Extracto
Antecedentes
El factor tisular (TF) inhibidor de la vía (TFPI) existe en dos isoformas; TFPIα y TFPIβ. Ambas isoformas son la superficie de células vinculada principalmente a través de anclajes glicosilfosfatidilinositol (GPI). TFPIα También se ha propuesto para unirse otras moléculas de la superficie, como glicosaminoglicanos (GAGs). TFPIβ superficie celular se ha demostrado ejercer actividad anticoagulante más alta que TFPIα, lo que sugiere funciones alternativas para TFPIα. Además de la caracterización y la búsqueda de nuevas parejas de unión TFPI es crucial para entender completamente las funciones biológicas de las células TFPI asociado.
Métodos y Resultados
proteoglicanos
asociación potencial de TFPI a heparán sulfato (HS) en el sindecan familia fueron evaluados por derribar los estudios y análisis de citometría de flujo. colocalización superficie celular se evaluó por microscopía confocal, y PAGE o inmunoprecipitación seguida por transferencia Western nativa se utilizó para probar la interacción de proteínas. Heparanasa se utilizó para degradar enzimáticamente GAGs HS de la superficie celular. potencial anticoagulante se evaluó usando un ensayo de actividad del factor Xa (FXa). Golpear abajo de syndecan-3 en endotelial, - las células de cáncer de mama lisas músculo-y reducen los niveles de la superficie del TFPI en un 20-50%, y una asociación de TFPIα a syndecan-3 en la superficie celular se demostró. transferencia de Western indicó que TFPIα se encontró en el complejo con syndecan-3. El TFPI unido a syndecan-3 no inhibió la generación de FXa. La eliminación de HS GAG no dio a conocer el antígeno de TFPI de las células.
Conclusiones
Hemos demostrado una asociación entre TFPIα y syndecan-3 en las células vasculares y en las células cancerosas, lo que no parece depender el HS GAG. No se detectó actividad anticoagulante para el TFPI asociado con syndecan-3, lo que puede indicar la coagulación funciones independientes para esta célula asociada piscina TFPI. Esto, sin embargo, requiere una mayor investigación
Visto:. Tinholt M, Stavik B, Louch W, Carlson CR, Sletten M, W Ruf, et al. (2015) syndecan-3 y TFPI colocalize en la superficie del endotelio de, liso músculo-y cáncer de células. PLoS ONE 10 (1): e0117404. doi: 10.1371 /journal.pone.0117404
Editor Académico: Aamir Ahmed, University College de Londres, Reino Unido
Recibido: 13 Enero, 2014; Aceptado: December 23, 2014; Publicado: 24 Enero 2015
Derechos de Autor © 2015 Tinholt et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación: Este trabajo fue financiado por becas de investigación de la Autoridad del Sur-Este de Noruega regional de Salud, Hamar, Noruega y A. Jahre y HG Andrine Berg & amp; fundaciones hijo. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el factor tisular (TF) inhibidor de la vía (TFPI) es el inhibidor endógeno de la inducida por TF coagulación de la sangre, y existe en dos isoformas; TFPIα y TFPIβ. Ambas isoformas ejercen actividad anticoagulante mediante la unión a los sitios activos de la TF-factor VIIa (FVIIa) y complejo de factor Xa (FXa) [1, 2]. Las células endoteliales representan la mayor parte de la producción TFPI, pero la expresión TFPI también se ha demostrado en otros tipos de células, tales como monocitos, células de músculo liso, plaquetas [3-5], y en varias líneas celulares de cáncer de mama [6, 7].
TFPIα consta de tres dominios inhibidores de Kunitz en tándem y una positiva altamente cargadas [8], mientras que TFPIβ contiene los dos primeros dominios de Kunitz seguido de una diferente C-terminal que codifica un glicosilfosfatidilinositol (GPI) de la señal de fijación C-terminal final péptido, dirigiéndola a la superficie celular [1, 9]. Debido a estas diferencias, TFPIβ se une exclusivamente a la membrana celular, mientras que TFPIα puede o bien ser secretada al medio extracelular, o estar unida a la superficie de la célula a través de una molécula unida GPI aún no identificado, y en cierta medida a heparán sulfato (HS ) proteoglicanos (HSPGs) [9-12]. La función de la superficie de la célula TFPI asociado no es bien reconocido, sin embargo, TFPIβ ha sugerido que es responsable de la mayor parte de la actividad anticoagulante en las superficies celulares, lo que indica un papel alternativo de la célula unido a la longitud completa variante de empalme TFPIα [2]. por lo tanto, de vital importancia para la comprensión funcional de esta molécula investigación más a fondo del TFPI asociada a la superficie celular y la pareja de unión putativa (s) es.
