Extracto
Las células tumorales en ascitis son una fuente importante de recurrencia de la enfermedad en pacientes con cáncer de ovario. En un intento para identificar y perfilar la población de células de ascitis obtenidos de pacientes con cáncer de ovario, un nuevo método fue desarrollado para adherente separado (AD) y las células no adherentes (NAD) en cultivo. Veinticinco pacientes fueron reclutados para este estudio; 11 habían recibido quimioterapia previamente (CN) y 14 quimioresistente (CR). células de AD de ambos pacientes NC y CR exhiben morfología mesenquimales con un perfil de antígeno de las células madre mesenquimales y fibroblastos. Por el contrario, las células NAD tenían una morfología epitelial con una mayor expresión de antígeno de cáncer 125 (CA125), molécula de adhesión celular epitelial (EpCAM) y citoqueratina 7. Las células NAD desarrollado tumores infiltrantes y ascitis dentro de 12-14 semanas después de intraperitoneales (ip) inyecciones en nude ratones, mientras que se mantuvieron células de AD no tumorigénicos para un máximo de 20 semanas. comparando a continuación los marcadores selectivos epiteliales, células mesenquimales y el cáncer de tallo (CSC) entre las poblaciones de AD y de NAD de pacientes CN y CR demostró una tendencia al aumento en la expresión de ARNm de E-cadherina, EpCAM, STAT3 y Oct4 en la población de NAD de los pacientes CR. Se observó una tendencia similar de la expresión del ARNm de CD44 mejorada, MMP9 y Oct4 en la población de pacientes con AD CR. Por lo tanto, utilizando un nuevo método de purificación se demuestra por primera vez una clara separación de las células de ascitis en poblaciones no tumorigénicas tumorigénicas y mesenquimales epiteliales. También demostramos que las células de la ascitis de pacientes CR son predominantemente epiteliales y muestran una tendencia hacia el aumento de la expresión de mRNA de los genes asociados con células madre cancerosas, en comparación con las células aisladas a partir de la ascitis de pacientes NC. A medida que las células tumorales en el líquido ascítico de pacientes con cáncer de ovario desempeñan un papel dominante en la recurrencia de la enfermedad, un profundo conocimiento de la biología del microambiente ascitis de pacientes con CR y CN es esencial para las intervenciones terapéuticas eficaces
Visto:. Latifi A, Luwor RB, Bilandzic M, Nazaretian S, Stenvers K, Pyman J, et al. (2012) Aislamiento y caracterización de las células tumorales a partir de las ascitis pacientes de cáncer de ovario: Fenotipo molecular de los tumores ováricos chemoresistant. PLoS ONE 7 (10): e46858. doi: 10.1371 /journal.pone.0046858
Editor: Shannon M. Hawkins, Baylor College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 11 Julio, 2012; Aceptado 10 de septiembre de 2012; Publicado: 8 Octubre 2012
Copyright: © Latifi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este era con el apoyo de la Fundación de la Mujer cáncer, National Health and Medical Research Council of Australia (JKF, RegKey#441101), la National Breast Cancer Foundation (EWT; Breast Cancer Network empatía, Australia) y el Programa operativo Apoyo a la Infraestructura del Gobierno de Victoria (Australia). Los proveedores de fondos no tiene función alguna en desugn estudio, la recogida y análisis de datos, la decisión de publicar o preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
En 2009, la Asociación Americana para la Investigación del cáncer informó el cáncer de ovario, como la malignidad ginecológica, con la proporción más alta de casos y la mortalidad [1]. Esta alta tasa de mortalidad de los resultados del diagnóstico en una etapa avanzada cuando el cáncer se ha extendido en la cavidad peritoneal y metástasis en órganos vitales. metástasis de cáncer de ovario se produce ya sea directamente de los quistes de inclusión corticales de los ovarios o desde el extremo fimbrial de la trompa de Falopio [2], y se propaga por extensión directa a los órganos adyacentes (por ejemplo órganos extraovárico pélvicos, de colon, vejiga, hígado, etc.) , o por la unión de las células de cáncer de ovario exfoliadas que sobreviven como agregados celulares o esferoides. Los esferoides son transportadas por el fluido de tumor peritoneal (ascitis) a los órganos circundantes en la cavidad peritoneal. Extensa siembra de estos esferoides en el útero, colon sigmoide y el omento se encuentra con frecuencia en estadio avanzado y enfermedad recurrente [3].
