Extracto
El uso de inhibidores de la tirosina cinasa (ITC) contra el EGFR /c- se reunió en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) ha demostrado ser eficaz en el aumento de la supervivencia libre de progresión del paciente (PFS), pero su eficacia es limitada debido al desarrollo de la resistencia y la recurrencia del tumor. Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos moleculares desarrollo de resistencia a los medicamentos se basa en el CPNM es necesaria para el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos y eficaces para mejorar los resultados del paciente. Este estudio tiene como objetivo comprender el mecanismo de la /c-Met inhibidor de tirosina quinasa (TKI) Resistencia de EGFR en CPNM. líneas celulares H2170 y H358 se hicieron resistentes a SU11274, un inhibidor de c-Met, y erlotinib, un inhibidor de EGFR, a través de aumentos graduales en la exposición de TKI. El IC
50 concentraciones de líneas resistentes exhibió un aumento de 4 a 5 y 11 a 22 veces para SU11274 y erlotinib, respectivamente, en comparación con las líneas parentales. Además, mTOR y la señalización de Wnt se estudió en ambas líneas celulares para determinar su papel en la mediación de la resistencia TKI. Se ha observado una regulación al alza 2-4 veces de las proteínas de señalización de mTOR y una regulación por incremento de 2 a 8 veces de las proteínas de señalización de Wnt en erlotinib H2170 y células resistentes SU11274. H2170 y H358 células se trataron adicionalmente con el everolimus inhibidor de mTOR y la XAV939 inhibidor de Wnt. células resistentes H358 fueron inhibidas por 95% en una triple combinación de everolimus, erlotinib y SU11274 en comparación con 34% por una doble combinación de estos fármacos. células H2170 de los padres no mostraron sensibilidad a XAV939, mientras que las células resistentes se inhibieron significativamente (39%) por XAV939 como agente único, así como en combinación con SU11274 y erlotinib. Se obtuvieron resultados similares con las células resistentes a H358. Este estudio sugiere un nuevo mecanismo molecular de la resistencia a los medicamentos en el cáncer de pulmón
Visto:. Fong JT, Jacobs RJ, Moravec DN, uppada SB, Botting GM, Nlend M, et al. (2013) Alternative vías de señalización como dianas terapéuticas potenciales para la superación de EGFR y c-Met resistencia a los inhibidores de células no pequeñas de cáncer de pulmón. PLoS ONE 8 (11): e78398. doi: 10.1371 /journal.pone.0078398
Editor: Rajeev Samant, Universidad de Alabama en Birmingham, Estados Unidos de América
Recibido: 3 Abril de 2013; Aceptado: September 11, 2013; Publicado: 4 de noviembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Fong y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Informó de Investigación en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional del cáncer de los Institutos nacionales de la Salud con el número premio R21CA158965-01A1 http://www.nih.gov a Neelu Puri. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente la opinión oficial de los Institutos Nacionales de Salud. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores tienen los siguientes intereses: Dr. Marie Nlend es empleado por Thermo Fisher Scientific . No hay patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en línea en la guía para los autores.
Introducción
EGFR y c-Met son ambas bastante expresados en los tumores de NSCLC y compartir las vías de señalización comunes [1] - [3]. Mientras que los ITC contra EGFR y c-Met están en la vanguardia de la terapia del cáncer, sus eficacias individuales están limitados [4] debido al desarrollo de resistencia [5]. cuentas de amplificación de c-Met representa más del 20% de la resistencia adquirida a ITC del EGFR en CPNM tanto
in vitro
y
in vivo
[6], [7]. Por otra parte, el desarrollo de "guardián" cuentas T790M secundarias de mutación para el 50% de toda la resistencia adquirida a la ITC del EGFR tanto
in vitro
y
in vivo
[8]. También, su presencia antes del tratamiento con TKIs resulta en la resistencia primaria a la terapia de TKI de EGFR [9]. Por lo tanto, para explorar mecanismos de resistencia es importante para llevar a cabo
in vitro
estudios adicionales para determinar proteínas objetivo responsables de la resistencia TKI en NSCLC.