Los HSPG son moléculas que sobresalen de las membranas celulares o matriz extracelular. Existen dos grandes familias; las familias syndecan y glipicano que constan de cuatro y seis variantes de genes, respectivamente. El patrón de expresión de la HSPGs está muy regulada en una manera específica, y el tipo de célula de espacio-desarrollismo [13]. Syndecans son proteínas transmembrana, mientras que glypicans son proteínas ancladas a GPI que carecen de conexión directa citoplasmática. Ambos glypicans y syndecans tienen glicosaminoglicanos (GAGs), principalmente cadenas de HS, que están unidos de forma covalente al núcleo de la proteína [13, 14]. Las cadenas de HS son de gran importancia funcional, ya que interactúan con y se unen a un amplio espectro de proteínas efectoras biológicas, como quimiocinas, factores de crecimiento, y los componentes de la matriz extracelular. A través de estas interacciones, HSPGs participan en muchas acciones celulares esenciales, tales como la adhesión celular, la proliferación, la diferenciación y la migración. HSPG puede modular la unión ligando-receptor mediante la concentración de citoquinas en las cercanías de sus receptores de alta afinidad, o funcionar como co-receptores, promoviendo así la señal de transducción eficiente [14, 15]. HSPG también puede estar implicado en la fisiopatología, incluyendo malignidad. Modulaciones del patrón de sulfatación de cadenas de HS se ha demostrado para mejorar el factor de crecimiento de unión y acelerar la proliferación en células del cáncer [16].
Se ha sugerido que los HSPG puede actuar como receptores para la internalización de los complejos de TFPI-FXa en las células endoteliales, contribuyendo al efecto anticoagulante del TFPI [17]. Además, TFPI se ha demostrado que se une a glipicano 3 en células del hígado [18], y sindecano 4 purificado a partir de células endoteliales [19]. El dominio Kunitz 3 y el extremo C-terminal de TFPIα se requieren para la unión a células endoteliales superficies [20, 21] y las células de hepatoma [22] óptima, lo que sugiere que sólo la isoforma asociados TFPIα con HSPG.
Desde se ha propuesto que el TFPI puede estar asociada a HSPG [17-19], que tuvo como objetivo caracterizar mejor la naturaleza de la célula vinculada TFPI. Esto se realizó mediante la evaluación de la expresión de syndecans 1-4 y el potencial de unión de endógenamente expresado TFPI a syndecans en la superficie celular del endotelio de primaria humana y células de músculo liso, y las células de cáncer de mama basales.
Materiales y métodos
Ética Declaración
N /A
Reactivos
Silenciador de control negativ siRNA#5 (AM4642) fue adquirido de Ambion (Foster City, CA, ESTADOS UNIDOS). siRNAs diseñados a la medida contra syndecans fueron producidos por Eurofins GTM Operon (Ebersberg, Alemania) (Tabla S1). Conejo anti-humano vía del factor tisular inhibidor de IgG 4901 /ADG72 y recombinante de longitud completa TFPI (ADG49) se obtuvieron de American Diagnostica (Stamford, CT, EE.UU.). Cabra anti-TFPIα ab9881 y conejo anti-syndecan-3 ab63932 eran de Abcam (Cambridge, MA, EE.UU.). Conejo-IgG-Base Logística y de cabra anti-conejo IgG (H + L) -RPE eran ambos de Southern Biotechnology Associates (Birmingham, AL, EE.UU.). Anti-syndecan-3 (sc-30883), anti-syndecan-3 (sc-9495), el syndecan-3 293T lisado de control (sc-176304), IgG de cabra normal (sc-2028), anti-actina (SC- cuentas /G agarosa 1616), y a (sc-2003) se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology, EE.UU.. Recombinante syndecan-3 (3539-SD), el anticuerpo secundario anti-IgG de cabra HRP (HAF109), y recombinante humana heparanasa activa (7570-GH) eran de I + amp; D Systems (Minneapolis, MN, USA). Anti-syndecan-3 1C7 fue una especie de regalo del Dr. Guido David (Universidad de Lovaina, Lovaina, Bélgica). Anti-humano D heparán sulfato (F69-3G10 clon, código de producto 370260-1) era de AMS Biothechnology (Abingdon, Reino Unido). El γ-globulina humana y forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) y la heparinasa I + III de
