miRNAs. Sólo cuatro pares de muestras se clasificaron para el análisis final agrupamiento según lo determinado por análisis de la consistencia de la muestra. Un análisis abundancia de expresión, en base a una densidad de señal ≥20,000, demostró que ambos tejidos cervicales normales y cancerosas tenían abundante expresión de miR-23a, miR-23b, let-7a, let-7c, y dejar-7d, mientras que la alta expresión de miR-26a, miR-29a, miR-99a, miR-100, miR-125 ter, miR-143, miR-145, miR195, y miR-199a se observó sólo en los tejidos cervicales normales, y la alta expresión de miR-16, miR-21, miR-205, y dejar-7f se observó solamente en tejidos de cáncer de cuello uterino, a pesar de que los niveles relativamente bajos de miR-16 y miR-21 se dio cuenta de una población celular homogénea en algunas líneas celulares (Fig. 2B). La expresión de miR-143 y miR-145 mostró una reducción de más de 2,7 veces en los tejidos de cáncer de cuello uterino. El uso de un análisis de la agregación, se observó un incremento en la expresión significativa de 18 miRNAs en cáncer de cuello uterino y 15 miRNAs en cuello uterino normal (P & lt; 0,05, t-test) (Figura 3A, miRNAs en el rojo.). Para la verificación, un conjunto de sondas de genes miARN seleccionados fueron utilizados para llevar a cabo un análisis de transferencia de Northern para dos normales y dos muestras de cáncer. Hemos sido capaces de confirmar que los tejidos de cáncer habían reducido la expresión de miR-126 y miR-424, y el aumento de la expresión de miR-15b, miR-16, miR-146a, miR-155 y miR-223 (Fig. 3B y 3C), después de nivel miRNA individual en cada muestra se cuantificó y se normalizó a la expresión U6.
se analizó el ARN total (5 g) aislado a partir de tejidos de la misma edad normales de cuello uterino (NT) y tejidos de cáncer de cuello uterino (Ca) por el análisis conjunto de los genes miARN. El tejido de cáncer de 1, 3, y 5 fueron infectadas con HPV16 y el tejido del cáncer de 4 estaba infectado con HPV45. A. Un gráfico de la agrupación se ha creado usando un método jerárquico de los miRNAs con la densidad de la señal de más de 1000 y muestra un aumento de (rojo) o disminuye (verde) expresión (P & lt; 0,05) del individuo miARN a partir del 4 de cuello uterino normal y canceroso de la misma edad tejidos (Tabla S1). El encabezado de la columna indica el código de la muestra individual en el ensayo. Cada fila muestra el patrón de expresión de los genes miARN individuales como una relación de la expresión log 2-transformado, con la expresión relacionada más estrechamente unidos por una rama y agrupado por un algoritmo de la media vinculada. Subdivisión de longitudes reflejan grados de similitud entre los patrones de expresión de genes miARN. Escala de colores en la parte superior del panel representa el grado de expresión basado en una relación calibrada. El color verde indica la expresión menor en comparación con la media (cero), negro indica la expresión igual a la media, y el rojo indica una mayor expresión en comparación con la media. B. Verificación del perfil de expresión de los genes miARN mediante transferencia northern. ARN celular total (30 g) aislado a partir de cada tejido se sondeó con oligo antisentido individual a cada miRNA indicado. Una banda adicional en cada mancha indica un producto de oscilación de la digestión Dicer. C. gráficos de barras muestran los niveles relativos de los miRNAs examinados normalizaron a U6 ARN en cada tejido en el panel B.