estrategias de tratamiento actuales para pacientes con cáncer de ovario en estadio avanzado como resultado una remisión inicial en hasta el 80% de los pacientes [4]. Sin embargo, después de un período de remisión corto (generalmente 6-22 meses) recurrencia se produce en casi todos los pacientes [4]. Esto se debe en gran parte a la capacidad de las células tumorales para evadir la citotoxicidad asociada a la quimioterapia a través de la quimiorresistencia adquirida. Recientemente, la quimiorresistencia también se ha asociado con la adquisición de transición epitelial a mesenquimal (EMT) en las células cancerosas [5] - [6]. Clásicamente, EMT permite a las células epiteliales estacionarias para convertirse en móviles e invasoras con el fin de difundir y recolonizar a los tejidos circundantes [7]. Estas características de EMT se han demostrado que se correlaciona con un fenotipo CSC-como [8] - [9], corroborado recientemente en casos clínicos por el mesenquimales y 'tumor iniciar' fenotipos de las células tumorales residuales en pacientes con cáncer de mama que sobreviven la terapia convencional [ ,,,0],10]. El fenotipo de CSC se ha demostrado ser regulada dinámicamente por el microentorno del tumor [11], y la característica clave requerida para micro y colonización macro-metastásico implica no sólo EMT sino también mesenquimales a la transición epitelial (MET) [12] - [13 ]. La continuidad de la EMT y MET se ha descrito como la plasticidad del epitelio mesenquimal (EMP) [11]. Dicha colonización metastásica define la capacidad de las células tumorales diseminadas EMP transformadas para auto-renovarse y diferenciarse, los rasgos que definen celulares de células madre cancerosas [14].
A pesar de la presencia de ascitis se ha asociado con un mal pronóstico, el origen y el fenotipo de las células cancerosas en el líquido ascítico, y su asociación con la quimio-resistencia y la recurrencia es poco conocido. La inspección microscópica de la ascitis ha revelado previamente una imagen heterogéneo complejo que consta de células individuales y esferoides [15]. Las células no cancerosas dentro de la ascitis incluyen células inflamatorias, fibroblastos asociados con el cáncer, células mieloides inmaduras y células mesoteliales activado, todos los cuales influyen en el comportamiento de las células tumorales y la respuesta a la quimioterapia [16]. También contribuye a la heterogeneidad de la ascitis se una población de células madre cancerosas que pueden resistir la quimioterapia y dar lugar a una jerarquía de la proliferación de células tumorales con potencial de diferenciación progresiva [17], [18]. Estas células madre cancerosas, cuando se purifica por clasificación y xenoinjertado en ratones desnudos, se ha demostrado para generar una significativamente mayor carga tumoral en comparación con las células tumorales sin clasificar [19], lo que sugiere el mayor potencial tumorigénico de células madre cancerosas.
(A) NAD esferoides y células de AD (B) se sembraron en placas de unión de baja inmediatamente después de la recolección. características morfológicas de células de AD (C) esferoide NAD y (D) en el plástico de cultivo de tejidos después de 24 h después de la siembra. Las imágenes fueron evaluadas por microscopía de contraste de fase. Ampliación fue de 100 ×, barra de escala = 50 micras. Las imágenes son representativas de (n = 25) muestras. (E) [
3H] -timidina captación en células de AD y en células dispersas de esferoides se realizó como se describe en Métodos y Materiales. La gráfica es una representación de una muestra ascitis realizado por triplicado. (F) Efecto del cisplatino sobre la proliferación {[
3H] -timidina captación} de NAD y células de AD obtenidos a partir de la ascitis de pacientes con cáncer de ovario. La gráfica es una representación de tres experimentos independientes, realizadas en tres muestras de NAD y Ad independientes por triplicado. Significativamente diferente entre los años frente a las células de NAD, ** p & lt;.
