Extracto
células estrelladas pancreáticas (PSC) juegan un papel crucial en el comportamiento agresivo de cáncer de páncreas . Aunque la heterogeneidad de PSCs ha sido identificado, las diferencias funcionales siguen sin estar claros. Nos caracteriza CD271
+ PSC en el cáncer de páncreas humano. Inmunohistoquímica para CD271 se realizó durante 31 tejidos pancreáticos normales y 105 adenocarcinomas ductales pancreáticas (PDAC). Se realizó citometría de flujo y RT-PCR cuantitativa, y se evaluó la expresión de CD271 en el PSC aislado de los tejidos pancreáticos y los cambios en la expresión de CD271 en los PSC cocultured con células cancerosas. También se investigó el patrón de expresión CD271 en un modelo de xenoinjerto de ratón SCID. En el análisis inmunohistoquímico, las tasas de tinción CD271-alta en el estroma de páncreas en los tejidos normales de páncreas y PDAC eran 2/31 (6,5%) y 29/105 (27,6%), respectivamente (p = 0,0069). En PDAC, se observaron con frecuencia CD271
+ células del estroma en el borde más bien que el centro de los tumores. Estromal CD271 alta expresión se asoció con un buen pronóstico (p = 0,0040). Los análisis de citometría de flujo demostró tasas de CD271 positivas en el PSC estaban 0-2,1%. Los análisis cuantitativos de RT-PCR reveló que la expresión de CD271 ARNm se incrementó en PSCs después de co-cultivo con células de cáncer pancreático. Sin embargo, el nivel de expresión de CD271 ARNm se redujo posteriormente después de que el aumento transitorio. Además, la expresión CD271 ARNm se redujo en PSCs que migran hacia las células de cáncer de páncreas a través de Matrigel. En el modelo de xenoinjerto, CD271
+ PSC estuvieron presentes en el tumor márgenes /periferia y estaban ausentes en el núcleo del tumor. En conclusión, CD271 se expresa en PSCs alrededor de los tumores de páncreas, pero no en el centro de los tumores, y la expresión disminuyó después de largo cocultivo con células de cáncer pancreático o después del movimiento hacia las células de cáncer de páncreas. Estos hallazgos sugieren que CD271
+ PSC y aparecer en las primeras etapas de la carcinogénesis pancreática y que la expresión de CD271 se correlaciona significativamente con un mejor pronóstico en pacientes con PDAC
Visto:. Fujiwara K, Ohuchida K, K Mizumoto , Shindo K, Eguchi D, Kozono S, et al. (2012) CD271
+ subpoblación de células pancreáticas estrelladas se correlaciona con el pronóstico del cáncer de páncreas y está regulada por la interacción con las células cancerosas. PLoS ONE 7 (12): e52682. doi: 10.1371 /journal.pone.0052682
Editor: G. Hidayatullah Munshi, Northwestern University, Estados Unidos de América
Recibido: 19 Julio, 2012; Aceptado: 19 Noviembre 2012; Publicado: December 27, 2012
Derechos de Autor © 2012 Fujiwara et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los números de subvención JSP KAKENHI 24-1237, 23390327, 24659613, 23659654, 24390319, 22591524, 23659655, 23-11109, 24390318. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación de el manuscrito
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas es uno de los cánceres más letales, y sus 5 años tasa de supervivencia es de sólo el 4% [1]. Se caracteriza por desmoplasia excesiva, que desempeña un papel crucial en su comportamiento agresivo [2], [3]. Recientemente, la investigación en la biología del cáncer se ha centrado en las interacciones con el cáncer del estroma. Las interacciones entre las células cancerosas y tejidos estromales son esenciales para el desarrollo y la progresión de los tumores [4]. Las terapias dirigidas a las interacciones con el cáncer del estroma pueden representar un nuevo enfoque para el control del cáncer de páncreas.
células estrelladas pancreáticas (PSC) se han identificado como la fuente principal de la matriz extracelular excesiva observada en la pancreatitis crónica y el adenocarcinoma de páncreas [ ,,,0],5], [6]. Al igual que en las células estrelladas hepáticas, un tipo de células importantes para la producción de la matriz extracelular en la fibrosis hepática, PSCs almacenar gotitas de grasa que contienen vitamina A dentro de su citoplasma [7]. PSC se activan tras la estimulación por diversos factores paracrinos o autocrinos. Ellos expresan actina de músculo liso α-(α-SMA) y producen varias proteínas de la matriz extracelular [8], [9]. factores solubles secretados por PSC activadas promueven la proliferación, la migración, invasión, y la supervivencia de células de cáncer pancreático contra el tratamiento con gemcitabina [10]. Por lo tanto, PSCs juegan un papel importante en las interacciones con el cáncer de estroma en el cáncer de páncreas.