Flavobacterium heparinum gratis (H3917) eran de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.). anticuerpos Alexa Fluor (A11071 y A11055) y el reactivo de transfección Lipofectamine 2000 fueron de Life Technologies. Los ensayos de inmunoabsorción ligado a enzimas comerciales (ELISA) Asserachrom total del TFPI y TFPI libre (Diagnostica Stago, Asnière, Francia) se utilizaron para medir los niveles de antígeno de TFPI, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Los cultivos de células
las células de carcinoma de mama intraductal Sum102 (de la Universidad de Michigan; www.cancer.med.umich.edu/breast_cell/Production/index.html) [6, 7] se cultivaron en medio HuMEC listo (Invitrogen), y el Las células endoteliales de arteria coronaria humana (HCAEC;#CC-2585, Lote sin 6F4194, Lonza.) [7] fueron cultered en EBM-2 (Lonza). Todos los medios de células antes mencionada con suplementos se han descrito, anteriormente [7]. La arteria coronaria células humanas de músculo liso (HCASMC;.#CC-2583, Lot no 3F0172, Lonza) [23] fueron cultivadas en medio basal SmBM con SmGM-2 Individual Quots factores de crecimiento y 10% de FCS. Las células se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada y un 5% de CO
2.
QRT-PCR
Los ensayos para las cuatro syndecans fueron diseñados utilizando la biblioteca de sondas universal, la sonda Buscador software (Roche Ciencias Aplicadas). Sonda de Identificación y secuencias de los cebadores se proporcionan en la Tabla S2. ADNc (19 ng) se amplificó por triplicado por PCR cuantitativa en tiempo real (QRT-PCR) con 100 nM de sonda y cebadores 200 nm (Eurogentec). Un control negativo sin expresión artificial syndecan (Ct = 40), y un valor de (18S) Ct control endógeno fijado en el promedio de todos los tipos celulares sirven para calcular la cantidad de ARNm relativa (RQ) de syndecans por el método ΔΔCt. Para una descripción más detallada, por favor refiérase a nuestra publicación anterior [7].
interferente pequeño (si) la transfección de ARN
Sobre la base de experimentos de optimización anteriores, las células fueron transfectadas con siRNA dirigidos contra sindecano 1 -4, usando Lipofectamine 2000 de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. En resumen, las células fueron sembradas en placas de 6 pocillos o 12 pocillos para llegar a 30 a 50% de confluencia el día siguiente y se transfectaron con 5 o 2,5 mg Lipofectamine y 1 o 0,5 nmol siRNA, en un volumen total de 2 o 1 ml fresco medio, respectivamente. Lipofectamine que contienen medio se reemplazó con medio fresco 5 horas después de la transfección. Las células se dejaron crecer durante 2-3 días antes del análisis.
Citometría de flujo
Las células con transitoria derriban de syndecans se analizaron para la superficie celular de unión de un anticuerpo específico TFPI, esencialmente como se describió previamente [7]. Las diferencias en los niveles de la superficie celular del TFPI se calculan y presentan como porcentaje de reducción en comparación con las células control (valores medios ± SD) sobre la base de valores de la mediana de intensidad de fluorescencia. Los valores de la mediana de fluorescencia para las células marcadas con el anticuerpo de conejo irrelevante se consideraron como la unión no específica, y se corrigieron para en cada muestra individual. Las células transfectadas con ARNsi de control negativo y se marcaron con anticuerpo anti-conejo irrelevante sirven para determinar el nivel de fondo cuando se crearon parcelas histograma (referidos como "irrelevantes"). 3-syndecan niveles de la superficie celular se determinaron de manera similar utilizando un 3 sindecano-anticuerpo específico.
heparanasa y tratamiento heparinasa
Para degradar HS GAG de la superficie celular, las células confluentes en bandejas de 12 pocillos se lavaron dos veces con PBS antes tratados con heparanasa (1μg /ml) o heparinasa I + III (2U /ml) en medio libre de suero (SFM) durante 4-16 horas. SFM que contiene el tampón vehículo apropiado sirvió como control. Después del tratamiento, se recogieron los sobrenadantes, y las células se lavaron dos veces antes de la lisis. El efecto del tratamiento con heparinasa se confirmó por transferencia Western utilizando el anticuerpo D-heparán sulfato que reconoce HS neo-epítopos generados por digestión de SA por heparinasa I + III.