0,01
Nuestra hipótesis es que la recurrencia en pacientes con cáncer de ovario es dictado en gran medida por el grado en que el tumor y las células del estroma asociados en la cavidad peritoneal sobreviven quimioterapia, y que un estudio comparativo de mRNA de las células aisladas a partir de la ascitis de CN en comparación con los pacientes con cáncer de ovario CR puede proporcionar una importante eslabón perdido para la comprensión de la enfermedad recurrente. El objetivo general de este estudio fue investigar el perfil diferencial de mRNA de las células de ascitis de pacientes con NC y CR con el fin de identificar los productos de los genes que pueden contribuir a la supervivencia y propagación de las células cancerosas residuales después de la quimioterapia. También tuvo como objetivo comprender la propensión a metástasis de las células tumorales en el líquido ascítico de pacientes con cáncer de ovario. Para lograr esto, se desarrolló un nuevo método de purificación para aislar poblaciones distintas de células a partir de la ascitis de pacientes con cáncer de ovario. El uso de esta técnica simple células de ascitis se separaron en dos poblaciones distintas de células con fenotipos epiteliales y mesenquimales bien definidos, respectivamente. Las células aisladas a partir de ascitis CR tenían un fenotipo más epitelial y mostraron una tendencia hacia una mayor expresión de genes asociados con CSC en comparación a las células aisladas a partir de la ascitis de pacientes NC. Estos resultados sugieren que el microambiente tumoral ascitis puede ser diferente en los pacientes antes y después de la quimioterapia y además puede jugar un papel en la recaída de los pacientes con cáncer de ovario después de la quimioterapia.
células purificadas a partir de la ascitis de CN (n = 11 ) y CR (n = 14) de los pacientes de cáncer de ovario se incubaron con IgG de control o anticuerpos primarios se trate a los antígenos respectivos, seguido de anticuerpo conjugado con ficoeritrina secundaria. Los resultados son representativos de (n = 25) muestras independientes. El histograma lleno en cada figura representa la IgG de control, líneas negras indican la expresión de proteínas en las células respectivas.
Materiales y Métodos
Anticuerpos y Reactivos
Los anticuerpos monoclonales y policlonales contra CA125, proteína de la superficie de fibroblastos (FSP) y CD44 se obtuvieron de Merck Millipore (MA, EE.UU.). Los anticuerpos monoclonales contra citoqueratina 7 (cyt 7) y N-cadherina se obtuvieron de Zymed Laboratories (San Francisco, EE.UU.). Los anticuerpos policlonales contra la E-cadherina, vimentina y EpCAM se obtuvieron de Cell Signalling Technology (Beverly, MA, EE.UU.). Los anticuerpos policlonales contra CD73, CD105, CD90, y CD34 se obtuvieron de Sapphire Bioscience (NSW, Australia).
Las células purificadas NAD y AD fueron evaluadas por inmunofluorescencia usando anticuerpo monoclonal de ratón (verde) como se describe en los métodos y Materiales. tinción celular se visualizó utilizando el anticuerpo secundario marcado fluorescente Alexa 488 (verde), y los núcleos se detectaron mediante tinción con DAPI (azul). Las imágenes son representativos de tres muestras independientes. Ampliación fue de 200 ×; barra de escala = 50 micras.
estudio de inmunofluorescencia se realizó en células de AD NAD y purificado como se describe en la Figura 3. Las imágenes son representativos de tres muestras independientes. Ampliación fue de 200 ×; barra de escala = 50 micras.
Los pacientes
declaración de la ética humana.
La ascitis se recogió de los pacientes diagnosticados en estadio avanzado de carcinoma de ovario seroso, tras obtener informado por escrito consentido bajo protocolos aprobados por el Comité de Investigación humana y Ética (HREC#09/09) del hospital de Mujeres Reales, Melbourne, Australia.
el diagnóstico histopatológico, incluyendo las calificaciones y estadio del tumor se determinó por patólogos independientes del personal como parte del diagnóstico clínico (Tabla 1). La ascitis se obtuvo de los pacientes durante la cirugía con carcinoma primario (CN) pacientes. En otros casos, la ascitis se recogió de un grupo de pacientes en el momento de la recidiva (pacientes CR). Estos pacientes habían desarrollado la enfermedad recurrente dentro de 6-20 meses de la primera línea de quimioterapia. Los pacientes de este grupo no fueron tratadas igual que los que habían recibido previamente combinaciones de quimioterapia que consiste en paclitaxel, carboplatino y otras drogas tales como la doxorrubicina, gemcitabina, docetaxel, ciclofosfamida y topotecan después de cada episodio recurrente (Tabla 1). Se recogieron muestras de los pacientes durante el régimen de tratamiento como se describe en la Tabla 1.
qPCR se realizó en las poblaciones de NAD y Ad purificados como se describe en los métodos y materiales. Los rendimientos se convirtieron a femtogramos basado en la curva estándar para cada producto de PCR, y los niveles de ARNm resultantes se normalizaron al nivel 18S mRNA por muestra. Los datos se calcularon a partir de los resultados de ocho muestras independientes evaluados por triplicado. Significativamente diferente en el año frente a las células NAD * (p & lt; 0,05) y ** (p & lt; 0,01).