Varios informes sugieren que las células del estroma, tales como los miofibroblastos y células mesenquimales, aislado de diversos tejidos humanos exhiben diferentes fenotipos [11], [12 ]. Hemos informado anteriormente de que CD10
+ PSC mejorar la progresión de las células de cáncer de páncreas [13]. Estas observaciones indican que PSC tienen heterogeneidad funcional y además sugieren que PSCs pueden contener varios otros subpoblaciones de células que afectan individualmente o sinérgicamente la progresión del cáncer de páncreas. Caracterización detallada de los CPs en el cáncer de páncreas ayudaría a aclarar el mecanismo subyacente de las interacciones entre las células cancerosas y las células del estroma, y puede proporcionar nuevos objetivos para las terapias del estroma dirigida
.
CD271 (también conocido como el receptor del factor de crecimiento nervioso , NGFR o p75NTR) es un receptor de neurotrofina que se ha implicado en la regulación del crecimiento paracrino de un número de tipos de tumores neuronales y no neuronales [14], [15]. Los estudios recientes se han centrado en CD271 ya que se identificó como un marcador de células madre mesenquimales humanas [16] y se ha evaluado como un importante marcador de células madre de cáncer en el melanoma [17]. CD271 podría ser un marcador de una subpoblación funcional específico, como stemness. En el páncreas, la expresión de CD271 en PSCs se ha detectado [18]. Sin embargo, la expresión de CD271 disminuyó rápidamente después del aislamiento de células a partir de tejidos de páncreas [19]. Por lo tanto, el papel de la expresión de CD271 en el PSC sigue sin estar clara.
El objetivo de este estudio fue identificar las ventanillas únicas específicas que afectan a la progresión de las células cancerosas, centrándose en la expresión de CD271. Se evaluó además la importancia de la expresión de CD271 en el PSC.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Kyushu (número de autorización, 23 -64) y llevado a cabo de acuerdo con las directrices éticas para Genoma humano /Gen promulgadas por el Gobierno japonés y la Declaración de Helsinki. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado firmado la aprobación del uso de sus tejidos con fines de investigación no especificados. Para todos los experimentos con ratones, los animales fueron alojados en gabinetes de flujo laminar en condiciones libres de patógenos específicos en instalaciones aprobadas por la Universidad de Kyushu (número de autorización, A24-112-0).
Pacientes y tejidos pancreáticos
tejidos con cáncer de páncreas se obtuvieron de 105 pacientes que fueron sometidos a resección pancreática para el cáncer de páncreas en nuestra institución. Las características clínico de los pacientes se describen en la Tabla S1. La supervivencia se mide desde el momento de la resección pancreática hasta la muerte. El pronóstico se determinó en septiembre de 2011. La mediana de supervivencia global fue de 23,5 meses (rango, 1-114 meses). Sesenta y dos pacientes murieron durante el seguimiento. Todos los tejidos adyacentes a los especímenes fueron evaluados histológicamente según los criterios de la Organización Mundial de la Salud. El estadio tumoral se evaluó de acuerdo con la Unión Internacional contra el Cáncer (UICC). También se obtuvieron 31 muestras normales de páncreas (NP) de los tejidos intactos páncreas resecados para el cáncer del conducto biliar, tumor neuroendocrino del tumor o sólido-pseudopapilar benigna para su uso como control de los tejidos. Hemos recogido más de 10 neoplasias intraepiteliales pancreáticas (PanIN) y 39 muestras intraductal papilar mucinoso neoplasia (TPMI).
