Extracto
subclasificación histológica de cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) ha creciente impacto terapéutico. En etapas avanzadas de cáncer de especímenes de tejido son generalmente bioptically recogieron. Estas pequeñas muestras son de un valor extraordinario desde los análisis moleculares están ganando importancia para las terapias dirigidas. Por ello, estudiaron la viabilidad, el diagnóstico de la enfermedad, los efectos económicos y de pronóstico de un tejido ahorradores de ensayo de múltiples anticuerpos simultánea de subclasificación de NSCLC. De 265 matrices de múltiples pacientes con CPNM de tejido (TMA) fueron construidos para simular muestras de biopsia. TMA se tiñeron por un ensayo simultáneo de dos colores multi-anticuerpo que consiste en TTF1, vimentina, p63 y neuroendocrino marcadores (CD56, cromogranina A, sinaptofisina). La clasificación se basa principalmente en la propuesta actual de la IASLC con un árbol jerárquico de decisión para la subclasificación en el adenocarcinoma (ALC), carcinoma de células escamosas (SCC), CNECG (CNECG) y NSCLC no se especifique lo contrario. La investigación de la heterogeneidad del tumor mostró una variación menor explícita para análisis inmunohistoquímico en comparación con la clasificación convencional. Por otra parte, el análisis de supervivencia de nuestra clasificación inmunohistoquímico combinado reveló una buena separación de la curva de supervivencia de cada entidad. Esto fue estadísticamente significativa para los subgrupos de importancia terapéutica (p = 0,045). Como está emergiendo pruebas de cáncer morfológica y molecular, nuestro ensayo multi-anticuerpo en combinación con la clasificación normalizada proporciona separación precisa y fiable de los diagnósticos histomorfológicos. Además, permite subtipos clínicamente relevante de NSCLC incluyendo LCNEC. Por tanto, nuestro ensayo multi-anticuerpo puede ser de valor especial, sobre todo en el diagnóstico de pequeñas biopsias. Se futher proporciona información pronóstica sustancial con consecuencias terapéuticas. La integración de los subtipos inmunohistoquímico incluyendo la investigación de la diferenciación neuroendocrina en la clasificación histopatológica estándar de NSCLC deben, por lo tanto, ser considerado
Visto:. Kayser G, Csanadi A, Otto C, Plönes T, N Bittermann, Rawluk J, et al . (2013), simultánea multi-tinción de anticuerpos en células no pequeñas de cáncer de pulmón refuerza su precisión diagnóstica especialmente en muestras pequeñas de tejido. PLoS ONE 8 (2): e56333. doi: 10.1371 /journal.pone.0056333
Editor: Marc Lenburg, Boston University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 18 Agosto, 2012; Aceptó 8 de enero de 2013; Publicado: 13 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Kayser et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio ha sido financiado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft, SFB 850. los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses: los autores han declarado que no hay existen intereses en competencia.
Introducción
el cáncer de pulmón exhibe la más alta mortalidad global de la enfermedad maligna en los seres humanos en todo el mundo [1], [2]. A pesar de enormes progresos en la medicina moderna, las tasas de mortalidad en el cáncer de pulmón están todavía en un estado de equilibrio que refleja la urgente necesidad de agentes quimioterapéuticos dirigidos potentes en el tratamiento de esta enfermedad muy extendida. Entre la separación de cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) y el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), este último se puede subclasificar adicionalmente de acuerdo con su apariencia morfológica en tres grandes grupos: adenocarcinomas (LAC), carcinomas de células escamosas (SCC) y carcinomas de células grandes (LCC). Al lado de diferente morfología estudios recientes han puesto de manifiesto las diferencias biológicas entre los subtipos histológicos de NSCLC. Estos incluyen diferentes patrones de expresión de m-ARN y proteínas detectables por inmunohistoquímica como timidilato sintetasa (TS). TS, que participan en los mecanismos de reparación del ADN, es uno de los principales objetivos de pemetrexed y significativamente más alto expresado en SCC en comparación con ALC y LCC. Scagliotti et al. podría mostrar que los pacientes que sufren de ALC y beneficiarse de LCC de la quimioterapia basada en platino-en combinación con pemetrexed. En contraste, los pacientes SCC se benefician de una combinación de platino con gemcitabina [3]. Basado principalmente en este estudio, se introdujeron recomendaciones para subtipos exacta de NSCLC en