perfil de expresión de los genes miARN en balsa, tejidos de queratinocitos derivados infectadas por el VPH
para investigar si los genes miARN firmas observadas en los tejidos de cáncer de cuello uterino son específicos de cáncer de cuello uterino, se analizó la expresión de los genes miARN en las lesiones pre-neoplásicas. La falta de cultivos de células convencionales para la multiplicación HPV ha restringido en gran medida nuestra comprensión del ciclo de vida del VPH y la patogénesis. Sin embargo, los VPH infecciosas se han producido con éxito a partir de cultivos balsa derivados de queratinocitos humanos [29], [30] y la inducción de las lesiones pre-neoplásicas en tejidos balsa por la infección por VPH con la morfología similar a la de la neoplasia intraepitelial cervical [31] hace que este sistema de gran ventaja para nuestros estudios. El uso conjunto de los genes miARN análisis, se compararon los perfiles de expresión de 455 miRNAs humanos en queratinocitos humanos primarios infectados con VPH 18 vaginales (HVKs) en cultivos en monocapa y en los tejidos de la balsa estratificada y diferenciada. Un análisis de la abundancia de expresión, en base a una densidad de señal ≥20,000, mostró que el miR-21, miR-23a, miR-23b, miR-26a, miR-205, let-7c, y let-7F abundantemente expresado en HVKs tanto en monocapa culturas y cultivos suspendidos. Tres miRNAs expresados abundantemente sólo en cultivos en monocapa (miR-24, miR-29a y miR-221) y 11 miRNAs expresados abundantemente sólo en los cultivos suspendidos estratificada y diferenciada (miR-27a, 27b-MIR, MIR-200b, miR 200c, miR-203, miR-638, let-7a, 7b-dejar, let-7d, 7e let-y-7g dejar). El uso de un análisis de agrupación, se determinó además que 16 miRNAs se upregulated (Fig. 4A, balsa en rojo) y 25 miRNAs fueron regulados a la baja (Fig. 4A, balsa en verde) en los cultivos suspendidos en comparación con los niveles de expresión en la monocapa correspondiente culturas (P & lt; 0,05, t-test). Para confirmar las observaciones, se analizaron las muestras pareadas para la expresión de los genes miARN mediante transferencia northern utilizando un conjunto de sondas específicas de genes miARN (Fig. 4B y 4C). La cuantificación de cada nivel miARN en cada muestra se normalizó a la expresión U6. Se confirmó que la expresión de miR-26b, miR-195 y miR-200c se incrementó en los cultivos suspendidos, sino la expresión de miR-143 y miR-145 se redujo (Fig. 4B y 4C). La mayor abundancia de miR-200c que muestra 67% más de expresión en balsas que en monocapas (P & lt; 0,08) por el análisis conjunto se verificó mediante transferencia northern. A pesar de que la regulación al alza de miR-15a y miR-223 y regulación a la baja de miR-218 y miR-424 se observó tanto en las balsas (lesiones pre-neoplásicas) y en tejidos de cáncer de cuello uterino, la mayoría de las firmas de expresión de los genes miARN no mostró correlación entre la dos tejidos (compare Fig. 4A a la Fig. 3A). Sin embargo, la regulación negativa de miR-146a se observó en los cultivos suspendidos en lugar de la regulación al alza observada en los tejidos de cáncer de cuello uterino y se confirmó mediante transferencia northern (Fig. 5), lo que indica que la regulación positiva de la expresión de miR-146a es específica para el cáncer de cuello uterino. Por el contrario, se observó un ligero incremento en la expresión de miR-21 y miR-26b en ambos las lesiones pre-neoplásicas (balsas infectadas por el VPH) y tejidos de cáncer de cuello uterino y por tanto su expresión no aparece el cáncer-específica (Fig. 5).
Raft tejidos (cultivos) con infección por VPH 18 se obtuvieron a partir de queratinocitos humanos vaginales (HVKs) en cultivos en monocapa con la transfección de ADN de HPV18. ARN celular total (5 mg cada una) extraído de cada tipo de células se comparó en paralelo para la expresión de los genes miARN utilizando análisis de matriz de miARN. A. Un gráfico de la agrupación fue creado por un método jerárquico de esos miRNAs con una densidad de señal de más de 1000 obtenido a partir de tres transfecciones independientes en cada grupo (Tabla S2). El gráfico muestra disminuyeron (verde) o aumento (rojo) la expresión (p & lt; 0,05) de miRNAs individuales de HVKs indiferenciadas en monocapas (mono) frente a HVKs estratificada y diferenciada en balsas. Ver otros detalles en la Fig. 3A. B. Verificación de la expresión de los genes miARN de HVKs indiferenciadas en monocapas y HVKs estratificada y diferenciada en balsas por el norte de borrones. ARN celular total (30 g cada uno) aisladas de HVKs diferenciado o indiferenciado se sondearon con sondas de genes miARN seleccionados. C. gráficos de barras muestran los niveles relativos de los miRNAs examinados normalizaron a U6 ARN de cada muestra en el panel B. M = cultivo en monocapa, R = balsa.
A. ARN totales de HVKs en dos balsas y dos cultivos en monocapa (mono) se compararon con dos tejidos cáncer de cuello uterino (Ca) para la expresión de miR-146a mediante transferencia northern. Los niveles de expresión de miR-21 y miR-26b se examinaron como controles miARN. Pequeño U6 RNA nuclear también se transfirió como un control interno para la carga de la muestra. B. gráficos de barras muestran los niveles relativos de los miRNAs examinados normalizaron a U6 ARN de cada muestra en el panel A. M = cultivo en monocapa, R = balsa.