procedimientos inmunohistoquímicos y evaluación
La tinción inmunohistoquímica se realizó con un kit Histofine SAB-PO (Nichirei , Tokio, Japón). Los tejidos se seccionaron a un espesor de 4 micras y se incubaron con anticuerpo monoclonal de ratón anti-CD271 (1:100; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) o anticuerpo monoclonal de ratón anti-α-SMA anticuerpos (1:50; Dako, Glostrup , Dinamarca) durante la noche a 4 ° C. se consideraron células para ser inmunotinción positiva cuando la membrana o el citoplasma estaba manchada. Se identificaron los activamos PSC en base a la morfología de las células (células en forma de huso) y sus identidades se confirmaron mediante tinción de α-SMA. Se contó el número de células en al menos 10 campos por sección a 200 × magnificación. Para tener en cuenta la heterogeneidad en la expresión de CD271, la distribución de CD271 inmunotinción se evaluó como porcentaje de las células teñidas y obtuvo como sigue: 0, 0%; 1, & lt; 25%; 2, 26-50%; 3, 51-75%; o 4, 76-100%. Del mismo modo, la intensidad de la tinción se puntuó como sigue: 0, sin tinción; 1, tinción débil; 2, tinción moderada; o 3, fuerte tinción. Por último, se calculó la puntuación de tinción multiplicando el porcentaje de puntuación por la puntuación de intensidad. En las células del cáncer pancreático, hemos dividido las muestras en alta tinción & gt; 3 y baja coloración & lt; 2 grupos. Todas las diapositivas fueron evaluados de forma independiente por dos investigadores sin ningún conocimiento de las características clínicas de cada caso.
Células y condiciones de cultivo
PSC humanos fueron aisladas de muestras quirúrgicas frescas pancreáticas utilizando el método de derivación en nuestra laboratorio [5], [20]. El tipo de célula PSC se confirmó por la morfología (células estrelladas-como o en forma de huso) y por la tinción de inmunofluorescencia para α-SMA y vimentina [10], [13], [20]. PSC1 y PSC3-9 fueron aislados de cáncer de páncreas. PSC2 y PSC10 se aislaron de quiste pancreático benigno. PSC11 y PSC12 se aislaron de área pancreática normal de los tejidos de cáncer de páncreas. Además, se evaluaron dos líneas celulares de cáncer de páncreas, SUIT-2 (Ciencia Investigación de Recursos del Banco de la Salud, Osaka, Japón) y Capan-2 (American Type Culture Collection, Manassas, VA). SK-N-MC, una línea celular humana neuroepitelioma (American Type Culture Collection), fue comprado como un control positivo para la expresión CD271. Las células en pasajes de 3 a 8 se utilizaron para los ensayos. Las células se mantuvieron como se ha descrito anteriormente [21].
La tinción de inmunofluorescencia y de escaneo láser confocal
microscopía
PSC (1 × 10
5) se sembraron en placas con fondo de vidrio (Matsunami , Osaka, Japón) y se incubó durante 24 horas. En los cultivos con sobrenadante, las células se incubaron en suero fetal bovino 10% (FBS) /DMEM con sobrenadante derivado de células de cáncer pancreático durante 72 horas. Después las células se fijaron con metanol, se bloquearon con 3% de albúmina de suero bovino en solución salina tamponada con fosfato (PBS), y se incubaron con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-α-SMA (1:50; Dako), un anticuerpo monoclonal de conejo anticuerpo vimentina (1:50; Cell Signaling Technology, Beverly, MA) y un anticuerpo monoclonal de ratón anti-CD271 (1:50; Santa Cruz Biotechnology) durante la noche a 4 ° C. Posteriormente, las células se incubaron con Alexa 488 conjugada con IgG anti-ratón o 546 conjugado con IgG anti-conejo (Molecular Probes, Eugene, OR) durante 1 hora. El ADN nuclear se counterstained con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (0,05 mg /ml). Un láser confocal de barrido microscopio de fluorescencia.; Se utilizó (A1R Nicon, Tokio, Japón), y las imágenes se logró utilizando el software NIS-Elements (Nikon)
La citometría de flujo análisis
Las células cultivadas se obtenido a partir de cultivos monocapa subconfluentes y se incubaron con un isotiocianato de fluoresceína (FITC) conjugado con anti-CD271 anticuerpo (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). IgG1 de ratón de isotipo de control K FITC (Miltenyi Biotec) se utilizó como control negativo. Las células marcadas se analizaron mediante citometría de flujo utilizando un FACS Calibur (Becton Dickson and Company, Franklin Lakes, NJ).