directrices nacionales sobre el cáncer de pulmón [4] - [6]. El dilema para los patólogos en esta configuración está, por una parte, la actual clasificación de la OMS introdujo en 2004. De acuerdo con la OMS, la subclasificación de NSCLC tiene que ser hecho principalmente por hematoxilina-eosina (H & amp; E) manchas. Debido a la heterogeneidad del tumor a menudo extensa, muestras de resección se exigen para un diagnóstico definitivo, también [2]. Por otro lado, estas guías de tratamiento para los pacientes prevalecen en la UICC-etapas avanzadas IIIB y IV [3]. De estos pacientes, por lo general, sólo pequeñas muestras de tumores se recogen, por lo general, mediante biopsia, mediastinoscopia o incluso por aspiración con aguja fina. Por lo tanto, el patólogo tiene que basar su /su decisión diagnóstica en las manchas de inmunohistoquímica especiales adicionales. Entre otros, especialmente el factor de transcripción tiroideo 1 (TTF1) y escamosas vástago de p63 marcador de células se recomiendan en primera línea [7] - [9]. Dado que el material tumoral de biopsias pequeñas es muy escasa, técnicas de preservación de tejidos tienen que ser desarrolladas para hacer frente a material de diagnóstico menor para un mayor número de investigaciones diagnósticas. Además, como la cantidad de investigaciones moleculares necesarios para la terapia dirigida está creciendo rápidamente, las consideraciones económicas también deben tenerse en cuenta para introducir nuevas técnicas. Basado principalmente en conjuntos de marcadores publicados, Sterlacci [10] y Yamagita [11] publicados últimamente protocolos de tinción dobles y un cóctel de anticuerpos disponible en el comercio, respectivamente. Sin embargo, al lado de ALC y SCC, carcinoma neuroendocrino de células grandes (CNECG) representa otro subentidad de NSCLC con consecuencias terapéuticas. En estudios recientes, se ha hecho cada vez más evidente que LCNEC son biológicamente muy relacionada con SCLC [12], [13]. Por ello se propone para administrar pacientes LCNEC combinaciones quimioterapéuticos en analogía con SCLC [14]. En la estrategia de diagnóstico y de subtipos de NSCLC, CNECG debe por estos medios se incluirá. Sobre este fondo se investigó el beneficio de un ensayo de tinción de múltiples anticuerpos simultánea desarrollada recientemente en una cohorte grande y bien caracterizado de pacientes con CPNM.
Materiales y Métodos
Ética declaración
el estudio ha sido aprobado por el hospital Universitario de Friburgo (EK 10/12). En concordancia con esta decisión de este comité de ética se utilizaron todos los datos relativos paciente sólo de una manera seudónimo. Los resultados obtenidos por este estudio no influyó en el tratamiento del paciente. El material de parafina había sido archivado por lo menos 3 años después del diagnóstico inicial. Debido a estos requisitos previos, por decisión del comité de ética, sin el consentimiento por escrito de cada paciente tuvo que ser obtenido.
Pacientes y TMA construcción
265 pacientes, intervenidos entre enero 1
st 1990 y 31 de diciembre
st 2007 en el Departamento de Cirugía Torácica, hospital Universitario de Friburgo, fueron seleccionados de la base de datos del Instituto de Patología, hospital Universitario de Friburgo. Al lado de NSCLC primario, criterios de inclusión fueron acceso a suficientes tumor y el tejido de pulmón no neoplásico. La selección de pacientes se llevó a cabo cegada para evitar sesgos resultantes de la etapa del tumor y /o subtipo histológico. especímenes de operación se fijaron en 4% de formalina tamponada durante 24 a 48 horas. procedimiento de extrapolación y la inclusión en parafina siguieron los protocolos de rutina. Todos los bloques de parafina portadores de tumores fueron recuperados desde el archivo. Tras la nueva H & amp; E secciones todos los tumores fueron reclasificados de forma independiente por tres patólogo experimentado (GK, CA, MW) de acuerdo con la actual clasificación de la OMS [2]. No hay resultados de tinción inmunohistoquímica se habían tomado en consideración para esta reclasificación. 5 casos discordantes y difíciles fueron, de nuevo, revisados y discutidos en común. De la presencia de criterios de la OMS, el consenso se definió para otros análisis. TNM-estadios fueron reevaluados de manera uniforme siguiendo la clasificación actual de la UICC (7
ª edición) [15]. Para eliminar sesgos, reclasificación histológico y nueva puesta en escena de la UICC todos los casos se realizaron antes de los procedimientos de inmunohistoquímica y su evaluación. De todos los pacientes, datos clínico-patológicas que incluyen el hábito de fumar y la supervivencia general estaban disponibles (tabla 1).