SU11274 es un ATP-inhibidor competitivo de moléculas pequeñas de la actividad catalítica de c-Met [10] y es eficaz contra NSCLC [11]. Tivantinib, un c-Met TKI que inhibe el crecimiento tumoral en ratones [12], se encuentra actualmente en fase III de ensayos clínicos y ha sido demostrado que aumenta la SLP de 9,7 a 16,1 semanas cuando se administra en combinación con erlotinib [13], [14]. En estos ensayos, solamente a determinados grupos de pacientes (mutantes KRAS, histología no escamosa y EGFR estado de tipo salvaje) exhibieron significativamente aumentaron PFS [14], lo que sugiere que las nuevas ITC deben añadirse a esta combinación. Además, el tratamiento con una combinación de MetMAb (anti c-Met mAb) y erlotinib reduce el riesgo de muerte por 3 veces en sólo un subconjunto de pacientes positivos para c-Met expresión [15]. Aunque el uso de modalidades de terapia combinada puede limitar la capacidad de los tumores desarrollan resistencia [7], la comprensión del mecanismo de resistencia es el mejor enfoque para la mejora de la terapia dirigida [16].
Los estudios realizados por nuestro grupo y otros indican que c-Met y EGFR tienen una considerable diafonía que aumenta la eficacia de las combinaciones de TKI
in vitro
[1], [17]. Esto es debido al hecho de que el HGF puede transactivar EGFR y la fosforilación de EGFR puede activar c-Met resulta en efectos sinérgicos sobre el crecimiento del tumor [18] - [20]. Por lo tanto, se determinó un nuevo enfoque terapéutico para superar la resistencia a EGFR, c-Met y EGFR /terapias de combinación de c-Met TKI en el CPNM. Para entender mejor cómo las células desarrollan esta resistencia hemos desarrollado líneas celulares H2170 y H358 NSCLC con resistencia adquirida a TKIs de c-Met, EGFR y una combinación de ambos. Estas líneas celulares fueron elegidos porque expresan altos niveles de EGFR y c-Met, son sinérgicamente inhibida por EGFR /c-Met ITC y no tienen EGFR preexistente o resistencia c-Met causando mutaciones.
Anterior Los estudios han demostrado una mayor eficacia con terapias de combinación en comparación con las monoterapias [13], [14], [21] - [24]. La rapamicina inhibidor mTOR es capaz de cooperar con c-Met PHA665752 inhibidor en NSCLC [25]. Además, el uso de erlotinib y rapamicina o everolimus (un derivado administrado por vía oral de rapamicina) en combinación ha mostrado efectos sinérgicos sobre la viabilidad celular, la proliferación y la autofagia [26], [27]. Esta combinación también se demostró que restaurar la sensibilidad a gefitinib [28]. Sin embargo, estos estudios sólo se administran inhibidores de EGFR y mTOR en combinación. En nuestros estudios, hemos encontrado que los inhibidores de mTOR pueden aumentar la eficacia de la /terapia de combinación EGFR TKI c-Met para NSCLC
in vitro
. Además, se ha sugerido que la diafonía entre EGFR y de la vía Wnt puede participar en la aparición y progresión de la tumorigénesis y la diafonía entre ligandos de las vías mediadas por RTK separadas puede facilitar la resistencia a la TKIs [29]. La hiperactividad de Wnt en cáncer de mama se ha demostrado que transactivate EGFR y por el contrario, EGFR activado puede contribuir al aumento de efecto de la vía canónica de Wnt [30] - [33]. Además, los estudios sobre secciones de tumor de pacientes han demostrado una correlación positiva entre la activación de mutaciones de EGFR y la acumulación nuclear de β-catenina en NSCLC primario [34]. También se ha demostrado que la vía /β-catenina Wnt tiene un papel importante en el mantenimiento de células, la patogénesis y la resistencia después de la inhibición de EGFR en NSCLC [35]
.
Nuestros datos demuestran que la adición de inhibidores de Wnt a TKIs SU11274 y los resultados de erlotinib en forma significativa disminución de la viabilidad en las líneas celulares con resistencia adquirida a la combinación de la terapia EGFR /c-Met TKI. Sugerimos que la activación de vías de señalización alternativas es un posible mecanismo molecular de la resistencia a los medicamentos en el CPNM, la utilización de los inhibidores de c-Met, EGFR, mTOR y Wnt podría mejorar en gran medida el pronóstico del paciente de cáncer de pulmón y ser la base para nuevos ensayos clínicos.