microscopía confocal
Las células se sembraron en portaobjetos de vidrio recubiertos de laminina estériles y se incubaron durante la noche a 37 ° C. El día siguiente, las células se lavaron tres veces en PBS y se fijaron durante 10 minutos en 4% de paraformaldehído, se inactivó durante 15 minutos en glicina 100 mM (pH 7,4), y se lavó tres veces antes de bloquear durante 2 horas en solución de alta de bloqueo (0,9% NaCl, 0,5% Na
3Citrate, 3% de BSA y 40 ng /l humana γ-globulina) con inclinación constante. Posteriormente, las células se incubaron con 5 mg /ml anticuerpo de cabra anti-TFPI (ab9881), específico para TFPIα, en una solución de bloqueo bajo (0,9% NaCl, 0,5% Na
3Citrate, 1% de BSA y 40 ng /uL humana gamma-globulina) durante 4-5 horas. Las células se lavaron cinco veces en PBS antes de ser incubados durante 1,5 horas con 1: 1500 Alexa Fluor anticuerpo anti-cabra 488 burro, lavan de nuevo cinco veces y se incubaron con 5 mg de conejo /ml anti-syndecan 3-anticuerpo (ab63932) durante la noche a 4 ° C bajo de inclinación constante. El día siguiente, las células se lavaron cinco veces, y finalmente se incubó con 1: 1500 Alexa Fluor anticuerpo anti-conejo de cabra 633 durante 1,5 horas. Todas las incubaciones de anticuerpos se realizaron a 4 ° C. Las células fueron escaneados utilizando un LSM 710 microscopio confocal (Zeiss, GmbH, Jena, Alemania) con un objetivo de inmersión 40x agua. La señal de TFPI se excitó a 488 nm, con una emisión medida entre 500-600 nm. La señal de syndecan-3 se excitó a 633 nm, con una emisión, medida por encima de 640 nm. la anchura del agujero de alfiler se fijó en 1 unidad Airy, y las imágenes fueron recogidos con un grosor de corte óptico de 1 micra. Las imágenes confocales se de-convolucionados para compensar la distorsión óptica mediante el empleo de software esencial de Huygen (Volumen Scientific Imaging B.V .; Laapersveld, Países Bajos). Las imágenes fueron analizadas y presentadas utilizando el programa Image J (versión 1.4.3.67).
tampones de lisis y experimentos de inmunoprecipitación
Sum102 células, HCAECs y HCASMCs se recogieron en tampón de lisis Triton (HEPES 20 mM , pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 0,5% PAGE Triton X-100, 0,2% de aprotinina, 0,6% 100 mM PMSF fluoruro de fenilmetilsulfonilo, y 1,0% de cóctel inhibidor de fosfatasa) para nativo (no reductor) y para experimentos de inmunoprecipitación (condiciones reductoras).
2 g de anti-syndecan-3 o normal de cabra IgG (control negativo) se añadió a cada lisado de células y se incubaron para la inmunoprecipitación durante una noche a 4 ° C. Los inmunocomplejos se recogieron mediante perlas de agarosa de proteína A /G y se lavaron tres veces en tampón de lisis Triton antes de la ebullición en tampón de carga SDS seguido de análisis SDS-PAGE.
PÁGINA análisis e inmunotransferencia
celular Proteína lisados, inmunoprecipitados y proteínas TFPI recombinante (100 ng) se analizaron en elementos prefabricados de 4-15% Criterio geles de Tris-HCL (# 345-0028, BioRad Laboratories) con (reductores) o sin 0,1% de SDS (no reductoras) en Tris /glicina /SDS (Tris 25 mM, glicina 192 mM, 0,1% de SDS, pH 8,3,#161-0772,) o Tris /tampón de glicina (Tris 25 mM, glicina 192 mM, pH 8,3,#161-0771, BioRad Laboratories), respectivamente. Un tampón de muestra nativo (# 161-0738, BioRad Laboratories) se utilizó para condiciones no reductoras. Las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF (RPN 303F, GE Healthcare), que fueron bloqueadas en 1% de caseína en TBST durante 60 minutos a temperatura ambiente, se incubaron durante la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios, se lavaron tres veces 10 min en TBST y se incubaron con un anticuerpo secundario con peroxidasa de rábano conjugada. Las transferencias se revelaron utilizando ECL Prime (RPN 2232, GE Healthcare). Las señales quimioluminiscentes se detectaron por Las 1000 (Fujifilm, Tokyo, Japón). Inmunotransferencias de inmunoprecipitados fueron despojados durante 30 min entre anticuerpos. Para PAGE nativa, dos inmunotransferencias idénticos se ejecuta en paralelo para asegurar señales específicas de anti-TFPIα y anti-syndecan-3. A partir de entonces las inmunotransferencias fueron despojados de 45 min (Pierce) y se volvieron a sondar para confirmar que los anticuerpos reconocen un complejo de proteínas de tamaño idéntico. ImageJ se utilizó para la cuantificación densitométrica de las bandas de proteínas en inmunotransferencias.