Real-time RT-PCR cuantitativa (QRT-PCR)
El ARN total se extrajo a partir de células cultivadas utilizando un Kit de Aislamiento de RNA High Pure (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) y DNasa I (Roche Diagnostics). En tiempo real QRT-PCR se realizó utilizando un Kit QuantiTect SYBR Green transcripción inversa-PCR (Qiagen, Tokio, Japón) y un sistema Chromo4 Real-Time PCR de detección (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Los cebadores para CD271 y β-actina se adquirieron de Takara Bio Inc. (Tokio, Japón). Las secuencias de los oligonucleótidos utilizados en este estudio fueron los siguientes: CD271, 5'-TCAGTGGCATGGCTCCAGTC-3 '(hacia delante) y 5'-GCAGTATCCAGTCTCAGCCCAAG-3' (hacia atrás); ß-actina, 5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3 '(hacia delante) y 5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3' (hacia atrás). Cada mezcla de reacción se incubó inicialmente a 50 ° C durante 30 min para permitir la transcripción inversa. a continuación, la amplificación por PCR se inició mediante incubación a 95 ° C durante 15 min para activar la polimerasa, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 5 s, 60 ° C durante 20 s, y 72 ° C durante 30 s. Los niveles de expresión de genes se calcularon usando una curva estándar construida utilizando ARN total a partir de células SK-N-MC. Los niveles de expresión se normalizaron a las beta-actina niveles de expresión como un control interno, y se expresan como la relación de la expresión del gen diana a la de la β-actina. Todas las muestras se realizaron por triplicado. No hay productos de PCR se amplificaron detectables sin transcripción inversa previa. La precisión y la integridad de los productos de la PCR se confirmaron usando un Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Palo Alto, CA).
cocultivo in vitro sistema En
in vitro
co-cultivos se realizaron mediante el cultivo de células de 6 pocillos insertar placas de compañía y los insertos de cultivo celular de 3.0 micras (Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ) como se describe anteriormente [22]. células SUIT-2 y Capan-2 (5 × 10
5) se sembraron separadamente en las cámaras superiores a las 24 horas después de la siembra de dos tipos de PSC (5 × 10
5) en las cámaras inferiores.
Cultura con un sobrenadante derivado de células de cáncer
células SUIT-2 y Capan-2 se cultivaron en FBS libres condiciones durante 48 horas. A partir de entonces, se recogieron los sobrenadantes de las células cancerosas y las ajustó a 10% de FBS. Los sobrenadantes derivados de células cancerosas se añade a PSC sembradas previamente para el cultivo posterior.
La separación funcional de ensayo de invasión de Matrigel
seis pocillos placas de cultivo celular de inserción de compañía y de 8,0 micras insertos de cultivo celular (Becton Dickinson Labware) se revistieron con Matrigel (150 mg /pocillo; BD Biosciences, Bedford, MA). PSC (5 × 10
5 células /2 ml) se sembraron en las cámaras superiores. Anteriormente, las células cancerosas (5 × 10
5) se sembraron en las cámaras inferiores. Después de esto, se cultivaron las células durante 72 horas. Posteriormente, hemos eliminado las células de ambos lados de las cámaras superiores utilizando tripsina. Después de dos centrifugaciones, se extrajeron los ARNm de las células. Cada experimento se llevó a cabo en pocillos por triplicado, y los experimentos independientes se repitieron tres veces.
Los experimentos in vivo
SUIT-2 células de cáncer de páncreas y dos tipos de PSC se utilizaron para
In vivo
experimentos. Las células se dividieron en tres grupos, que comprende células SUIT-2 solo, Traje-2 células con células PSC1, y las células SUIT-2 con células PSC2. células SUIT-2 (5 × 10
5) y PSC (5 × 10
5) suspendido en 100 l de PBS fueron cotransplanted en la cola del páncreas, de 6 semanas de edad, los ratones SCID hembra (FOX CHASE SCID® , CB-17 /LCR-SCID /scidJcl; Clea Japan Inc., Tokio, Japón). Seis ratones fueron utilizados en cada grupo. Los tumores se resecaron en los días 8, 15 y 22 después de la implantación. Los tejidos se fijaron en 10% de formalina tamponada neutra y embebidos en parafina. Cuatro micras secciones de tejido se tiñeron con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-α-SMA (Dako) y un anticuerpo monoclonal anti-CD271 conejo de anticuerpos (Millipore, Billerica, MA).