Materiales y Métodos
Reactivos y anticuerpos
SU11274: [(3Z) -N- (3-clorofenil) -3 - ({3,5-dimetil-4 - [(4 -methylpiperazin-1-il) carbonil] 1H-pirrol-2-il} metileno) -N-metil-2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonamida] y XAV939: [3,5, 7,8-tetrahidro-2- [4- (trifluorometil) fenil] 4H-tiopirano [4,3-d] pirimidin-4-ona] se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Erlotinib y everolimus se obtuvieron de LC Laboratories (Woburn, MA). Tivantinib se obtuvo de Chemietek (Indianapolis, IN). Todos los inhibidores se suspenden en DMSO y se mantienen en partes alícuotas de 0,1 ml a -20 ° C. HGF se obtuvo de Peprotech (Rocky Hill, NJ) y EGF se obtuvo de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). mAb conejo phosphospecific para p-EGFR (Tyr1068, Clone D7A5), p-mTOR (Ser2448, Clone D9C2) y p-4E-BP1 (Thr37 /46, clon 2855) se obtuvieron de Cell Signaling Technology, Inc (Beverly, MA) . anticuerpos policlonales de conejo fosfoespecífico para p-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204, 2532) y p-p70S6K (Tyr421 /Ser424, 9208) se obtuvieron de Cell Signaling Technology. Un anticuerpo policlonal de conejo para p-c-Met (Tyr 1.003, 44882G) se obtuvo de Invitrogen (Carlsbad, CA). Un mAb de ratón para activa β-catenina (clon 8E7, 05-665) se obtuvo de Millipore (Billerica, MA). Para la señalización Wnt estudios, todos los anticuerpos se obtuvieron a partir de muestras de anticuerpos kit de señalización Wnt de Señalización Celular Tecnología (2915). mAb de conejo no fosforilados para p70S6K (2708) y mTOR (2983) se obtuvieron de Cell Signaling Technology. No fosforilada c-Met (C-12, sc-10) y EGFR (1005, SC-03) se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Un mAb de ratón para β-actina (A5441) se obtuvo de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Mouse (7076) y conejo (7074) IgG anticuerpos secundarios se obtuvieron de Cell Signaling Technology. Todos los anticuerpos se utilizaron como se describe por las instrucciones del fabricante.
Líneas celulares y cultivo celular
H358 y las líneas celulares de NSCLC H2170 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Rockville, MD, CRL-5807 y CRL-5928, respectivamente) y se cultivaron de acuerdo con sus instrucciones. Las líneas celulares se incubaron a 37 ° C y 7% de CO
2 y se mantuvieron en el Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medio (Thermo Fisher Scientific, Pittsburg, PA, Cat No: SH3002701) suplementado con 10% (v /v) suero bovino fetal (Atlanta Biologicals,, Lawrenceville, GA) y 1% (v /v) de antibiótico /antimicótico (Invitrogen, Cat No: 15240). Para estudiar los efectos de erlotinib y SU11274 como agentes terapéuticos individuales, así como en combinación, H358 y H2170 células se sembraron en placas de 6 pocillos y se trataron después de 24 horas. A continuación, se realizaron ensayos de viabilidad MTT y transferencias de Western como se describe a continuación. IC
50 valores para cada línea celular se calcularon utilizando Sigma Plot V12.0 (Systat Software, San Jose, CA).
Cell viabilidad MTT ensayos
La viabilidad celular se midió mediante un ensayo de reducción de colorante colorimétrico MTT (Sigma, St. Louis, MO), utilizando 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio) según las instrucciones del fabricante. Cada experimento se realizó en placas de 96 pocillos en réplicas de seis para cada condición de tratamiento y se repitió tres veces. Las células se colocaron en placas a 5000 células /pocillo y se trataron con inhibidores de después de 24 horas de crecimiento. A las 96 horas después de la siembra, la viabilidad celular por ciento se calculó en relación al control de la medición de la absorbancia a una longitud de onda de 570 nm. Las células tratadas con tivantinib se expusieron solamente durante 24 horas, después de lo cual se retiró de drogas. Después, las células se lavaron y se incubaron durante 72 horas adicionales como se ha descrito por investigadores anteriores [12].