tisú de varias matrices (TMA) se construyeron mediante la adopción de tres núcleos de cada tumor al azar de tres diferentes áreas distantes. Diámetro del núcleo fue de 2 mm. En H & amp; E manchadas secciones de la TMA se evaluaron todos los núcleos de la presencia de distintos patrones de crecimiento glandular o escamosa, que clasifican éstos como ALC o SCC, respectivamente. TMA núcleos que carecen de los patrones de crecimiento específicos fueron diagnosticados como NSCLC no especificado (NOS).
La inmunohistoquímica (IHC)
Dos gruesas secciones micrométricas de la TMA se montaron en portaobjetos de vidrio recubiertos (Superfrost Plus) , desparafinados y rehidratados en una fila de alcohol descendente. Para la recuperación de antígenos, se incubaron los portaobjetos en tampón de citrato (pH 6,1) durante 2 minutos usando una olla a presión. El tiempo de incubación para los primeros anticuerpos primarios, vimentina (VIM3B4 clon) y TTF1 (clon 8G7G3 /1), fue de 30 minutos a temperatura ambiente. La incubación con el primer anticuerpo biotinilado secundario seguido por 15 minutos. La activación y la visualización se realizaron mediante fosfatasa alcalina estreptavidina acoplada (AP /estreptavidina; sistema de detección de DAKO real AP /ROJO, K5005 código). La segunda parte de la mancha multi-anticuerpo consistía en un anticuerpo primario dirigido contra p63 (clon 4A4) y un cóctel de anticuerpos neuroendocrino orientación cromogranina A (clon DAK-A3), sinaptofisina (SY38 clon) y CD56 (clon 1B6). El tiempo de incubación para estos anticuerpos fue de 30 minutos. Un polímero de dextrano conjugado con peroxidasa de rábano con las moléculas de anticuerpo acoplado se aplicó y la tinción se realizó por incubación con 3'3'-diamino-bencidina (DAB; Dako Envision + FLEX, código 8012). Por último, las diapositivas se counterstained con hematoxilina. El procedimiento de tinción se realizó en un sistema de tinción automática DAKO para todas las diapositivas (se detalla paso a paso el protocolo documento S1).
Evaluación del ensayo de múltiples anticuerpos
En resumen, con el patrón de crecimiento histológico un diagnóstico histológico-IHC combinada para cada núcleo se hizo en concordancia con las directrices propuestas IASLC [9]: por la presente, claros patrones de crecimiento glandular definidos ALC independiente de la expresión de marcadores de IHQ. Lo mismo se definió para el SCC, si ceratinization y /o puentes intercelulares estaban presentes. En los tumores sin definitivo morfológica H & amp; E-diagnóstico, la evaluación de la expresión de IHC-marcador seguido este algoritmo jerárquico: 1) la expresión TTF1: ALC positiva, negativa: 2) la expresión de p63: SCC positivo, negativo: 3) expresión de marcadores neuroendocrinos: CNECG , negativo: NSCLC NEP (figura 1). La vimentina sirve como un marcador sustituto para evaluar la arquitectura del estroma así como el estado de fijación del tejido desde su robustez en la calidad de la tinción. Cada marcador se evaluó de forma independiente, mientras que sólo distinto nuclear específico (TTF1 y p63) o citoplásmica (vimentina, cromogranina A y sinaptofisina) y membranosa (CD56) con al menos moderada a fuerte intensidad en la superior a la mayoría de las células tumorales se consideraron positivos para diagnóstico propósitos.
en la evaluación final del tumor, se realizó un diagnóstico de consenso que combina los tres núcleos de TMA. En concordancia con la actual Clasificación OMS [15], cáncer si los núcleos de TMA no fueron diagnosticados por unanimidad se clasificó como ALC para la combinación de ALC y NSCLC NOS, y como SCC para la combinación de SCC y NSCLC NOS. La combinación de ALC o SCC con CNECG se agrupó en CNECG. Si ambos, ALC y SCC, se diagnosticaron en diferentes núcleos de TMA de un paciente éstos fueron clasificados como mixto ALC /SCC. Como interpretación de este perfil de expresión IHC no está claramente definido en la propuesta IASLC y sólo 5 pacientes agrupados en ella, fueron excluidos de los análisis de estos casos la supervivencia.