Reducción de miR-143 y miR-145 en lesiones cervicales y cáncer de cuello uterino son de supresión en el crecimiento celular del cáncer de cuello de útero
Después de haber demostrado una regulación a la baja significativa de miR-143 y miR-145 en el cáncer cervical y lesiones pre-neoplásicas, se investigó si esta regulación a la baja es importante en el desarrollo de cáncer de cuello uterino. Para abordar esta cuestión, sintético miR-143 y miR-145 precursores se transfectaron transitoriamente en células HeLa y el efecto de la sobreexpresión de sus miRNAs maduros en el crecimiento de células HeLa se evaluó por recuento de células. Como se muestra en la Fig. 6, ambos de miR-143 y miR-145 se encontraron supresora (p & lt; 0,005 para el miR-143 y p & lt; 0,008 de miR-145,
t-test
) para el crecimiento de células HeLa. Este efecto supresor sobre el crecimiento de las células no fue una respuesta de células inmediata; más bien, se necesitan dos transfecciones de células consecutivos con cada miARN en un intervalo de 48 horas. Los datos sugieren que tanto el miR-143 y miR-145 probablemente necesitan ser regulados a la baja en las células del cuello del útero para la progresión del tumor.
A. miR-143 y miR-145 son supresora de crecimiento de células HeLa. Las flechas indican los puntos de tiempo cuando las células recibieron un miARN (30 nM) transfección específica. Las células viables en cada grupo se contaron en los puntos de tiempo indicados. Los datos representan la media ± DE de dos experimentos, cada uno realizado por triplicado. B. Los niveles relativos de miR-143 y miR-145 en células HeLa a las 96 horas después de la transfección transitoria primera. El ARN total extraído de células se examinó por el ensayo de ligadura de miRNA. Un nivel de ARNt en cada muestra se utilizó como control de carga.
El aumento de miR-146a en el cáncer de cuello de útero promueve la proliferación celular
Teniendo en cuenta un aumento de 6 veces de la expresión de miR-146a en tejidos de cáncer de cuello uterino, la hipótesis de que un alto nivel de miR-146a podría desempeñar un papel en el crecimiento de células de cáncer de cuello uterino. Nuestro enfoque inicial usando inhibidores anti-miR-146a o utilizando un oligo-morphonino para bloquear la maduración de miR-146a para derribar la expresión de miR-146a en líneas celulares de cáncer de cuello uterino no inducir un efecto fenotípico (datos no mostrados). Para nuestra sorpresa, encontramos que todas las líneas celulares de cáncer de cuello uterino examinados no expresaron detectable miR-146a (Fig. 7A). Posteriormente, el miR-146a se introdujo por transfección transitoria en células HeLa, una HPV18
+ línea celular de cáncer de cuello uterino, y las células HCT116, una línea celular de cáncer colorrectal (Fig. 7B). La proliferación lenta, pero significativamente mayor de células HeLa de ambos (p & lt; 0,009,
t-test
) y HCT116 (P & lt; 0,019,
t
alltests) las células se observó en la presencia de exógena miR-146a. Por cálculo de los recuentos de células de cada grupo, hemos demostrado que tanto las células HeLa y células HCT116 contienen miR-146a tenían un tiempo de duplicación 2-3 horas más rápido que el de las células con miR-controles (Fig. 7C y 7D). Estos datos sugieren que las funciones de miR-146a como un factor de crecimiento en el cáncer de cuello uterino.
A. No expresión de miR-146a en líneas celulares de cáncer derivado de cervicales y en una línea de queratinocitos derivados de piel humana, las células HaCaT. ARN celular total fue extraído de la línea celular individual y examinado para miR-146a y miR-21 expresión mediante transferencia northern. U6 en cada muestra sirvió como control de carga de muestra. B. Nivel relativo de miR-146a en células HeLa y HCT116 a las 96 horas después de la primera transfección. El ARN total extraído de células de cada grupo se examinó por transferencia de Northern. C y D. miR-146a promueve la proliferación celular. Las flechas indican los puntos de tiempo cuando las células reciben la transfección con miR-146a o miR-control (30 nM). Las células viables en cada grupo se contaron en los puntos de tiempo indicados. Los datos representan la media ± DE de dos experimentos, cada uno realizado por triplicado.