Preparación de lisados de células y Western Blotting
Las células se cultivaron y se lisaron como se describe anteriormente [36] , [37] en tampón que contenía Tris 20 mM (pH, 8,0), NaCl 150 mM, 10% de glicerol, 1% NP-40, 0,42% NaF, 1 mM fluoruro de fenilmetilsulfonilo, ortovanadato de sodio 1 mM, y mM cóctel 10 inhibidor de la proteasa (Sigma-Aldrich). Los lisados celulares se separaron por 7,5% o 10% de SDS-PAGE en condiciones reductoras. Las proteínas se transfirieron a continuación a membranas de inmovilización (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Las membranas fueron sondadas con los anticuerpos antes mencionados. Las transferencias se visualizaron usando un kit de quimioluminiscencia (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) y la cuantificación de la modulación de diferentes proteínas se realizó utilizando el software ImageJ NIH.
fosforilación específica de c-Met /EGFR y otras vías de señalización a través de HGF /EGF y su inhibición
Las células fueron privados de factores de crecimiento por la incubación durante 24 horas en medio libre de suero que contiene 0,5% de BSA con o sin inhibidores. Después del tratamiento, las células fueron estimuladas con 40 ng /ml de HGF durante 7,5 minutos o 5 ng /ml de EGF durante 5 minutos a 37 ° C. Después de preparar lisados, el Western Blot se realizó como se ha descrito anteriormente.
inmunofluorescencia
10.000 células se sembraron en portaobjetos de cámara de vidrio (Lab-Tek, Scotts Valley, CA) y se dejaron adherir durante 24 horas en medio libre de suero con 0,5% BSA. Las células se trataron luego con EGF durante 15 minutos, se fijaron con acetona 01:01: metanol y se visualizó con p-EGFR (Y1068) anticuerpo primario, DyLight anti-conejo 488 (verde) anticuerpo secundario (Thermo Fisher Scientific) y Hoechst tinte para nuclear tinción (azul) usando un microscopio de fluorescencia Zeiss Axio Observador Z1. software NIH ImageJ se utilizó para medir la intensidad total de fluorescencia de células de más de 8 campos microscópicos por condición y los valores se promediaron.
DNA Sequencing
5 millones de células se sembraron en placas de 150 mm de diámetro y se dejaron adherir y crecer en los medios de comunicación como se describe anteriormente. Se extrajo el ADN usando el Qiagen DNeasy® Blood & amp; kit de tejido (cat. no. 69504) siguiendo las instrucciones del fabricante. a continuación, se realizó una PCR para amplificar los exones 18 a 21 de EGFR usando los cebadores descritos por Paez et al [38], utilizando el AmpliTaq Gold® PCR Master Mix (Applied Biosystems, cat. no. 4327058). Los productos de PCR fueron purificados utilizando el kit de purificación de PCR GeneJET ™ (cat. No. K0701) y luego se secuenciaron en las instalaciones de la Universidad de Illinois Servicios ADN.
El análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron a cabo con el programa SPSS 17.0. Las medidas repetidas de ANOVA con comparaciones múltiples por parejas y la costumbre contrasta con se realizaron ajustes de Bonferroni. La significación estadística se determinó con α en 0,05. Para confirmar las diferencias entre los tratamientos
t-test
También se utilizó un emparejado de Student de dos colas. Para todos los análisis, un valor de p inferior a 0,05 se consideró estadísticamente significativa.
Resultados
Establecimiento de líneas celulares resistentes a fármacos
Para identificar las concentraciones adecuadas de SU11274 , erlotinib y una combinación de ambos TKIs para el desarrollo de líneas de células resistentes, las líneas celulares H2170 y H358 se trataron con concentraciones progresivamente crecientes de SU11274 (2,5 a 17 mM) [1], erlotinib (0. 5 a 14 mM) [39 ], o ambos SU11274 (1,25 a 13,5 M) y erlotinib (0,25-9 M) durante 96 horas. Se seleccionaron líneas celulares H2170 y H358, ya que no tienen EGFR TK o c-Met mutaciones. IC
50 valores para TKIs individuales o una combinación se determinaron para cada línea celular (Tabla 1). Las células se trataron entonces con concentraciones crecientes de SU11274 [1], erlotinib [39] o una combinación de varias semanas después de que cinco clones resistentes individuales se aislaron a partir de células individuales, se expandieron y luego comprueba la resistencia estable después de cada paso en serie (una vez por semana ) [40]. Las células resistentes se cultivaron en ausencia de TKIs durante 12 pasajes (12 semanas) y no se encontraron para retener la resistencia. Los clones resistentes de las líneas celulares descritas en la Tabla 1, con IC
50 concentraciones (determinado como se describe en la sección de materiales y métodos) 4-5 veces mayores para SU11274, 11-22 veces mayor de erlotinib, y 6-8- veces mayor para SU11274 y 15 a 30 veces mayor para erlotinib en combinación, se aislaron y se seleccionaron para estudios adicionales. Las concentraciones más bajas eran necesarias para la resistencia combinación, ya que observamos efectos de erlotinib y SU11274 mejorado cuando se utilizan en combinación. Se obtuvieron resultados similares con otros clones resistentes (datos no mostrados).