Estadísticas
Correlación entre los diferentes anticuerpos fue evaluadas por cálculo del coeficiente de correlación b Kendall-tau. fiabilidad diagnóstica de los diferentes anticuerpos para IHC algoritmo de clasificación de CPNM fue juzgado por los cálculos de receptor-curvas características de funcionamiento (ROC) y el área bajo la curva (AUC). las diferencias inter-centrales, así como la coincidencia de diagnóstico entre H & amp; E-clasificación de las muestras de resección y la clasificación combinada definida morfológico-IHC se analizaron mediante el cálculo de la kappa de Cohen y V de Cramer, respectivamente. El análisis de supervivencia se realizó de acuerdo al método de Kaplan-Meier. log-rank pruebas sirven para evaluar la significación estadística. El tiempo de seguimiento se evaluó hasta 120 meses. Según lo publicado y aceptado internacionalmente [16] - [19] 15 pacientes que murieron dentro de los 30 días de la cirugía fueron excluidos de los análisis de supervivencia para excluir el sesgo resultante de la mortalidad perioperatoria en este estudio de seguimiento a largo plazo. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el paquete de software SPSS 17. Estadística alfa nivel de significación se fijó en 5% para todas las pruebas.
Resultados
No hay interacciones entre anticuerpos se observan
Con el fin de evaluar las posibles interacciones entre los diferentes anticuerpos utilizados , una prueba de conjunto de NSCLC y 10 sondas de tejido pulmonar no neoplásicas se tiñó usando el ensayo multi-anticuerpo. Las secciones seriadas de este conjunto de pruebas se tiñeron utilizando sólo uno de los anticuerpos incluidos en el protocolo de tinción multi-anticuerpo. La revisión de estas secciones, en todas las muestras no hay diferencias en los patrones de tinción puede ser detectado entre cada single-anticuerpo y el protocolo multi-anticuerpo (Figura 2). Para evaluar las posibles reacciones cruzadas de la segunda sistema de detección (DAB-basa) con el aplicado primero anticuerpo primario (vimentina y TTF1), se tiñeron el equipo de prueba omitiendo el segundo cóctel de anticuerpo primario (p63, CD56, cromogranina A y sinaptofisina). Estas secciones sólo mostró tinción cromógeno rojo para vimentina y TTF1, no hay reacción cruzada con el sistema de detección basado marrón DAB se observó (Figura S1.). Por otra parte, en los análisis, incluyendo toda la cohorte no pudimos detectar ninguna correlación estadística positiva entre los anticuerpos utilizados para cada método de detección cromogénico, i. mi. TTF1 y vimentina para AP /estreptavidina y p63 y el cóctel neuroendocrino de DAB. Por el contrario, p63 y la expresión de marcadores neuroendocrinos mostró una correlación negativa significativa (p & lt; 0,001; coeficiente de correlación de -0,300; Kendall-tau-b). correlación negativa significativa también podría ser detectada por TTF1 y p63 (p & lt; 0,001; coeficiente de correlación de -0,262; Kendal-tau-b). No se detectaron otras correlaciones entre anticuerpos positivos o negativos. Estos resultados apoyan además que los patrones de tinción y evaluación de cada anticuerpo no se vean comprometidas por el potencial de tinción de fondo o reacciones cruzadas cromógeno. Sin embargo, el doble positividad nuclear y /o citoplasmática que refleja la tinción específica para ambos antígenos, i. mi. TTF1 combinado con p63 y vimentina combinado con marcadores neuroendocrinos, respectivamente, siguen siendo claramente distinguibles (figura S2).
tejido pulmonar normal (A), ALC (B), SCC (C) y CNECG (D) teñidas con el ensayo combinado multi-anticuerpo (parte superior) y cada anticuerpo incluido solo. núcleos rojos - TTF1; rojo citoplasma - vimentina; núcleos marrones - p63; marrón citoplasma - marcadores neuroendocrinos. Por debajo de la bicolor IHC ensayo correspondientes ensayos de anticuerpos individuales se muestran en la misma área del tumor. Comparación de cada tinción de anticuerpos única y el ensayo de anticuerpos múltiples bicolor muestra positividad específica analógica en las mismas células y no revela ninguna tinción de fondo inespecífica o reactividad cruzada cromogénico.