TF-FVIIa actividad
células HCAEC y Sum102 fueron transfectadas con siRNA contra syndecan-3 (48 h) en placas de 12 pocillos como descrito arriba. Las células se lavaron dos veces en solución de lavado (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, KCl 4 mM, y glucosa mM 11, pH 7,5) y se incubaron durante 1 hora a 37 ° C en solución de la reacción (tampón de lavado con 5 mg /ml de BSA y 5 mM CaCl
2, pH 7,5) que contenía 10 nM de FVIIa y FX 175 nM. Después de la incubación, 50 l se transfirieron a 100 solución l de parada (50 mM Tris HCl, NaCl 150 mM, EDTA 25 mM, y 1 mg /ml de BSA, pH 7,5) en hielo antes de se incubaron con 50 l de FXa sustrato (CS-11 ( 22)). La absorbancia a 405 nm se registró a 37 ° C durante 45 minutos a intervalos de 15 segundos usando un lector de microplacas 384 Spectra Max Plus (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.). Las velocidades máximas (V
max) en mU /min se utilizaron para calcular la cantidad de FXa generado, utilizando una curva patrón obtenida con concentraciones conocidas de FXa. células HCAEC se trataron con PMA (10 nM, 6 horas) antes del ensayo para inducir la expresión de TF. Una regulación al alza ~ 600 veces de los niveles de ARNm TF fue confirmada mediante qRT-PCR.
Métodos estadísticos
El análisis estadístico se realizó utilizando el software GraphPad Prism versión 5.0 (PRISM5) (GraphPad Software Inc, La Jolla , CA). Se llevaron a cabo pruebas de la t de Student para probar las diferencias significativas cuando los datos se distribuyen normalmente. De lo contrario, se utilizó la prueba de Mann Whitney U no paramétrico. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01 y *** p & lt;. 0.001
Resultados
Los niveles de expresión de syndecans en células que expresan TFPI
Los HSPG han sido previamente informado de obligar TFPI. En la búsqueda de potenciales candidatos de unión del TFPI, los niveles de expresión de ARNm de syndecans 1-4 se determinaron en una selección de las células que expresan TFPI. Los niveles de expresión de los syndecans variaron considerablemente entre los tres tipos celulares de la prueba; HCAEC, HCASMC, y Sum102 (Fig. 1). Los syndecans se expresaron en todas las líneas celulares, y los niveles de expresión de syndecan-3 y 4 mostraron la menor variación entre las células.
Sum102, se analizaron HCAEC, y células HCASMC para la expresión mRNA de sindecano 1-4 por QRT-PCR. El método ΔΔCt se utilizó para calcular la expresión relativa (RQ) en contra de la expresión media de control endógeno entre todas las células, y el umbral se fijó en Ct = 40 (sin amplificación). + Se presentan los valores medios SD (n = 3 paralelos biológicos).
Efecto de sindecano llamas en los niveles de la superficie celular de TFPI
Para explorar si los syndecans podrían ser potencial TFPI candidatos superficie celular vinculante, se aplicó la tecnología siRNA. Después transitoria derriban de syndecans 1-4, se dejó que las células de unirse a un anticuerpo específico TFPI seguido de tinción con un anticuerpo secundario RPE-ligado y citometría de flujo análisis
.