SU11274 células resistentes (SR) muestran una disminución de la sensibilidad a los inhibidores de c-Met oral, tivantinib
El efecto de tivantinib, una exposición oral c-Met TKI actualmente en ensayos clínicos [12], [14], en la inhibición del crecimiento celular en células parentales y resistentes se investigó. Las células se trataron con concentraciones variables de tivantinib durante 24 horas, después de lo cual se retiró el fármaco [12]. Después, las células se lavaron y se incubaron durante 72 horas adicionales y, finalmente, se realizó un ensayo de viabilidad MTT. Como se muestra en la Fig. 1, en 0,1 tivantinib mu M, células parentales H2170 se inhibieron en un 32% en comparación con las células parentales no tratados, mientras que las células resistentes solamente se inhibieron en un 10% en comparación con las células resistentes no tratados (p & lt; 0,01). Munshi et al también han demostrado sensibilidad a concentraciones submicromolares de tivantinib en NSCLC como se ha observado en nuestros estudios [12]. Una disminución de 3 veces en la inhibición se observó en las células resistentes H2170 comparación con las células parentales (n = 6, p & lt; 0,01). En las células H358 tratadas con SR 0,2 M tivantinib, una disminución 3,7 veces en la inhibición se observó en las células resistentes en comparación con células parentales (n = 6, p & lt; 0,01) (Fig1B). Estos datos sugieren que las células SR también son resistentes a tivantinib.
H2170 y las células H358 se trataron con tivantinib (0,01 a 0,4 M) durante 24 horas, se eliminó tivantinib, y se incubaron las células durante 72 horas, después de lo cual se realizó el ensayo de viabilidad MTT. células H2170 SR mostraron una disminución de 3,2 veces en la sensibilidad al efecto antiproliferativo de tivantinib a 0,1 M tivantinib compara con células parentales. Una disminución 3,7 veces en la inhibición del crecimiento también se observó en células H358 SR con 0,2 M tivantinib en comparación con células parentales. Los datos mostrados son representativos de tres experimentos independientes que muestran resultados similares (n = 6, p & lt; 0,01).
La mutación T790M secundaria no es necesario para la resistencia a erlotinib
Los resultados de ADN de Sanger la secuenciación de productos de PCR de los exones 18-21 de células parentales y resistentes H2170 y H358 no mostró mutaciones puntuales erlotinib /T790M gefitinib o resistencia D761Y secundarias [41]. Estos resultados confirman que nuestras células no se han conocido mutaciones secundarias que podrían causar resistencia. Por lo tanto, el mecanismo por el cual son resistentes puede ser debido a la señalización alternativa a través de receptores distintos de EGFR.
Efecto del EGF y erlotinib sobre la fosforilación de EGFR y proteínas de señalización en dos modelos de NSCLC resistentes
En para entender el mecanismo de resistencia erlotinib, que comparó dos líneas diferentes de células resistentes a erlotinib, H2170 y H358 ER ER, con sus respectivas líneas celulares de sus padres. Las células se trataron con diluyente, EGF, erlotinib o EGF + erlotinib. Erlotinib resistentes (ER) H2170 células apareció para exhibir EGFR constitutivamente autophosphorylated (Y1068) en ausencia de su ligando, EGF (aumento de 19 veces), mientras que las células ER H358 mostraron una disminución de 6 veces en p-EGFR (Y1068) en el presencia de EGF (Fig 2A). Estos resultados fueron corroborados por inmunofluorescencia, que demostró un efecto mínimo del EGF sobre la fosforilación de EGFR en células ER H2170. Después del tratamiento de +/- EGF, células parentales y H2170-H2170 ER se tiñeron utilizando un EGFR específico primario anti-fosfo (Y1068) y anticuerpo DyLight 488-conjugado de cabra anti-ratón secundaria de anticuerpos EGFR fosforilado (verde) y los núcleos se tiñeron azul con colorante Hoechst. Esto sugiere la autofosforilación de EGFR (Figura 2B). Cuando se midieron el total de unidades de fluorescencia, se observó un aumento 3.8- y 1.7 veces en la fluorescencia en presencia y en ausencia de EGF, respectivamente, en células resistentes, en comparación con células parentales (n = 8, p & lt; 0,01). Curiosamente, no había diferencia significativa en la fluorescencia en las células H2170 ER en presencia y en ausencia de EGF (p & lt; 0,01).