Preparación de células de ascitis de cáncer de ovario pacientes
El volumen de ascitis varió entre pacientes. pacientes NC tenían volúmenes de ascitis inferiores (100 ml-2L), en comparación con los pacientes CR (100 ml-17 L). Sin embargo, con el fin de estandarizar el protocolo experimental sólo se utilizaron 500 ml de ascitis para recoger las células. La contaminación de las células rojas de la sangre en el sedimento de células de ascitis se eliminaron mediante lisis hipotónica en estéril MilliQ H
2O. La mayor parte de las células de ascitis se sembraron en placas de fijación bajas (Corning Incorporated, NY) en MCDB: media (50:50) crecimiento DMEM suplementado con suero fetal bovino (10%), glutamina (2 mM) y penicilina /estreptomicina (2 mM ) (Life Technologies, CA, EE.UU.). Las células se mantuvieron a 37 ° C en presencia de 5% de CO
2. En estas condiciones, las células NAD flotaban como esferoides en el medio mientras que las células de AD unidos a placas de fijación bajas. Después de 2-3 días, flotantes esferoides (NAD dispersos con la pipeta) y células de AD fueron seleccionados para CA125, EpCAM, cyt 7 y FSP por citometría de flujo. células de AD se mantuvieron en matraces de cultivo de tejido de plástico, mientras que esferoides NAD se mantuvieron en placas de fijación bajas. Las células se pasan semanalmente y los experimentos se llevaron a cabo dentro de 1-2 pasajes.
Una imagen de contraste de fase microscopio de las células NAD adheridas al plástico antes de preparar la suspensión celular de vía intraperitoneal (A) inyección; (B) tinción H y E de agarosa incrustado muestra del paciente antes de la inyección; imagen (C) de tumor sólido obtenido de un ratón catorce semanas después de i.p. inyección de células NAD (5 × 10
6); (D) tinción H y E de las células NAD ascitis de ratón embebidos en agarosa; comparación de citometría de (E) de flujo de la expresión de CA125, EpCAM y CD44 entre el paciente y de células de ascitis de ratón. Los resultados son representativos de dos muestras independientes. El histograma lleno en cada figura representa la IgG de control, líneas negras indican la expresión de proteínas en las células humanas, las líneas discontinuas indican la expresión de la proteína en las células de ascitis de ratón.
recuento de células y ensayo de proliferación
células de AD y NAD esferoides recogen de se les permitió 1 ml de ascitis de adherirse en placas de cultivo de tejido durante 24 h, después de lo cual, las células se tripsinizaron y se contaron por el método de exclusión de azul de tripano. El número de células de AD, y las células dentro de los esferoides NAD se calcularon y el porcentaje de células viables en la población de AD y esferoide NAD se evaluó mediante el cálculo del número total de células presentes en ambos AD y NAD poblaciones de 1 ml de ascitis de cada
paciente.
imágenes histológicas de (a) del tumor, (B) del hígado, (C) tracto gastrointestinal y (D) el páncreas de un ratón inyectado ip con células NAD (5 × 10
6). Las flechas en el tumor (A) indican focos de células tumorales rodeados por tejido conectivo. flechas (B-D) indican células tumorales invaden los órganos respectivos. H y E tinción de (E) de riñón y ovario (F) de un ratón inyectado con células de NAD (5 × 10
6). Las flechas indican las células tumorales que rodean los órganos sin invasión. Ampliación fue de 200 × para todos, a excepción de ovario que tenía magnificación de 100 ×, barra de escala = 50 micras.
3 [H] timidina captación de ensayo se realizó como se ha descrito anteriormente [20] . En pocas palabras, 1 × 10
5 células NAD o AD se sembraron por triplicado en placas de 24 pocillos. Después de 2, 4 y 6 días, se añadió 0,5 Ci de [
3H] timidina a cada pocillo, y se incubaron las células a 37 ° C durante 16 h más. Las células se lavaron con PBS, se recogieron y se lisaron en 1% de Triton y la incorporación de [
3H] timidina se midió por recuento de centelleo líquido (Hidex 300SL, LKB Instruments, Australia).