TTF1 y p63 son marcadores útiles para la evaluación de la diferenciación de linaje
la clasificación actual de la OMS propone H & amp; E de clasificación de muestras de resección como el estándar de oro de cáncer de pulmón [2]. Con respecto a esto, pudimos observar una sensibilidad y especificidad de TTF1 de reconocimiento de LAC en un rango entre los tres núcleos de TMA de 80,4% a 84,6% y 70,6% a 76,9%, respectivamente. Evaluación de p63 como marcador de la diferenciación escamosa, la sensibilidad se calcula a partir de 62,1% a 66,7%, mientras que la especificidad osciló entre 84,0% y 90,8%. Estas cifras son comparables con la literatura actual en la que se recomiendan estos dos marcadores para ser utilizado en pequeñas biopsias para la investigación de la diferenciación de linaje [8], [9]. Esto también se refleja en corte relaciones claras de impares (Figura S3) y los análisis ROC-AUC (figura S4, el cuadro S1). Ambos, TTF1 y p63 reveló resultados altamente significativos para la clasificación de ALC y SCC, respectivamente (p & lt; 0,001; tabla S1). Como era de esperar, los valores de AUC fueron mayores en el algoritmo de clasificación IHC en comparación con H & amp; E de clasificación de muestras de resección (tabla S1). En este contexto también se observó una correlación negativa significativa entre la expresión de p63 y TTF1 (global: p & lt; 0,001; coeficiente de correlación de -0,262; Kendall-tau-b)
heterogeneidad intratumoral es menos prominente en los marcadores IHC. en comparación con los patrones de crecimiento morfológica
a medida que la heterogeneidad de la morfología del tumor es conocido por ser alta en el CPNM se incluyeron tres núcleos de TMA de cada tumor. Estos núcleos se tomaron en el área del tumor en relación al azar para excluir el sesgo morfológica. Como se publicó e internacionalmente aceptado, el análisis de cada TMA básico puede suponer comparable al análisis de biopsias de tumores en la patología de diagnóstico de rutina [20], [21]. Con respecto a las vías de diagnóstico en la histopatología, primero clasificamos cada TMA básico en una rutina de H & amp; E mancha. Para la evaluación de kappa intra-tumor /inter-core heterogeneidad de Cohen se calculó para H & amp; E de clasificación, así como para el algoritmo de clasificación combinada morfológico-IHC. En general, kappa valores observados se pueden interpretar como de acuerdo con buena correlación para todos los algoritmos de clasificación. Sin embargo, los resultados obtenidos para la clasificación combinada IHC siempre fueron por lo menos tan bueno como para H & amp; E variación inter-core (tabla 2). Actualmente, los algoritmos de IHC son exclusivamente recomiendan para biopsias que carecen de los patrones de crecimiento específicas y por lo tanto se clasifican como NSCLC NOS. Con respecto a esta recomendación, los valores kappa se calcularon por separado para aquellos casos en los que al menos un núcleo TMA fue clasificado como NSCLC NOS sobre H & amp; E morfología. En estos casos, los valores de kappa para H & amp; E de clasificación sólo se mostraron poca correlación mientras que la clasificación IHC alcanzó valores de correlación entre buena núcleos (tabla 2). Análisis de los patrones de tinción inmunohistoquímica en combinación con los patrones de crecimiento histológicos para la clasificación de NSCLC, por lo tanto, presentan una menor variación intratumoral de clasificación de NSCLC basado en H & amp;. E morfología, solo
IHC análisis adicional aumentar la precisión diagnóstica en comparación con el convencional H & amp; e clasificación
a H & amp; e morfología de los núcleos de TMA entre 130 y 142 núcleos de cada uno de los tres conjuntos básicos TMA no podía ser clasificada en los patrones de crecimiento distintos. Estos calificados como NSCLC NOS. La combinación de los tres núcleos a un diagnóstico de consenso 48 (18,1%) fueron clasificados como NSCLC NOS, 14 de los cuales expresa marcadores neuroendocrinos y por lo tanto fueron diagnosticados como CNECG. En contraste con H & amp; E de clasificación, utilizando el algoritmo de IHC combinada sólo 13 tumores (4,9%) expresaron ni TTF1 ni marcadores p63 ni neuroendocrinos y por lo tanto se clasificaron como NSCLC NOS (Tabla 3). Para definir concordancia diagnóstica de cada núcleo de TMA con reclasificación histológico de la pieza de resección V de Cramer se calculó para cada núcleo clasificados por H & amp; E y el ensayo de múltiples anticuerpos. Aunque podríamos verificar una alta significación estadística de la correlación de diagnóstico convencional de la pieza de resección con H & amp; diagnóstico E, así como la clasificación IHC, respectivamente, la conformidad general fue siempre superior mediante la adición de la información de nuestro ensayo multi-anticuerpo (Tabla 3) . Esto no sólo se refleja en un mayor porcentaje de casos clasificados correctamente, sino también en un valor más alto para la V de Cramer (tabla 3).