A. El EGFR se autophosphorylated en H2170 ER y downregulated en líneas celulares resistentes H358-E4. p-mTOR (S2448) y su proteína de señalización corriente abajo fosfo-p70S6K (T389) están regulados por incremento en ambas líneas celulares resistentes. líneas celulares parentales y resistentes H2170 y H358 se mantuvieron en ayunas durante la noche en BSA al 0,5% y después se trataron con o sin 7,0 M de erlotinib durante 24 horas y las células fueron estimuladas con 10 ng /ml de EGF durante 2,5 minutos. Se han utilizado las concentraciones más altas de erlotinib ya que estas líneas celulares de cáncer no tienen la mutación de EGFR conocimientos tradicionales. La autofosforilación de EGFR en Y1068 se observó en la ausencia de EGF en las células H2170 ER que no se observó en células H358 ER-E4. Upregulation de p-mTOR y su proteína de aguas abajo phosho-p70S6K (T389) se observa en líneas resistentes H2170 +/- erlotinib. ER células H2170 muestran un aumento de la fosforilación de EGFR +/- EGF. Upregulation de p-ERK (2-5 veces) también se observó en las células H2170 y H358 ER en +/- erlotinib B. Para confirmar la autofosforilación de EGFR, las células se sembraron en portaobjetos de cámara, permite que se adhieran durante 24 horas y luego Starved durante la noche. Las células se trataron luego con +/- EGF durante 15 minutos, se fijaron con acetona: metanol y se visualizaron con p-EGFR (Y1068) anticuerpo primario y anti-conejo DyLight anticuerpo secundario (Thermo Fisher Scientific) (verde) o colorante Hoechst para la tinción nuclear ( azul) en un microscopio de fluorescencia Zeiss Axio Observador Z1. Gráfico que muestra el total de unidades relativas de fluorescencia celular media por 8 campos microscópicos. Hubo un aumento de 3,8 veces en la fluorescencia cuando se comparan los padres para células resistentes en ausencia de EGF en células H2170.
A continuación, estudiamos el efecto de la resistencia a erlotinib en la vía mTOR, un regulador clave de crecimiento de las células del cáncer [42], mediante la medición de p-mTOR y su sustrato aguas abajo p-p70S6K. En las células ER H358 y H2170, upregulation (2-4 veces) de p-mTOR se observó en la presencia de erlotinib (Fig 2A). Además, la regulación al alza (2 veces) de p-p70S6K también se observó en las células H2170 ER y H358 en presencia de erlotinib. Además, p-ERK también se upregulated (2-5 veces) en H2170 ER y H358 células en presencia y ausencia de erlotinib (Fig 2A). No se observó ninguna modulación del total de mTOR, EGFR, p70S6K o ERK (Fig S1). Nuestros resultados indican que la vía de mTOR y otros receptores podrían regular al alza p-p70S6K resistencia mediación de este modo a través de dos mecanismos separados en modelos H2170 y H358 NSCLC.
Efecto de HGF y SU11274 sobre la fosforilación de c-Met y las proteínas de señalización en dos modelos de NSCLC
para entender el mecanismo de resistencia a los inhibidores de c-Met, que establecieron H2170 SR y líneas celulares H358 SR, y las tratadas con diluyente, HGF, SU11274 y HGF + SU11274. H358 células H2170 y SR SR mostraron una regulación a la baja de 4 y 1,5 veces de p-c-Met (Y1003), respectivamente, sin cambios en los niveles totales de c-Met como analizados por Western Blot (Figura 3). Regulación a la baja parece ser totalmente independiente de cualquier tratamiento SU11274 ya que se observó la regulación a la baja después de seis pasajes en ausencia del fármaco. Esto podría indicar que H2170 SR y H358 no utilizan p-c-Met como un medio de resistencia, lo que sugeriría un mecanismo separado. De manera similar a las células ER, en células H2170 SR no tratados, se encontró una regulación positiva marcada (20 veces) de p-p70S6K, una proteína de aguas abajo de mTOR que está implicado en la supervivencia de células de cáncer [42], y una regulación por incremento se observó en las células tratadas con HGF y SU11274 (Fig 3). Una regulación por incremento de 2 veces en p-4E-BP1, proteínas aguas abajo de mTOR que promueve la tumorigenicidad, se observó tanto en las células H2170 y H358 SR (Fig 3). Sin modulación de mTOR totales, se observó EGFR, p70S6K o ERK en cualquiera de las líneas de células (Figura S1). Estos resultados indican que la vía de mTOR puede estar implicada en la mediación de la resistencia.