El análisis estadístico
Valores se expresan como media ± SD. Las comparaciones entre los dos grupos se realizaron mediante Estudiante de
t-test
. La significancia estadística se definió como valores de p & lt; 0,05. Se utilizó una χ
2 test para analizar las correlaciones entre la expresión de CD271 y las características clínico-patológicas observadas en el análisis inmunohistoquímico. Los análisis de supervivencia se realizaron utilizando el método de Kaplan-Meier y las curvas se compararon mediante la prueba de log-rank. Para evaluar los factores pronósticos independientes asociados con la supervivencia, se utilizó un análisis de regresión de riesgos proporcionales de Cox, con la expresión de CD271, categoría pT, metástasis en los ganglios linfáticos, el escenario de la UICC, la invasión perilinfática, invasión perivascular, y el margen patológica como covariables. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software JMP 8.0 (SAS Institute, Cary, NC).
Resultados
Las células estromales expresan CD271 en el adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC)
Para evaluar la expresión de CD271 en tejidos pancreáticos, se realizó inmunohistoquímica de CD271. De acuerdo con un informe anterior [23], se observó una fuerte tinción de los nervios como un control positivo. Las células epiteliales de los conductos pancreáticos normales no mostraron expresión de CD271, y las células fueron PDAC sin teñir. En el páncreas normal (NP), las células estromales de todo el conducto pancreático rara vez se tiñeron (Figura 1A-a). Sin embargo, se observó que las células del estroma fueron fuertemente teñidas alrededor de neoplasia intraepitelial pancreáticos (PanIN) (Figura 1A-b) y neoplasia papilar mucinosa intraductal (TPMI) (Figura 1A-C). En los tumores PDAC, las células estromales alrededor de las células de cáncer de páncreas se tiñeron en parte. Sin embargo, CD271
+ células del estroma no eran adyacentes a las células de cáncer en PDAC, y fueron fuertemente teñidas en el borde más bien que el centro de los tumores (Figura 1A-D). CD271 alta tinción en las células del estroma estaba presente en el 6,5% (2/31) de la PN, el 30,0% (3/10) de PanIN, el 27,6% (29/105) de PDAC y el 84,6% (33/39) de TPMI. Las altas tasas de tinción CD271 fueron significativamente mayores en las células del estroma de IPMN (p & lt; 0,0001). Y PDAC (p = 0,0069) que los de las células del estroma de NP (Tabla 1)
(A) Tinción inmunohistoquímica para CD271 en tejidos pancreáticos. (A-a) En el páncreas normal (NP), las células del estroma rara vez se tiñen positivo para CD271. (A-B, -c) Las células estromales están fuertemente teñidas alrededor de neoplasia intraepitelial pancreáticas (PanIN) (b) y neoplasia papilar mucinosa intraductal (TPMI) (c). (A-D) en los adenocarcinomas ductales pancreáticas (PDAC), las células estromales se tiñen en parte, y CD271
+ células del estroma no son adyacentes a las células de cáncer de páncreas. puntas de flecha negras y las flechas indican CD271
+ células y los nervios como control positivo en las secciones de serie. (A-E) α-actina de músculo liso (SMA) se expresa células estromales más alrededor de las células de cáncer y túbulos neoplásicas. puntas de flechas blancas indican las células alfa-SMA en las secciones de serie. Aumento original: 200 ×, inserciones: 600 ×. (B) Análisis de supervivencia de Kaplan-Meier para CD271 alta expresión en el estroma del PDAC. Estromal CD271 alta expresión se asocia con un buen pronóstico (p = 0,0040).
expresión del estroma CD271 correlacionado de forma independiente con buen pronóstico
Se evaluaron las correlaciones entre la expresión del estroma y CD271 los factores clínico-patológicas de PDAC. Aunque las diferencias no alcanzaron significación estadística, pT1 /pT2, sin metástasis ganglionares, la UICC etapa I, ninguna invasión perilinfática, sin invasión perivascular, y el margen patológica /negativas se observaron con mayor frecuencia en el grupo de tinción CD271high estroma que en el estroma CD271 baja grupo tinción (Tabla 2). Curiosamente, la expresión del estroma CD271 se asoció con un buen pronóstico en el cáncer de páncreas (p = 0,0040) (Figura 1B). La mediana del tiempo de supervivencia para CD271 tinción de alta y baja de tinción CD271 pacientes fueron 62 y 18,5 meses, respectivamente. A continuación, se realizó un análisis multivariado de la supervivencia basada en el modelo de riesgo proporcional de Cox para todos los parámetros que se consideren significativos en los análisis univariados, incluyendo la expresión del estroma CD271, categoría pT, metástasis de ganglios linfáticos, el escenario de la UICC, la invasión perilinfática, invasión perivascular, y el margen patológica positividad (Tabla S2). CD271 expresión del estroma resultó ser un marcador independiente de pronóstico en pacientes con cáncer de páncreas, y el riesgo relativo de expresión del estroma CD271 fue 0.495 (Tabla 3).