La inclusión de marcadores neuroendocrinos en el panel de rutina IHC proporciona una definición clara de CNECG
Expresión de marcadores neuroendocrinos se consideró si al menos un núcleo TMA expresó tinción específica. La comparación de la presencia y ausencia de expresión de marcador neurendocrine no tuvo un impacto en la supervivencia del paciente análisis de toda la cohorte (p = 0,208). Esto también fue cierto en los análisis de supervivencia para ALC (p = 0,690) y SCC (p = 0,207). Por otro lado, la investigación de los NSCLC ni tiene características morfológicas adenoides o escamosas diferenciadas ni expresa TTF1 o p63, por lo tanto ser clasificados como NSCLC NOS, la expresión de marcadores neuroendocrinos de hecho reveló una clara separación de las curvas de supervivencia obtenidas con una tendencia estadística (p = 0,095; figura S5). En la evaluación morfológica, todos estos casos, además, LCNEC mostraron patrones de crecimiento neuroendocrinos. Mediante el uso de IHC CNECG clasificación combinada, por tanto, se puede diagnosticar de manera sofisticada y estandarizada.
Combinado clasificación morfológica y multi-anticuerpo en realza importancia clínica de CPCNP subtipos
diferente comportamiento biológico de las enfermedades malignas se refleja generalmente en los diferentes resultados de seguimiento a largo plazo. Para evaluar si hay una mejor estratificación mediante el uso de un combinado histológico y clasificación IHC, se realizaron análisis de supervivencia para ambas clasificaciones, i. mi. H convencional & amp; E morfología de las muestras de resección y algoritmo de clasificación de la morfología de la IHC combinada. Convencional, H & amp; E de clasificación basado nuestra cohorte resultó en paralelo cerca de Kaplan-Meier de supervivencia (p = 0,904, figura 3). Por otra parte, la clasificación de la morfología de la IHC da una separación más clara de las curvas de supervivencia de cada entidad con una tendencia estadística (p = 0,088, figura 3). La combinación de ALC y NSCLC NOS según consecuencia terapéutico en "carcinoma no escamoso" y la comparación de estos con SCC y la supervivencia global CNECG fue significativamente diferente entre estos grupos de pacientes (p = 0,045, Figura 3).
subtipos de NSCLC eran diagnosticado por H & amp; e en muestras de resección (a) y por el algoritmo de clasificación IHC combinada (B). Clasificación adicional IHC separa entidades histológicas distintas que sugieren un comportamiento biológico diferente. La agrupación de las diferentes entidades de acuerdo a consecuencias terapéuticas (C y D), no hubo diferencias en la supervivencia son evidentes por convencional H & amp; clasificación E de muestras de resección (C), mientras que la clasificación IHC combinada separa significativamente las diferentes curvas de supervivencia (p = 0,045; D) .