Las células se mantuvieron en ayunas durante la noche y después se trataron con o sin 8,0 M SU11274 durante 24 horas. Las células se estimularon con 40 ng /ml de HGF durante 2,5 minutos después de que se realizó el análisis de transferencia Western. Regulación a la baja de p-c-Met (Y1003) se observó en ambas líneas celulares. Se observó la regulación positiva de p-p70S6kinase (S371) en las células H2170 SR. Upregulation de p-4E-BP1 (T37 /46) también se observó en ambas líneas de células +/- SU11274.
activación de la vía Wnt contribuye a la resistencia EGFR /c-Met TKI
La vía Wnt regula la proliferación celular y juega un papel clave en el desarrollo de cáncer de pulmón [43], [44]. Desde la señalización de β-catenina se demostró para activar la vía de señalización de ERK [45], se examinaron p-ERK (T202 /Y204) y activa β-catenina en respuesta a HGF con el tiempo en las células H2170 SR. Se encontró que el p-ERK permaneció elevada durante más de 120 minutos en las células H2170 SR pero sólo durante 30 minutos en las células parentales (Fig 4A). Curiosamente, en las células no estimuladas, los niveles basales de β-catenina activa (2 veces) y p-ERK (5,6 veces) eran más altas y permaneció elevada durante 120 minutos después del tratamiento HGF en células H2170 SR comparación con las células parentales después de una 60 incubación minutos (n = 3, p & lt; 0,01) (Fig 4A), lo que sugiere la diafonía de la vía de c-Met, mTOR y Wnt. Tras el tratamiento con SU11274 y HGF, se observó un aumento de 3-8 veces en la activa β-catenina en presencia y ausencia de SU11274 en las células H2170 SR (Fig 4B). A upregulation 2-3 veces de p-LRP6 en presencia y ausencia de SU11274 también se observó. Regulación al alza de las proteínas asociadas con la vía de Wnt se confirmó en células ER H2170. Se observó un aumento de 2-4 veces y aumento de 3-5 veces de p-LRP6 en ausencia o presencia de erlotinib, respectivamente. fosforilación LRP6 puede indicar la activación de la vía de Wnt [46]. También se observó un aumento de 2 a 3,5 veces en la expresión de Axin1, un regulador de LRP6 y, posteriormente, la vía Wnt [31] (Fig 4C).
A. En las células H2170 SR, el HGF induce la señalización de p-ERK pronunciada en comparación con las células parentales. Las células se mantuvieron en ayunas durante 48 horas y después se estimularon con 40 ng /ml de HGF. Western Blot en SR H2170 indicó que, HGF activa p-ERK (T202 /Y204) se mantuvo alta durante 120 minutos en comparación con las líneas parentales. Los niveles basales de activo β-catenina también fueron 2 veces superior y se mantuvo alta (3,6 veces) durante 120 minutos después del tratamiento HGF en células H2170 SR en comparación con los de las células parentales de más de 60 minutos de incubación. Estos experimentos se realizaron por triplicado. densitometría relativa de p-ERK /β-actina en células H2170 SR fue representado que es un promedio de tres experimentos independientes (n = 3, p & lt; 0,01). B. Regulación de proteínas en la vía de señalización Wnt después del tratamiento de H2170 con SU11274. Upregulation de pLRP6 (2-3,0 veces) y β-catenina (3-8,0 veces) se observaron en las células H2170 resistentes en la presencia o ausencia de SU11274. C. Regulación de proteínas en la vía de señalización Wnt después del tratamiento de las células H2170 con ER erlotinib. Upregulation de LRP6 (2 a 5 veces), y Axin1 (de 2 a 3,5 veces) se observó en las células H2170 resistentes en la presencia o ausencia de erlotinib.