No disminución significativa en los niveles de superficie celular de TFPI se observó para cualquiera de los tipos de células después de derribar de sindecano 1, 2 o 4 (datos no presentados). Por el contrario, sindecano-3 tumbar en las HCAECs, HCASMCs, y las células Sum102 disminuyó los niveles de la superficie celular de TFPI en un 52 ± 9%, 23 ± 6%, y el 39 ± 12% (media ± DE), respectivamente (Fig. 2). Derribar las eficiencias de los syndecans en células transfectadas siRNA fueron confirmados por qRT-PCR y calculados como porcentaje derribar en comparación con las células control transfectadas con siRNA control negativo. Las eficiencias derribar variaron entre 69-97% para syndecan 1, 45 a 85% para syndecan 2, 83 a 95% para syndecan-3, y 44 a 72% para sindecano 4 (S1 Fig.). Por otra parte, el sindecano-3 tumbar fue confirmado por Western Blot en todos los tipos de células (Fig. 3A), y una (media ± DE) reducción del 32 ± 13% en 3 syndecan niveles de antígeno en la superficie celular después de syndecan 3-golpe abajo se demostró por citometría de flujo en HCAEC (Fig. 3B).
Las células derribados para syndecan-3 por la tecnología de siRNA se analizaron para los niveles de TFPI superficie celular por citometría de flujo. El histograma presenta mediana de intensidad de fluorescencia obtenida después del marcaje de anticuerpos específicos TFPI en A) células Sum102, B) las células y las células HCASMC HCAEC C). Syndecan-3 derribado células (siSDC3); línea discontinua, ARNsi de control negativo; negro con trazo continuo y control irrelevante; línea continua de color gris. Un experimento representativo de tres experimentos individuales (n≥6 paralelos biológicos) se muestra para cada tipo celular.
A) 3 syndecan-niveles de antígeno (la forma monomérica de 55 kDa) en lisados celulares de HCAECs Sum102 células, y HCASMCs por transferencia Western utilizando anti-syndecan-3 y la carga de control (actina). Se muestra un representante de la membrana dos. Syndecan-3 intensidades de las bandas de proteína (después de la normalización en contra del control de carga) con respecto a las células control se indican para cada tipo de célula. Recombinante syndecan-3 (rSDC3) sirvió como control positivo (~ 110 kDa). B) La superficie celular asociado niveles syndecan-3 analizadas por citometría de flujo en células HCAEC. El histograma presenta mediana de intensidad de fluorescencia obtenida después del marcaje de anticuerpos específicos syndecan-3. Syndecan-3 derribado células (siSDC3); sombreada de color gris oscuro, siRNA control negativo; gris medio a la sombra y control irrelevante; sombreada de color gris claro. Se muestra un experimento representativo de dos experimentos individuales (n = 4) paralelos biológicos.
Ni heparanasa (S2 Fig.) ni heparinase I + III (datos no mostrados) tratamiento de Sum102, HCAEC y HCASMC células han cambiado los niveles de antígeno de TFPI en sobrenadantes de células en comparación con las células control.
Efecto de TFPI llamas en la expresión de mRNA syndecan-3
tumbar de syndecan-3 no afectó el ARNm TFPI expresión (Fig. 4A) o los niveles de proteína TFPI (Fig. 4B). Sin embargo, se llevaron a cabo experimentos para evaluar si existía un mecanismo de regulación unidireccional. La expresión de mRNA syndecan-3 se redujo en una media de 30% en tres piscinas separadas de células Sum102, en los que ambas isoformas de TFPI fueron eliminados de manera estable hacia abajo (TFPI derribar eficiencias eran 40 a 60%, como se describe en Stavik
et al
. 2011 [6]). No se detectaron diferencias en los niveles de expresión de mRNA syndecan-3, cuando sólo la isoforma TFPIβ fue derribado (Fig. 5) (el TFPIβ derribar las eficiencias fueron de 53% y 64% para shRNA7b y shRNA 9b, respectivamente). En las células HCAEC y HCASMC, se detectó una reducción del 48% y el 43% de la expresión de mRNA syndecan-3 en las células con 88-94% transitoria TFPI (α + β) tumbar (48 horas). Por otra parte, tumbar de la isoforma TFPIα sola (la expresión no se vio afectado TFPIβ) en las células Sum102 (72 horas) y HCAECs (48 horas) dio lugar a una respectiva reducción del 34% y el 53% de la expresión de mRNA syndecan-3. El TFPI derribar la eficiencia de todos los tipos de células utilizadas se muestra en la figura S3
.