CD271 células estromales son una subpoblación de PSC activadas
para caracterizar el CD271
+ células del estroma, se realizó inmunohistoquímica de α-SMA, un marcador de PSC activadas, en las secciones de serie PDAC. Se encontró que el α-SMA se expresó en la mayoría de las células del estroma alrededor de las células de cáncer y túbulos neoplásicas (Figura 1a-e). CD271
+ células del estroma fueron restringidos a áreas con fuerte expresión α-SMA. Estos hallazgos indican que CD271
+ células estromales son una subpoblación de PSC activadas.
expresión de CD271 en el PSC humanos
Se aislaron cinco cultivos primarios de las ventanillas únicas de los tejidos pancreáticos humanos frescos, y su identidad fue confirmada por tinción de inmunofluorescencia. PSC eran estrelladas o de tipo fusiforme y expresó α-SMA y vimentina (Figura 2A). En estos análisis de inmunofluorescencia, que no detectó la expresión de CD271 en el PSC (datos no mostrados). A continuación, se evaluó la expresión de CD271 en 12 cultivos primarios de PSC humanos mediante citometría de flujo, y encontramos las tasas de CD271 positivas de 0,0 a 2,1% en el PSC (Figura 2B).
(A) microfotografía Representante de la tinción de inmunofluorescencia para alfa-actina de músculo liso (SMA) (verde) y vimentina (rojo) en el PSC. Los núcleos se counterstained con 4 ', 6-diamino-2-fenilindol (azul). PSC muestran una morfología estrellada o de tipo fusiforme y expresan α-SMA. Aumento original: 200 ×. (B) Las tasas positivas de la expresión de CD271 en los CRP son 0,0 a 2,1% en citometría de flujo análisis. También se muestran imágenes de citometría de flujo representativos de CD271 en los PSC activadas (derecha).
CD271
+ PSC se incrementan a través de interacciones con el cáncer del estroma
Se investigaron los efectos del PSC en el fenotipo de las células cancerosas usando un sistema de cocultivo. Se han utilizado dos líneas celulares de cáncer de páncreas, Traje-2 y Capan-2, y dos cultivos primarios de PSC humanas aisladas de PDAC y quistes pancreáticos benignos. Después de monocultivo o co-cultivo con células de cáncer de páncreas durante 72 horas, se evaluó la expresión de CD271 en el PSC utilizando citometría de flujo y en tiempo real QRT-PCR. Por flujo de análisis de citometría, se observó el porcentaje de CD271
+ células fue mayor en cocultivo que en monocultivo (0,7% vs. 0,1%) (Figura 3A). Por analiza en tiempo real QRT-PCR, el nivel de expresión mRNA CD271 en dos cultivos de PSCs fue significativamente mayor en cocultivo con células de cáncer pancreático que en el monocultivo (p & lt; 0,001) (Figura 3B). A continuación, se recogieron los sobrenadantes de las células de cáncer de páncreas SUIT-2, y lo añadió a dos cultivos primarios de PSC. Se compararon los niveles de expresión de ARNm de CD271 entre los monocultivos, cultivos con el sobrenadante derivado de las células del cáncer, y co-cultivos con células de cáncer de páncreas durante 72 horas. El nivel de expresión CD271 mRNA fue más alta en co-cultivos con células de cáncer pancreático. Además, el nivel de expresión de CD271 mRNA fue mayor en cultivos con el sobrenadante del cáncer derivado de células que en los monocultivos (p = 0,0053) (Figura 3C). Por análisis de inmunofluorescencia, se detectó la expresión de CD271 en PSCs se aumentó ligeramente en cultivo con el sobrenadante derivado de células de cáncer en contraste con monocultivos (Figura 3D).