Distribución porcentual de células totales en el NAD y AD poblaciones de ascitis de CN (n = 5) y CR (n = 5) de los pacientes se determinó por el ensayo de exclusión de azul de tripano. Los resultados son la media ± SEM de cinco muestras independientes evaluadas por triplicado. Significativamente diferente en comparación con las muestras CR NC, ** (p & lt; 0,01).
Para la determinación de la concentración inhibitoria del crecimiento (IC50), 1 × 10
5 NAD o AD células se les permitió adherirse en placas de 24 pocillos durante 24 h en triplicado. Tanto las células NAD y AD fueron tratados con diferentes concentraciones de cisplatino (0,5 mg /ml-10 mg /ml) durante 48 h antes de la adición de 0,5 Ci de [
3H] timidina durante 16 h. El nivel de [
3H] timidina se determinó como se ha descrito anteriormente.
qPCR se realizó tal como se describe en los métodos y materiales de los NAD y AD purificados poblaciones de células aisladas de la ascitis de CN (n = 4) y CR (n = 4) muestras de ascitis. Los resultados se expresan como se describe en la Figura 5 para cuatro muestras independientes evaluaron por triplicado.
qPCR se realizó como se describe en la Figura 9 en el NAD y Ad purificados poblaciones de células aisladas a partir de muestras de ascitis NC y CR. Los resultados se expresan como se describe en la Figura 9. significativamente diferente en comparación con las muestras CR NC, * (p & lt; 0,05).
se realizó un análisis de inmunofluorescencia
El análisis de inmunofluorescencia como se ha descrito anteriormente [21 ]. Las imágenes fueron capturadas utilizando el láser Leica TCS SP2, y vistos en una estación de trabajo HP con el software de SP2 de Leica Microsystems TCS.
qPCR se realizó en células aisladas de NAD y AD como se describe en la Figura 9. Los resultados se expresan como se describe en la Figura 9. significativamente diferente en comparación con las muestras CR NC, * (p & lt; 0,05).
Los antígenos se han anotado como una expresión elevada (
+++), la expresión moderada (
++), una expresión baja (
+), y ninguna expresión (
-.)
Análisis de citometría de flujo
El método de citometría de flujo se ha descrito previamente [21]. Todos los datos fueron analizados utilizando el software Cell Quest (Becton-Dickinson, Bedford, MA, EE.UU.). Los resultados se expresan como media intensidad de la fluorescencia (MIF).
extracciones de ARN ARN de extracción y cuantitativa en tiempo real (Q-PCR)
, la síntesis de ADNc y determinación cuantitativa de los niveles de mRNA de varios genes eran realizó como se describió anteriormente [21]. Sentido y antisentido se diseñaron los cebadores contra secuencias humanas publicadas para E-cadherina, N-cadherina, vimentina, Oct4, MMP2, MMP9, EpCAM y CD44. extracción de gel de productos de PCR se realizó usando el kit de extracción de gel QIAEX II agarosa (Qiagen Australia), según el protocolo del fabricante y se cuantificó usando el ND-1000 Nanodrop espectrofotómetro (NanoDrop Technologies Inc Wilmington, DE, EE.UU.). Las secuencias y los productos se verificaron como se ha descrito anteriormente [22]. Los pares de cebadores usados incluyen 5-3 ': E cadherina (Entrez Gene ID 999, símbolo aprobado CDH1) prospectivas