Bi-color de ensayo de múltiples anticuerpos ahorra el tejido y los recursos económicos
El protocolo aquí utilizado para clasificar inmunohistoquímica NSCLC consiste en una mancha simultánea con 6 anticuerpos diferentes. Por lo tanto, la cantidad de tejido necesario para la caracterización de las biopsias de NSCLC comprende sólo el 16,7% en comparación con la necesaria para 6 ensayos de anticuerpos individuales. En consecuencia, sólo 1/6
º de sildes y laminillas de vidrio se necesitan. Dado que el protocolo utiliza mezclas de anticuerpos de TTF1 y vimentina, así como p63 en combinación con el cóctel neuroendocrino, se necesitan 1/3
rd de la tinción y reactivos de bloqueo. Lo mismo es cierto para los viales de detección cromogénicos. En nuestra institución, los gastos de reactivos se calculan a 3,30 € más 0,20 € adicionales para el portaobjetos de vidrio por IHC mancha. En cifras por caso, esto se traduce en una cantidad total de 6,80 € para nuestro ensayo multi-anticuerpo en comparación con los 21,80 € para 6 protocolos únicos de anticuerpos. Por lo tanto, el uso de nuestro ensayo multi-anticuerpo ahorra hasta un 68,8% de los gastos de reactivos de laboratorio.
Debido al procedimiento doublestaining sin embargo, el tiempo total necesario para completar el protocolo tarda aproximadamente 4 horas en comparación con 1,5 a 2 horas para manchas de anticuerpos individuales. Pero, como el protocolo se puede establecer fácilmente en máquinas de tinción inmunohistoquímica automatizados, ningún efecto negativo sobre la carga de trabajo de los técnicos de laboratorio se produce. Por el contrario, la automatización de tinción es prolongado y los técnicos pueden realizar las tareas más complejas y que consumen tiempo durante este procedimiento. Además, el tiempo para la clasificación de deslizamiento se omite por completo.
Para el diagnóstico del patólogo solo una diapositiva debe ser evaluado. Por la presente, todos los patrones de tinción IHC se pueden evaluar de forma paralela y aún más importante en las mismas células. portaobjetos de microscopio no necesitan ser cambiado y áreas de diagnóstico de no ser reubicados. Como los tiempos de evaluación de diagnóstico en patología de diagnóstico son muy variables, la cantidad de tiempo que se ahorra mediante el uso de nuestro ensayo de múltiples anticuerpos sólo puede ser estimado. De acuerdo con nuestras experiencias el ensayo de múltiples anticuerpos ahorra aproximadamente dos tercios del tiempo necesario para la evaluación de las 6 manchas de anticuerpos individuales correspondientes.
Discusión
A nivel mundial, el cáncer de pulmón es la principal causa de muerte entre todas las enfermedades malignas [1], [22]. Aunque ha habido avances en la terapia del cáncer moderna, las tasas de mortalidad de los pacientes con CPNM no han cambiado significativamente en las últimas décadas [1], [2], [22]. Con el desarrollo de la investigación en la gestión personalizada del cáncer, varios biomarcadores se han atribuido un valor predictivo para los agentes quimioterapéuticos específicos [23] - [27]. Scagliotti et al. describe un beneficio de la gemcitabina en un régimen quimioterapéutico basado en platino para los pacientes que sufren de NSCLC avanzado si la histología mostró una diferenciación escamosa predominante. Además, los pacientes cuya histología mostró una diferenciación ALC predominante tenía un mayor beneficio si existiese pemetrexed [3]. En consecuencia, las recomendaciones para regímenes quimioterapéuticos se basan ahora en la diferenciación histológica del CPCNP y se han implementado en varias guías de tratamiento de NSCLC nacionales [4] - [6]. En la actual clasificación de la OMS, la tipificación histológica de cáncer de pulmón es 1) en gran medida basada en el estándar de H & amp; E tinción y 2) requiere un examen histopatológico de muestras de resección, sobre todo teniendo en cuenta que casi el 50% de los cánceres de pulmón presentan más de un subtipo histológico importante [2]. Por otro lado, el trabajo de Scagliotti se basa en una cohorte de pacientes con CPNM avanzado se diagnostica en la UICC las fases III B y IV. Aquí, la tipificación histológica tiene que ser hecho en pequeñas muestras de tejido, como muestras de resección en su mayoría no están disponibles en estos