Discusión
En este estudio, hemos demostrado perfiles de expresión de genes miARN en el cáncer cervicouterino y el VPH pre-inducida por la infección lesiones neoplásicas en tejidos balsa. Aunque tanto el cáncer de los tejidos y los tejidos balsa infectadas por el VPH cervical con lesiones pre-neoplásicas mostraron una regulación al alza de miR-15a y miR-223 y regulación a la baja de miR-143, miR-145, miR-218 y miR-424, la mayoría de la expresión de los genes miARN no mostró correlación entre los dos tejidos y puede delinear la progresión de la enfermedad. Sin embargo, se encontró un alto nivel de expresión de miR-146a ser cáncer cervical específica, ya que su expresión se redujo reguladas tanto en tejidos normales y en los tejidos de la balsa infectadas por el VPH con lesiones pre-neoplásicas.
Hallazgo de regulación a la baja de miR-143 y miR-145 y la regulación positiva de miR-146a en el cáncer de cuello de útero era especialmente atractivo por dos razones: (1) el miR-143 y miR-145 se expresan a partir del mismo precursor miARN [28] y se downregulated también en lesiones pre-neoplásicas inducidos por HPV, en nuestro caso en los tejidos balsa infectadas por el VPH, lo que sugiere que su reducción tiene lugar en una etapa temprana antes del desarrollo del cáncer. Regulación a la baja de miR-143 y miR-145 se ha encontrado en varios otros tipos de cáncer, incluyendo el cáncer colorrectal [32], linfoma de células B [33], y recientemente en el cáncer de cuello de útero [34], [35]. Por lo tanto, nuestro hallazgo es importante para la comprensión de los mecanismos por los que el miR-143 y miR-145 están implicados en la carcinogénesis. La inhibición por el miR-143 y miR-145 de crecimiento de las células HeLa implica que el miR-143 y miR-145 probablemente necesitan ser regulados a la baja a fin de que el crecimiento del cáncer. (2) La regulación por incremento de miR-146a en tejidos de cáncer de cuello uterino, pero no en lesiones pre-neoplásicas inducidos por HPV o en líneas celulares de cáncer derivado de indica que miR-146 expresión es específica del cáncer cervical. Varios estudios muestran que el miR-146a es un gen NF-kappaB-dependiente [36] - [38]. La expresión de miR-146a parece variar en diferentes tejidos de cáncer en los que se observó un aumento del nivel de miR-146a en líneas de linfoma de Burkitt 'con EBV-LMP1 (proteína latente de membrana 1) la expresión [37], [38], pero una disminución de nivel en el cáncer de próstata refractario a hormonas [39] y el carcinoma papilar de tiroides [40]. En el cáncer de cuello uterino, la regulación positiva de la expresión miR146a aparece sin relación con ninguna de la expresión génica de HPV ya que su expresión se reduce incluso en los tejidos balsa infectadas productivamente VPH. Curiosamente, todas las líneas celulares de cáncer de cuello uterino y una línea de queratinocitos de la piel examinada no contiene detectable miR-146a, lo que sugiere que el miR-146a en tejidos de cáncer de cuello uterino es aumentada por un factor que falta en una población celular homogénea o se expresa por otro tipo de células en el cáncer tejidos. Por lo tanto, se concluye que la regulación positiva de la expresión de miR-146a en el cáncer de cuello de útero es beneficioso para el crecimiento del cáncer como la introducción de miR-146a en células cancerosas incrementado el tiempo de duplicación celular y promueve la proliferación celular.
Se han predicho Aproximadamente 800 miRNAs humanos . De éstos, más de 450 (http://microrna.sanger.ac.uk/sequences, 2006) se han identificado en el ser humano [41], [42] [43], [44], y sus funciones están empezando no se ha dilucidado [45]. En este estudio, hemos clonado y se identificaron 174 miRNAs que fueron agrupados en 46 especies diferentes miARN. Una nueva subespecie de miR-193, miR-193c, también se clonó y se identificaron a partir de nuestra biblioteca de detección de miRNA. Proyección de 10 líneas celulares derivadas de cáncer o CIN tejidos del cuello uterino para la expresión de 10 miRNAs sugerido que la presencia o ausencia de los genomas de HPV integradas o episomales no tiene ningún efecto sobre la expresión de miRNAs analizados. Por otra parte, no hemos podido identificar un solo miARN-HPV16 HPV16 derivado de células
+ CaSki por este enfoque, aunque otros virus de ADN nuclear hacen miRNAs codificar [46], incluyendo EBV [47]; HVSK [48] - [50]; HSV-1 [51], [52]; y SV40 [53]. Un clonación negativo para miRNAs HPV16 derivado sugiere que el genoma HPV16 integrado en las células CaSki parece no expresar miRNAs virales. Otro estudio usando HPV31 diferenciada
+ células LKP1 que contienen aproximadamente 50 copias de un genoma episomal HPV31 por célula no se logró identificar miRNAs derivados de virus [54].