(A) En los análisis de citometría de flujo, el porcentaje de CD271
+ es más alta en cocultivo que en monocultivo (0,7-0,8% vs. 0,1%). (B) Los niveles de expresión de ARNm de CD271 en dos culturas del PSC son significativamente mayores en los co-cultivos con células de cáncer pancreático que en monocultivos (p & lt; 0,001). (C) El nivel de expresión de ARNm de CD271 es más alta en las culturas con un sobrenadante derivado de células de cáncer que en los monocultivos (p = 0,0053). (D) microfotografía Representante de la tinción de inmunofluorescencia para CD271 (verde) y α-actina de músculo liso (SMA) (rojo) en el PSC. Los núcleos se counterstained con 4 ', 6-diamino-2-fenilindol (azul). CD271 en el PSC se expresó poco en cultivos con cáncer de sobrenadante derivado de células, aunque era difícil de detectar la expresión de CD271 en los monocultivos. Aumento original: 200 ×. * P & lt; 0,01; ** P & lt;. 0.001
expresión de CD271 disminuye después de que el aumento transitorio de expresión cuando cocultured con células de cáncer de páncreas
Se utilizó un sistema de co-cultivo que consiste en dos líneas celulares de cáncer de páncreas, JUEGO culturas -2 y Capan-2, y dos primarias del PSC humanos para evaluar los cambios dependientes del tiempo en la expresión de CD271 ARNm. Después de monocultivo o co-cultivo de PSC con células de cáncer de páncreas de 1 a 5 días, se evaluó el nivel de expresión de ARNm CD271 en el PSC. En los monocultivos, la expresión de CD271 mRNA en PSC no cambió. Sin embargo, en co-cultivos con células de cáncer de páncreas, el nivel de expresión mRNA CD271 aumentó en el día 3 (p = 0,0249) y alcanzó el día 4 (p & lt; 0,0001). Curiosamente, los niveles de expresión de CD271 mRNA disminuyó el día después de la expresión pico (p & lt; 0,0001) (Figura 4A). A continuación, se recogieron los sobrenadantes de las células Capan-2 células de cáncer de páncreas, lo añadió a dos cultivos primarios de PSC y evaluamos los cambios dependientes del tiempo en la expresión de CD271 ARNm. En los cultivos con sobrenadante, el nivel de expresión mRNA CD271 aumentó en día 2 (p & lt; 0,0001) y después se disminuyó en el día 4 (p & lt; 0,0001) (Figura 4B). Al igual que en cocultivo con células de cáncer de páncreas, la expresión de CD271 se redujo después del aumento transitorio de la expresión cuando se cocultivaron con sobrenadante
.
(A) análisis en tiempo real QRT-PCR mostró que los niveles de expresión de CD271 mRNA en PSCs en cocultivo con células de cáncer de páncreas comienzan a aumentar en el día 3 (p = 0,0249), son más altas en el día 4 (p & lt; 0,0001), y luego disminuir el día siguiente después de la pico de expresión (p & lt; 0,0001). (B) En los cultivos con la adición de sobrenadante derivado de células de cáncer, el nivel de expresión de CD271 mRNA comenzó a aumentar en el día 2 (p & lt; 0,0001) y luego disminuyó en el día 4 (p & lt; 0,0001). (C) Evaluación de las diferencias en la expresión de CD271 dependiendo de la función de PSCs por tiempo real QRT-PCR. El nivel de expresión del ARNm de CD271 en los mejores PSC derivadas laterales, que no se movieron hacia las células cancerosas a través de Matrigel y se mantuvieron en cámaras superiores, es menor que en las ventanillas únicas derivadas laterales de fondo, que se movió hacia las células de cáncer de páncreas a través de Matrigel (p & lt ; 0,01). * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01; *** P & lt; 0,001; NS: no significativo.