pacientes. Por lo tanto, los marcadores y paneles IHC han sido propuestas por varios autores para subtipos de NSCLC [8], [28], [29]. Entre estos, TTF1 para la detección de p63 glandular y para diferenciación escamosa parecen ser los marcadores más fiables para la subclasificación de NSCLC [8], [9]. Por estas razones, elegimos TTF1 y p63 como marcadores para la diferenciación de linaje en el CPNM, y estableció una ruta de diagnóstico que combina los patrones de morfología y expresión IHC convencionales de forma análoga a la propuesta de la [9] IASLC. Últimamente, el truncado de proteína p63 DeltaNp63 (p40) se ha descrito para tener una mayor especificidad para la diferenciación escamosa en comparación con la proteína de longitud completa [XPATH ERROR:. Desconocido variable "start2"], [31]. Pero ambos antígenos p63, de cuerpo entero y DeltaNp63, tienen la misma sensibilidad para el carcinoma de células escamosas [30], [31]. Dado que la expresión de p63 se evalúa el diagnóstico después de TTF1 (figura 2), se puede suponer que ambos anticuerpos darían los mismos resultados de la clasificación en nuestro ensayo multi-anticuerpo. Para incluir LCNEC, hemos ampliado nuestro panel de anticuerpos no sólo con la vimentina, que puede servir como un marcador para el carcinoma sarcomatoide [8], pero también con los marcadores neurendocrine (CD56, sinaptofisina, cromogranina A). Se requiere la positividad de uno o más de estos marcadores para el diagnóstico de diferenciación neuroendocrina [2]. A fin de preservar el tejido finito de material bióptica, hemos implementado con éxito un ensayo de tinción de múltiples anticuerpos bi-color, que permite no sólo la tinción simultánea de 6 anticuerpos en la misma sección de tejido, sino también la evaluación simultánea verdadera. Para demostrar que no hay interferencias entre los anticuerpos, se han realizado varios experimentos de validación: Un conjunto de pruebas se tiñó con nuestro ensayo de múltiples anticuerpos y las secciones de serie han sido teñidas con cada anticuerpo, de forma individual. Aquí, no hay diferencias en los patrones de tinción o reacciones fondo cromógeno se pudieron observar (figura 2, figura S1). Para investigar el posible coloración cruzada por el segundo sistema de detección basado en DAB el ensayo se realizó en la prueba mientras que omite los segundos anticuerpos primarios (p63, cromogranina A, sinaptofisina, CD56). Si los sitios de unión libres y /o accesibles de los primeros anticuerpos fueron existente, éstos serían visibles en el color marrón. Revisión de los portaobjetos teñidos, estos experimentos demuestran que todos los sitios de unión de los primeros anticuerpos primarios (vimentina, TTF1) están bloqueados por el sistema de detección basado en AEC como ninguna tinción DAB marrón era visible (figura S1). Tampoco pudimos dilucidar cualquier correlación estadística positiva entre los anticuerpos se visualizó mediante el mismo método de detección cromogénico. Si hubo tinción de fondo, ya sea nuclear o citoplasmática de marcadores que conducen a una falsa interpretación correspondiente, esto habría sido reflejado en correlaciones estadísticas positivas. Por el contrario, se detectó estadísticamente significativa correlación negativa de p63 con los marcadores neuroendocrinos, así como con TTF1. Recientemente, Sterlacci et al establecieron manchas dobles consisten en TTF1 /CK7, p63 /CK5 /6 y TTF1 /CK5 /6 para la clasificación del NSCLC y reveló resultados similares a los nuestros [10]. Yanagita et al. han publicado un ensayo multi-anticuerpo disponible en el mercado que contiene 4 anticuerpos, TTF1, napsin A, p63 y CK5 /6 [11]. Estos cócteles de anticuerpos previamente establecidos demuestran ser útiles, pero sólo sirven para distinguir ALC de SCC. La posibilidad de investigar para CNECG no se tiene en cuenta. Sin embargo, especialmente esta entidad de LCNEC no sólo habita un pronóstico infavourable, pero los regímenes quimioterapéuticos similares a los utilizados en SCLC tienen que ser considerados [14]. En la literatura actual, LCNEC son sólo para ser diagnosticado si NSCLC muestran los patrones de crecimiento neuroendocrinos en combinación con la expresión de al menos uno de los marcadores neuroendocrinos CD56, cromogranina A o sinaptofisina [2].