GGCACAGATGGTGTGATTACAG; GTCCCAGGCGTAGACCAAGAAA inversa; N-cadherina (Entrez Gene ID 1000, símbolo aprobado CADH2) orientadas hacia el AAACAGCAAGCACGGGTTA; CTTAGGATTGGGGGCAAAAT inversa; vimentina (Entrez Gene ID 7431, símbolo aprobado VIM) orientadas hacia el CCTACAGGAAGCTGCTGGAA; GGTCATCGTGATGCTGAGAA inversa; MMP2 (Entrez Gene ID 4313, símbolo aprobado la MMP-2) orientadas hacia el AAGGGGATCCAGGAGCTCTA; GCTTGTCACGTGGTGTCACT inversa; MMP9 (Entrez Gene ID 4318, símbolo aprobado MMP9) orientadas hacia el TTGACAGCGACAAGAAGTGG; GCCATTCAC inversa GTCGTCCTTAT; EpCAM (Entrez Gene ID 4072, símbolo aprobado EpCAM) orientadas hacia el CGTCAATGCCAGTGTACTTCAGTT; TCCAGTAGGTTCTCACTCGCTCAG inversa; CD44 (Entrez Gene ID 960, símbolo aprobado CD44) orientadas hacia el CCAATGCCTTTGATGGACCA; TGTGAGTGTCCATCTGATTC inversa; Oct4 Entrez Gene ID 5460, ha aprobado el símbolo POU5F1): orientadas hacia el CTCCTGGAGGGCCAGGAATC; CCACATCGGCCTGTGTATAT inversa; 18S (Entrez Gene ID 100008588, ha aprobado el símbolo RN18S1) prospectivas GTAACCCGTTGAACCCCATT; CCATCCAATCGGTAGTAGCG inversa. La expresión del ARNm de STAT3 se determinó a través de la sonda STAT3 (Applied Biosystems, Victoria, Australia). PCR en tiempo real se realizó mediante la mezcla de SYBR de Applied Biosystems ABI (Victoria, Australia) utilizando Applied Biosystems ABI 7900 HT máquina en tiempo real rápido. Los rendimientos fueron convertidos a fg (femtogramos) basado en la curva estándar para cada producto y los niveles de mRNA resultantes se normalizaron al nivel de ARNm 18S por muestra. Cada experimento se realizó de forma independiente un mínimo de tres veces.
La mayoría de los pacientes con cáncer de ovario al momento del diagnóstico (estadio IIIC /IV) presente con ascitis (CN), que consiste en las células del estroma de tipo fibroblasto y muy pocas células tumorales. La mayoría de estos pacientes (~ 80%) después de la cirugía y la primera línea de retorno de la quimioterapia contra el cáncer recurrente asociada con ascitis (CR). Durante el curso del tratamiento de quimioterapia y recaídas posteriores, el porcentaje de células estromales en la ascitis se disminuye gradualmente y el paciente con cáncer recurrente presenta con ascitis que consiste principalmente de CA125
+++ /EpCAM
+++ /STAT3
+++ quimioresistente células tumorales epiteliales NAD. Estos CA125
+++ /EpCAM
+++ /STAT3
+++ células tumorales ricos son la posible fuente de adherencias peritoneales extraovárico. Estas adherencias son la causa última de la mortalidad del paciente.
Los estudios en animales
Ética Animal comunicado.
Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y uso de los Animales de laboratorio del Consejo de Investigación médica de Australia Nacional de Salud e. El protocolo experimental fue aprobado por el Ludwig /Departamento de Cirugía, Hospital Royal Melbourne y la Universidad del Comité de Ética Animal de Melbourne (Proyecto-006/11), y fue aprobado por el Comité de Investigación y Ética de la Mujer del Hospital Royal Melbourne, Australia. /nu hembra /c nu Balb (edad, 6-8 semanas) se obtuvieron del Centro de Recursos Animales, Australia Occidental. Los animales fueron alojados en un entorno libre de patógenos estándar con acceso a comida y agua.