Los informes recientes han sugerido que los miRNAs contribuyen a una variedad de las funciones celulares [41] y están implicados en el desarrollo de cánceres humanos [19]. Por ejemplo, el miR-32 controla la resistencia celular a una infección retroviral [55]. Un grupo de seis miRNAs en el cromosoma humano 13 es regulada por c-Myc, y el regulado-c-Myc miR-17-5p y miR-20a modulan negativamente la expresión de E2F1, un factor de transcripción [56]. miRNAs también se han caracterizado recientemente como oncogenes potenciales que promueven el desarrollo de linfoma de células B humanas (miR-17-92 clúster) [57] y la proliferación y tumorigénesis de las células humanas primarias (miR-372 y miR-373) mediante la neutralización inhibición de CDK p53 mediada por [58]. Otro estudio sugiere que la sobreexpresión de miR-17-5p, miR-20a, miR-21, miR-92, miR-106a, y miR-155 podría considerarse una firma miARN de cáncer sólido [59]. En este informe, 18 miRNAs se upregulated y 15 miRNAs fueron regulados a la baja en los tejidos de cáncer de cuello uterino. El aumento de la expresión de miR-15b, miR-16, miR-146a, miR-155 y miR-223 que hemos observado en tejidos de cáncer de cuello uterino también se ha implicado en el desarrollo de otros cánceres humanos: el miR-15 y miR-16 regular la apoptosis por la orientación BCL2 [60] y su mutación se ha asociado con leucemia linfocítica crónica [61]; miR-16 también está involucrado en el control de ARN de citoquinas inestabilidad [62]; los niveles de miR-146b están muy aumentado en el carcinoma papilar de tiroides [40]; miR-155 ha sido recientemente implicado en el desarrollo de linfoma leucemia linfoblástica /de alto grado [63] y el cáncer de pulmón [24] y en la regulación de la angiotensina II fibroblasto humano tipo 1 la expresión del receptor [64]; miR-223, junto con los factores de transcripción C /EBPA y NFI-A, participa en la regulación de la diferenciación granulocítica mediante la supresión de la transcripción de IFN-A ARNm [65].
Aunque miRNAs maduros derivados de sus transcritos primarios a través de la digestión Drosha y Dicer en dos reacciones de recorte separadas contener voladizo un 2-nt 3 'en cada cadena, la digestión Dicer de la pre-miARN no siempre se lleva a cabo con precisión. Esto se reflejó en el miR-21 y miR-205 aislado en este estudio. Hemos encontrado que más del 68% de la miR-21 aislado de células CaSki tenía un C adicional en el extremo 3 'y el 33% del miR-205 aislado contenía una T extra en el extremo 3', pero ningún nucleótido extra fue siempre identificados a partir de los extremos 5 'de cualquiera de los genes miARN. Cuando se compara con la secuencia de pre-miARN correspondiente, la C adicional en el miR-21 y la T en el miR-205 se encontraron que se deriva directamente de los nucleótidos 3 'al sitio de escisión, lo que sugiere que la digestión Dicer tiene un mecanismo de oscilación . Esta observación por pequeña clonación de ARN se puede verificar adicionalmente como bandas dobles para miR-21 (Fig. 5A y la Fig. 7A) y para miR-205 (Fig. 2A y 2B) en los análisis de transferencia de Northern. Nuestros resultados son consistentes con otros informes obtenidos de bioquímica análisis que Dicer utiliza una regla de conteo del extremo 3 'y mide una distancia de $ ~ $ 22 nt desde el extremo 3' para escindir ambas cadenas de ARN, con los cambios de 1 a 2 nt de la posición de escisión preferido [18], [66].
Materiales y Métodos
las células, tejidos y cultivos suspendidos
Ocho líneas celulares de cáncer de cuello uterino se utilizaron para los ensayos : HPV16
+ CaSki y SiHa, HPV18
+ HeLa y C4II, HPV68
+ ME180 [67], y HPV31
+ CIN612 6E y 9E células. Dos HPV16
+ W12 subclones (20861 y 20863) originalmente aisladas de un histológicamente lesión cervical de bajo grado diagnosticados como CIN I [26] también se utilizaron para la comparación. Entre estas líneas celulares, 20863 y 9E células contienen una forma episomal del genoma del VPH, y 20861 y 6E células tienen un genoma de VPH integrada [68], [69].