El crecimiento de H2170 y H358 combinación células resistentes (CR) son inhibidos por everolimus y XAV939
Desde la vía de mTOR está implicado en la resistencia a fármacos anti-cáncer [47], se ensayó la sensibilidad a la inhibición de mTOR en CR H2170 y líneas de células H358. El tratamiento con 1 micra everolimus inhibe H358 células parentales de 40% y las células resistentes por sólo el 20%. Curiosamente, la misma concentración de everolimus inhibió el crecimiento de células de los padres por completo y las células resistentes por 95% cuando se utiliza en combinación con SU11274 (8 M) o erlotinib (8 M) (Fig 5A). Se encontraron resultados similares en las células H2170 CR (99% de inhibición del crecimiento, los datos no mostrados). A continuación, prueba el efecto de la inhibición de Wnt en las células resistentes. líneas celulares parentales y CR H2170 se trataron con concentraciones crecientes de XAV939 y se realizó un ensayo MTT de viabilidad. Curiosamente, las células parentales mostraron poca o ninguna respuesta a XAV939, sin embargo, las células CR se inhibieron de una manera sensible la dosis (Fig 5B). Además, cuando se combinó con XAV939 SU11274 (8 M) y erlotinib (8 M), se observó una disminución de 85% en la viabilidad en células CR. Esto sugiere que la señalización de Wnt tiene un papel importante en las células resistentes.
Las células se trataron para la inhibición del crecimiento del 96% se observó cuando se utilizó everolimus tanto con SU11274 y erlotinib. B. células H2170 Parental muestran poca o ninguna inhibición cuando se administran concentraciones crecientes de XAV939. Por el contrario, las células H2170 CR cuando se tratan con XAV939, se inhibieron de una manera sensible la dosis. células H2170 CR que muestra la inhibición 40% a Wnt antagonista XAV939 (10 M) solo, mostraban una inhibición del 85% con la combinación triple de XAV939, SU11274 y erlotinib (p & lt; 0,01). Cada experimento para cada condición de tratamiento se repitió tres veces.
Discusión
dirigidos molecularmente ITC se han convertido en parte integral de la terapia utilizada por los médicos para combatir no tenían tratamiento de NSCLC. Sin embargo, la resistencia adquirida a TKIs ha limitado severamente la medida en que esta terapia se puede emplear de manera efectiva. Contrariamente a los estudios anteriores, que se han centrado en las mutaciones de EGFR [8], [48], se determinó posible alternativa vías en las líneas celulares resistentes a fármacos de señalización. Se estudiaron dos líneas celulares de NSCLC modelo que mostraban bien la regulación positiva (H2170) o regulación a la baja (H358) de p-EGFR y regulación a la baja de p-c-Met (H2170 y H358). Las células resistentes no mostraron o bien el T790M o mutaciones D761Y, lo que sugiere el uso de un mecanismo de señalización alternativa para superar la susceptibilidad erlotinib. Es interesante que tanto las células resistentes H358 H2170 y muestran la regulación positiva de la vía mTOR. Por otra parte, las líneas celulares resistentes H2170 mostraron modulación de las vías tanto de mTOR y Wnt lo que sugiere su papel en el mecanismo de resistencia.
En la actualidad hay un vínculo se ha establecido entre la resistencia de c-Met TKI y mTOR en el CPNM. Sin embargo, los estudios anteriores sugieren que la inhibición de la actividad quinasa c-Met conduce a la activación reducida de la vía PI3K /AKT /mTOR en células transformadas [25]. Sin embargo, en el presente estudio, se observó ninguna fosforilación de c-Met en H2170 y líneas celulares resistentes H358 cuando se tratan con SU11274. Esto sugiere que SU11274, mientras que un inhibidor eficaz de la fosforilación de c-Met, tiene poco efecto sobre la inhibición de mTOR y sus vías de señalización aguas abajo necesarias para el crecimiento celular y la supervivencia en líneas resistentes [25]. Ya que las líneas celulares resistentes se ha demostrado que proliferan en presencia de SU11274, nos sugieren vías alternativas tienen un papel importante en la superación de la inhibición de c-Met y la orientación molecular adicional puede ser necesaria para inhibir el crecimiento celular. El papel de la vía de mTOR en los mecanismos de resistencia se evidencia por un aumento de 2-4 veces de p-mTOR en las células H2170 y H358 resistentes en comparación con las células parentales en respuesta al tratamiento erlotinib.