NAD y células de AD fueron aisladas de las ascitis de tres CR pacientes (Tabla 2). 5 × 10 por vía intraperitoneal
se inyectaron 6 células por grupo con una aguja de calibre 26 en diez ratones (seis con NAD y cuatro con células de AD). Los ratones se inspeccionaron semanalmente y la progresión del tumor se monitorizó basado en la salud general y el peso corporal hasta que se alcanzó un punto final predeterminado. criterio del punto final incluyen pérdida de peso corporal superior al 20% del peso corporal inicial, la anorexia, los patrones generales de disminución de bienestar como la reducción de movimiento y el letargo que resulta de la falta de interés en las actividades diarias. Los ratones fueron sacrificados y se recogieron los órganos (tales como el hígado, el estómago, los pulmones, el tracto gastrointestinal, páncreas, útero, músculo esquelético, colon, riñón, peritoneo, ovarios y el bazo), tumores sólidos y líquido ascítico examen más detenido. el desarrollo metastásico fue documentado por el patólogo del Hospital de la Mujer real, conforme a examen histológico (H & amp; E tinción) de los órganos. células tumorales de ascitis de los ratones se mantuvieron en placas de fijación bajas y se incrustaron en 3% de agarosa (w /v) de H & amp; E tinción. caracterización ulterior de CA125, EpCAM y la expresión de CD44 en las células recogidas de la ascitis de los ratones se realizó como se ha descrito anteriormente
Análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism (Versión 5;. GraphPad Software Inc., San Diego, CA) y Microsoft Excel. Si todo el conjunto de la muestra, los medios se han demostrado que una variación en p & lt; 0,05 por la prueba F. A continuación se realizó una prueba t paramétrico para varianzas desiguales no apareados. Los datos se consideraron significativamente diferentes si p. & Lt; 0,05
Resultados
Morfología de las células obtenidas a partir de ascitis de pacientes de cáncer
Ascitis células derivadas de ambos CN (n = 11) y los pacientes CR (n = 14) se evaluaron por microscopía de contraste de fases después de la siembra en placas de fijación bajas para 24 h. Se observaron dos poblaciones distintas de células: (i) los agregados multicelulares (esferoides) que flotaba como estructuras tridimensionales en el medio de crecimiento sin el accesorio (NAD) (Figura 1A), y (ii) las células individuales similares a fibroblastos fusiformes que adherido a las placas de fijación bajas (AD) (Figura 1 B).
Además evaluación morfológica de la población NAD reveló numerosas tres grupos dimensionales de esferoides sin apretar compactadas con un lumen central (Figura 1A). Había una considerable variación en la morfología y el tamaño de esferoides de diferentes pacientes, así como dentro de las ascitis del mismo paciente. En algunos casos, esferoides estaban en la forma de bolas apretados con un borde exterior definido, mientras que otros muestran agregados sueltos de pequeños grupos de células (Figura 1A). Después de 24 h de cultivo sobre plástico de cultivo de tejidos, la mayoría de los esferoides adjuntas y una clara transformación de una estructura tridimensional para aplanadas agrupaciones celulares que contienen varias capas de células adherentes que crecen en uno encima del otro se observó (Figura 1C). La periferia de los esferoides exhibió células alargadas en movimiento fuera de los esferoides, mientras que las células hacia el centro eran más redondeada en su estructura. A medida que las células se alejaron del núcleo central, el contacto célula-célula se redujo, lo que resulta en la desagregación de los esferoides (Figura 1C). Alternativamente, las células de AD unidos al plástico como células fusiformes alargadas y muestran una morfología similar a fibroblastos (Figura 1D).
Crecimiento de AD y derivados de células esferoide NAD como los cultivos en monocapa
el patrón de crecimiento de ambas células de AD y NAD se determinó en cultivos monocapa adherentes por
3 [H] timidina captación de ensayo. esferoides NAD se dispersaron con la pipeta y el patrón de crecimiento se comparó con células de AD. células de AD tenían casi 2 veces mayor respuesta de crecimiento en comparación con células dispersas de la población NAD (Figura 1E).
El cisplatino sensibilidad de NAD y AD Las células
Las células de los esferoides NAD se dispersaron con la pipeta y el valor de GI50 en respuesta a cisplatino se comparó con células de AD aisladas a partir de la ascitis de pacientes con cáncer de ovario (n = 3) (Figura 1F). Las células dentro de los esferoides NAD eran casi 4 veces más resistentes a cisplatino (n = 3, GI50 = 8,8 ± 0,72 mg /ml) en comparación con células de AD (n = 3, GI50 = 2,4 ± 0,28 mg /ml) (Figura 1 F ).
se determinó la determinación de los marcadores de superficie celular por citometría de flujo
expresión en la superficie celular de la FSP, EpCAM, CA125, CD44 y cyt 7 en células de AD y NAD (dispersado por tripsinización) por el flujo citometría. Se observó un alto nivel de expresión de EpCAM, CA125 y cyt 7 en las células dispersas de la población NAD, mientras que se detectó bajo /no expresión de FSP, y un nivel relativamente bajo de la expresión de CD44 fue evidente en esferoides NAD (Figura 2 ). Por otra parte, células de AD fueron positivos para FSP y CD44, con /no baja expresión detectable de CA125 y citoqueratina 7 (Figura 2). Se detectaron niveles bajos de expresión de EpCAM en células de AD. Este patrón de expresión de los marcadores de superficie celular fue consistente en todas las muestras de ascitis (n = 25). No se observó ninguna expresión de CD34, CD31 y CD45 en cualquiera de NAD o AD poblaciones mediante citometría de flujo.