expresión de CD271 se encuentra disminuida en los PSC que migran a través de Matrigel hacia las células de cáncer de páncreas
A continuación, se evaluó la expresión de CD271 en el PSC después de la separación funcional utilizando ensayo de invasión de Matrigel. En este sistema de cultivo que implica cámaras superiores recubiertas con Matrigel, evaluamos SUIT-2 células de cáncer de páncreas y dos cultivos primarios de PSC humanos. PSC en las cámaras superiores se incubaron durante 72 horas en cultivo con células de cáncer de páncreas en las cámaras inferiores, o como controles sin células de cáncer de páncreas en las cámaras inferiores. PSC se obtuvieron de los lados superior e inferior de las cámaras superiores por separado. Los derivados secundarios PSC-top eran células que no migraron hacia las células cancerosas a través del Matrigel y se mantuvo en las cámaras superiores. Las PSCs derivados secundarios de fondo eran células que migraron hacia las células de cáncer pancreático a través de Matrigel y se recogió sobre el lado inferior de las cámaras superiores. A continuación analizaron los niveles de expresión de ARNm de CD271 en las ventanillas únicas derivadas laterales superiores o inferiores para evaluar las diferencias funcionales entre CD271
+ y CD271
- PSC. El nivel de expresión CD271 mRNA fue más alta en los mejores PSCs derivados secundarios-después del cultivo con las células de cáncer de páncreas (p & lt; 0,001). Curiosamente, el nivel de expresión de ARNm de CD271 en los PSCs derivados secundarios de fondo que migran hacia las células de cáncer de páncreas fue menor que en los PSCs derivados secundarios-top que no se movían hacia las células de cáncer (p & lt; 0,01). En los controles, no se encontraron diferencias en los niveles de expresión de ARNm de CD271 entre la parte superior y laterales PSC derivada de fondo, y estos niveles eran bajos en comparación con los niveles de expresión de ARNm de CD271 en cultivos con células de cáncer de páncreas (Figura 4C).
CD271
+ PSC están presentes en el tumor márgenes /periferia y están ausentes en el núcleo del tumor
Para evaluar la localización de CD271
+ PSC
in vivo
, se trasplantaron SUIT -2 células de cáncer de páncreas en la cola del páncreas de ratones SCID, o ellos cotransplanted con dos cultivos primarios de PSC humanos. Nos practicó la eutanasia a los ratones en los días 8, 15 o 22, y se evaluó la localización de CD271
+ PSC en los xenoinjertos de tumores. expresión del estroma CD271 se detectó en todos los días después del trasplante, independientemente de trasplante o cotransplantation. altas tasas de tinción del estroma CD271 eran 50% (3/6), 60% (3/5) y 67% (4/6) en los días 8, 15, y 22, respectivamente. En todos los casos, se detectó la expresión de CD271 en manojos de nervios como un control positivo, y encontramos que las células de cáncer de páncreas no expresan CD271. Se confirmó la presencia de PSC activadas por una morfología en forma de huso y por la tinción de α-SMA. PSC activadas existían en los xenoinjertos de tumores pancreáticos y áreas normales alrededor de los tumores (Figura 5A). Sin embargo, CD271
+ PSC sólo existía en las áreas normales de páncreas alrededor de los tumores de xenoinjertos, y estaban ausentes en el núcleo del tumor (Figura 5B).
(A) α-SMA
+ células estromales , como PSC activadas, existen en el xenoinjerto de tumor y áreas páncreas normal (NP) (lado izquierdo) alrededor de la (lado derecho) del tumor. (B) A pocas CD271
+ células estromales estaban presentes en el área NP (lado izquierdo) alrededor del tumor de xenoinjerto, y estaban ausentes en el núcleo del tumor (lado derecho). Aumento original:. 200 ×
Discusión
Anteriormente, Trim et al, [18] informó de que CD271 se expresa en las ventanillas únicas.. Haas et al., [19] también informó de que CD271 se expresa ligeramente en PSCs y que el nivel de expresión de CD271 mRNA disminuyó rápidamente en PSCs primarios de rata durante el cultivo. Se encontró que el CD271
+ PSC existían en los tejidos pancreáticos quirúrgicos mediante inmunohistoquímica. Sin embargo, QRT-PCR y citometría de flujo análisis revelaron que la expresión de CD271 en PSCs aisladas de tejidos pancreáticos era muy débil. Estos hallazgos sugieren que la expresión CD271 en PSCs humanos primarios también disminuyó rápidamente durante el cultivo.
Hemos encontrado que la expresión de CD271 mRNA se aumentó transitoriamente en PSCs cocultivaron con células de cáncer pancreático, lo que sugiere que las células de cáncer de páncreas mejorar la expresión CD271 en PSCs. Sin embargo, el presente análisis inmunohistoquímicos revelaron que CD271
+ PSC también existían alrededor PanIN y TPMI, lesiones precancerosas. Por otra parte, Recorte y col., [18] informó de que CD271
+ PSC se encuentran en los tejidos de los pacientes con pancreatitis crónica. Estas observaciones sugieren la aparición de CD271
+ PSC no es específico de enfermedades malignas, y se relaciona con desmoplasia.