A) HCAEC, Sum102 y las células HCASMC con syndecan-3 derribado se analizaron para la expresión de mRNA TFPI mediante qRT-PCR. El método ΔΔCt se utilizó para calcular la expresión relativa TFPI (RQ) en comparación con células de control (Neg. Control de siRNA). Se presentan los valores medios + SD (paralelos n≥6 biológicos) de tres experimentos individuales. B) los niveles de antígeno de TFPI se midieron por ELISA en los lisados celulares a partir de HCAEC, Sum102 y HCASMC después de syndecan-3 derribar. se muestran los niveles de antígeno de TFPI en relación con las células control. Se presentan los valores medios + SD (paralelos biológicos n≥6) de dos experimentos individuales.
syndecan-3 mRNA expresión se midió por QRT-PCR en tres clones estables independientes con las dos isoformas de TFPI (alfa + ß) desmontados (shRNA 4, 6 y 7) y dos clones estables independientes con solamente la isoforma TFPIβ derribados (shRNA7β y 9β). Los resultados se normalizaron en contra del control endógeno y expresiones relativas (RQ) fueron calculados en referencia a las células de control de vector vacío (pSiRPG). + Se presentan. Los valores medios SD (n = 3 paralelos biológicos) guía empresas
TFPI y syndecan 3-colocalización
Para investigar más a fondo si la unión reducida del TFPI superficie celular se debió a una efecto directo de syndecan-3 derribar, se examinó si TFPIα y syndecan-3 colocalizó en la superficie celular. Colocalización se confirmó mediante doble tinción y microscopía confocal en Sum102, HCAEC, y las células HCASMC. La colocalización no se distribuyó uniformemente, más concentrada a los sitios confinados de la membrana celular (Fig. 6, S4 Fig., Y S5 Fig.).
Las células fijadas fueron teñidas con doble TFPI (verde) y syndecan- 3 (rojo) anticuerpos primarios y anticuerpos secundarios con Alexa Fluor 488 y 633 nm longitudes de onda de excitación, respectivamente, antes de que las imágenes fueron capturadas mediante microscopía confocal. El color amarillo en las imágenes de superposición demostrar la superposición espacial entre TFPI y syndecan-3. Sum102 células (top), células HCAEC (medio) y células HCASMC (abajo). La barra de escala 50 mM (30 mM para las imágenes ampliadas). Un experimento representativo de tres experimentos individuales se muestra para cada tipo celular.
Identificación de un TFPI-syndecan-3 proteína compleja
A pesar de la imagen confocal sugirió que TFPIα y syndecan-3 residido en la misma ubicación física (Fig. 6, S4 Fig., y S5 Fig.), PAGE nativa seguido de transferencia Western posterior se llevó a cabo para poner a prueba para una interacción entre las dos moléculas (Fig. 7A). En lisados de proteínas de Sum102, HCAEC, y las células HCASMC, dos complejos de proteínas que migra a las masas aparentes de ~ 150 kDa y ~ 180 kDa fueron reconocidos tanto por anti-TFPIα y anti-syndecan-3 (Fig. 7A). Los dos complejos más probable el resultado de diferentes modificaciones post-traduccionales tales como glicosilación. No se observaron bandas más débiles para las células HCAEC, lo que refleja las concentraciones de proteína más bajos aplicados. Los tamaños relativamente grandes de los complejos observados indicaron que TFPIα (Fig. 7B, 45 kDa) estaba presente con la forma dimerizada de syndecan-3, que tiene un tamaño aproximado de 110 kDa (Fig. 7C). Las estimaciones del tamaño deben, sin embargo, interpretarse con cierta cautela, ya que no reductor se utilizaron condiciones (nativos) y también debido a la separación precisa de los complejos de alto peso molecular mediante electroforesis en general, es un reto.
Proteína lisados fueron aisladas de células, se sometió a análisis PAGE nativa o experimentos de inmunoprecipitación y analizados por Western Blot. A) PÁGINA nativo de lisados de células Sum102 (20 mg), HCAECs (12 mg) y HCASMCs (18 mg) a inmunotransferencia con anti-TFPIα (parte superior) y anti-syndecan-3 (parte inferior) (una membrana representativo de cada tres es se muestra), B) SDS-PAGE de la proteína recombinante de longitud completa TFPIα a inmunotransferencia con anti-TFPIα, y C) SDS-PAGE de syndecan 3-lisado 293T de control a inmunotransferencia con anti-syndecan-3. D) HCAEC (40 mg), E) SUM102 (160 g) y F) HCASMC (40 g) Los lisados se sometieron a inmunoprecipitación utilizando dos diferentes anticuerpos syndecan-3 (n = 2 para sc-30883, n = 1 para SC- 9495) o control IgG de cabra (n = 2). Los lisados y los inmunoprecipitados se analizaron para la presencia de syndecan-3 endógeno y TFPI por inmunotransferencia. TFPIα proteína recombinante (panel superior izquierdo) y lisado celular (panel inferior izquierdo) se utilizó como control positivo para la inmunotransferencia en D-F.