Análisis de CA125, EpCAM, CD44 y madre mesenquimales marcadores de células por inmunofluorescencia
A continuación analizaron la expresión y localización de CA125, EpCAM, CD44 y marcadores de células madre mesenquimáticas en muestras de ascitis por inmunofluorescencia. De acuerdo con la citometría de flujo resultados, CA125 no fue detectado en la población AD, mientras que las células dentro de los esferoides NAD demostraron fuerte tres expresión difusa dimensional de CA125 que era prominente en las membranas periféricas de algunas células (Figura 3). Muy pocas células EpCAM-positivas estaban presentes en la población AD (Figura 3). En contraste, se observó tinción de membrana periférica denso para EpCAM en casi todos los esferoides NAD. Difusa tinción citoplásmica estaba presente en algunos esferoides, pero la tinción era mucho más fuerte en las células que recubren la periferia de los esferoides (figura 3). Por otro lado, la expresión de CD44 se limitó a la periferia de los esferoides de NAD y se detectó en las células que se movían a cabo de esferoides. Un fuerte tinción de CD44 fue evidente en la membrana de casi todas las células de AD (Figura 3) guía.
Como se ha demostrado que los fibroblastos del estroma y células madre mesenquimales (MSC) para compartir propiedades comunes [23], se evaluó la expresión de marcadores comúnmente conocidos MSC (CD90, CD73 y CD105) tanto en NAD y poblaciones de AD de ascitis muestras (Figura 4). Dispersos tinción difusa de FSP fue evidente en células de AD (Figura 4). Se observaron pocas células FSP-positivo en esferoides NAD, y éstas eran las células que se mueven fuera de los esferoides. Fuerte expresión de CD105 y CD90 estaba presente en células de AD. Se detectó la expresión de estas proteínas en todo el citoplasma y en la membrana plasmática de las células. débil expresión de CD73 estaba presente en células de AD. Por otra parte, se observó bajo /no expresión de CD90 y CD73 en esferoides NAD. Sin embargo, CD105 tinción fue evidente en muy pocas células dispersas que se mueven fuera de los esferoides (Figura 4).
Evaluación cuantitativa de marcadores selectivos representante en el ARNm nivel
A fin de evaluar las diferencias cuantitativas en la expresión de marcadores epiteliales y mesenquimales por el NAD y las poblaciones de AD, se compararon los niveles de expresión de ARNm de algunos de los marcadores por q-PCR. Las células dentro de los esferoides NAD demostraron un nivel de expresión significativamente mayor de E-cadherina y EpCAM en comparación con células de AD (P & lt; 0,01) (Figura 5). Por otra parte, células de AD demostraron un nivel de expresión significativamente alto de mRNA de vimentina y MMP9 en comparación con las células dentro de los esferoides NAD (P & lt; 0,01, p & lt; 0,05) (Figura 5). La expresión media de N-cadherina, CD44 y MMP2 apareció más alto por 2,5, 7 y 15 veces, respectivamente, en la población de AD, pero no se observó significación (p & lt; 0,2, p & lt; 0,06, p & lt; 0,17). La expresión de STAT3 y Oct4 fue significativamente mayor en comparación con la población NAD AD (p & lt; 0,05). (Figura 5)
Evaluación del potencial tumorigénico de NAD y AD Las poblaciones de ratón in vivo Modelo
para determinar el potencial tumorigénico de NAD y poblaciones AD aislados de los ascitis de tres pacientes CR por ip inoculación de 5 x 10
6 NAD o AD células por ratón. Cinco de los seis ratones inyectados con células de NAD (como una suspensión de células) (figura 6A) desarrollaron ascitis con tumores sólidos (& lt; 0,5 cm
3) (n = 3) (Figura 6C) o lesiones pequeñas (n = 2) en el peritoneo. Se observó un período de latencia tumoral de doce a catorce semanas después del trasplante. No se observaron tumores con un peso de 0,8 ± 0,2 g y ascitis (~ 0,5 ml) en los cinco ratones que desarrollaron tumores (Figura 6C). En contraste, no se observaron tumores en los ratones (n = 4) inyectado con el mismo número de células de AD incluso veinte semanas tras la administración i.p.