La interacción TFPI-syndecan-3 fue también analizado por inmunoprecipitación. La inmunoprecipitación de syndecan-3 a partir de lisado de HCAEC utilizando dos syndecan-3 diferentes anticuerpos revelados co-precipitación de TFPI (Fig. 7D), sugiriendo que TFPI asociado con syndecan-3. En consonancia con el análisis de PAGE nativa (Fig. 7A), el complejo TFPI-syndecan-3 estaba presente también en SUM102 (Fig. 7E) y HCASMC lisado (Fig. 7F), aunque la precipitación TFPI apareció algo más débil.
distribución TFPI siguiente syndecan-3 derribar
con el fin de establecer el destino de TFPI en células deficientes en sindecano-3, antígeno de TFPI se midió por ELISA en el sobrenadante de las células y Sum102 HCAEC después de tumbar de sindecano -3. Esto dio lugar a un aumento de 20 a 30% de los niveles de antígeno de TFPI en el sobrenadante en comparación con las células control (Fig. 8).
niveles de antígeno de TFPI (total) fueron medidos por ELISA en los sobrenadantes de Sum102 (izquierda) y HCAEC (derecha) después de syndecan-3 derribar. se muestran los niveles relativos de antígeno de TFPI en comparación con las células control. valores medios + SD (n≥9 paralelos biológicos) de dos (HCAEC) y tres (Sum102) se presentan experimentos individuales.
actividad TF-FVIIa en la superficie de syndecan-3 derribar las células
para explorar si TFPI unido a syndecan-3 podría detener la actividad coagulante del TF, que mide la actividad de TF-FVIIa en la superficie de las células y Sum102 HCAEC antes y después de derribar transitoria de syndecan-3. Se determinó la actividad TF-FVIIa indirectamente por cuantificación de FXa generada en un ensayo colorimétrico en FVIIa y FX se añadieron de forma exógena a las células adherentes. No se observaron cambios en la generación de FXa después de syndecan-3 derribar en cualquiera de los dos tipos de células (Fig. 9). Como era de esperar, se observó un aumento ~ 2 veces en la actividad TF-FVIIa tras la adición de anti-TFPI para el ensayo (control positivo).
células Sum102 y HCAEC derribados de syndecan-3 (siSDC3) eran analizó la actividad de la superficie celular TF-FVIIa, indirectamente, como la generación de FXa. células HCAEC se estimularon con 10 nM de PMA durante 6 horas antes del análisis. Anti-TFPI esta en uno de los experimentos con células HCAEC. Se presentan los valores medios + SD (paralelos biológicos n≥8) de tres experimentos individuales.
Discusión
En el presente estudio, hemos demostrado una asociación de TFPI expresado de forma endógena a la transmembrana syndecan-3 molécula HSPG. Nuestro enfoque ha sido el de reducir la expresión de HSPGs pertenecientes a la familia syndecan, y para analizar los niveles de la superficie del antígeno de TFPI por citometría de flujo. Hemos seleccionado del endotelio, músculo-suave, y las células de cáncer de mama con alta expresión de TFPI endógena para la investigación. Los niveles de expresión syndecan variaron entre estos tipos de células de acuerdo con el hecho de que la expresión difiere en un HSPG de tipo celular y de manera específica de desarrollo [13, 24]. La reducción de los niveles de superficie celular de TFPI se detectaron mediante citometría de flujo después de syndecan-3 derribar en los tres tipos de células, lo que indica la implicación de syndecan-3 en asociación superficie celular de TFPI. Por otra parte, la disminución de la expresión de sindecano-3 mRNA en HCAECs y células Sum102 con TFPIα derribado, y, en suma 102 células con las dos isoformas de TFPI (α + β) derribado, pero no TFPIβ solo, soporta además una relación entre syndecan-3 y TFPI, específicamente la isoforma TFPIα. Si esto es una regulación directa o indirecta queda por esclarecer.
Antes, sindecano 4 purificada a partir de células EA.hy926 se ha demostrado que se une el TFPI en un ensayo de fase sólida [19]. A lo mejor de nuestro conocimiento, indicamos el primer informe sobre la asociación TFPI a una molécula de sindecano en la superficie celular.