Extracto
mayor expresión Lin28 está asociada con respuestas tumorales patológicas peores en forma local avanzadas pacientes con cáncer gástrico sometidos a quimioterapia neoadyuvante. Sin embargo, las características de Lin28 y su mecanismo de acción en la resistencia a la quimioterapia sigue siendo poco clara. En este estudio, encontramos que la transfección de Lin28 en células de cáncer gástrico (MKN45 y MKN28) aumentaron su resistencia a la quimio-drugs oxaliplatino (OXA), paclitaxel (PTX), doxorrubicina (ADM), y fluorouracilo (5-FU) en comparación con células de cáncer gástrico transfectadas con un vector de control. Cuando se evaluó la expresión de derribo Lin28 Lin28 por pequeños ARN de interferencia (siRNA) in vitro, se encontró que la resistencia a la quimio-drogas se redujo. Por otra parte, se encontró que Lin28 hasta regula C-myc y P-gp y regula a la baja Cylin, D1. Por último, encontramos que el miR-107 es un microARN de Lin28 objetivo y que participa en el mecanismo de resistencia a la quimioterapia. Nuestros resultados sugieren que la vía de Lin28 /miR-107 podría ser una de las muchas vías de señalización reguladas por Lin28 y asociados con el cáncer gástrico quimio-resistencia
Visto:. Teng R, Hu Y, Zhou J, Seifer B, Chen Y, Shen J, et al. (2015) La sobreexpresión de Lin28 Disminuye la quimiosensibilidad de células de cáncer gástrico a oxaliplatino, paclitaxel, doxorrubicina y fluorouracilo en parte a través de microARN-107. PLoS ONE 10 (12): e0143716. doi: 10.1371 /journal.pone.0143716
Editor: Natasha Kyprianou, Universidad de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos |
Recibido: 23 Junio, 2015; Aceptado: 8 de noviembre de 2015; Publicado: 4 de diciembre 2015
Derechos de Autor © 2015 Teng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
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Financiación:. Hubo apoyo de la Fundación Provincial de Zhejiang Ciencias Naturales de China: LQ13H160014 [http://www.zjnsf.gov.cn/b/home.aspx] .
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico es un tumor maligno sistema digestivo clínica común con una tasa de mortalidad que ocupa el tercer en el mundo [1]. Nuestro país es un área que es propenso al cáncer gástrico. En los últimos años, la quimioterapia neoadyuvante se ha administrado a pacientes con cáncer gástrico para prolongar la supervivencia. No obstante, la tasa de supervivencia a 5 años de los pacientes con cáncer gástrico avanzado es todavía inferior al 30% [2]. resistencia a la quimioterapia es la causa principal del fracaso de cáncer gástrico y otros tratamientos de tumores. Por lo tanto, el mecanismo de la resistencia a la quimioterapia del cáncer gástrico es actualmente una preocupación importante en los estudios de cáncer gástrico.
Lin28 es una proteína de unión a ARN altamente conservada que se ha demostrado para participar en la inducción de células madre pluripotentes y en el mantenimiento de vástago células similares a las células de cáncer. Estudios recientes han informado de que la activación aberrante de Lin28 se correlaciona bien con el pronóstico de los diferentes tipos de cáncer, incluyendo cáncer de mama, de ovario, de pulmón, de colon, y cáncer de hígado [3-6]. Nuestro estudio anterior mostró que la expresión Lin28 también se asocia con una pobre supervivencia en pacientes con cáncer gástrico [7], y otro estudio demostró que la expresión de Lin28 se correlaciona con la resistencia a paclitaxel en células de cáncer de mama humano [8]. Por otra parte, la expresión Lin28 se asocia con la respuesta tumoral patológico en pacientes con cáncer gástrico localmente avanzado que reciben quimioterapia neoadyuvante. Sin embargo, el mecanismo molecular que subyace a estos hallazgos aún no está claro [9].
Lin28 promueve la tumorigénesis mediante la represión de miRNAs supresores de tumores tales como la familia let-7, que se asocia con la resistencia a los medicamentos [8]. Sin embargo, como los genes miARN objetivo de Lin28, miR-107 rara vez se menciona como un factor de resistencia a los medicamentos en el cáncer gástrico. expresión miR-107 se reduce en una variedad de neoplasias malignas, como el cáncer de colon, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de páncreas y cáncer gástrico [10-13]. MIR-107 regula los genes aguas abajo que están implicados en la diferenciación celular y la proliferación, el metabolismo, las respuestas al estrés y la formación de vasos sanguíneos [10-14]. En este estudio, se investigó la vía Lin28 /miR-107 y su papel en la resistencia celular de cáncer gástrico a la quimioterapia. Es posible que hayamos identificado un nuevo objetivo potencial para el cáncer gástrico resistente a la quimioterapia.
Materiales y Métodos
1. Cultivo de células y transfección del plásmido
Las líneas celulares de cáncer gástrico humano MKN-28 y MKN-45 se obtuvieron como un regalo del profesor Sung Hoon Noh (Yonsei University College of Medicine, Seúl, Corea). Las células se cultivaron en medio RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) suplementado con 10% de suero bovino fetal (MP Biomedicals, Costa Mesa, CA, EE.UU.) en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO2 a 37 ° DO. El oxaliplatino, paclitaxel, doxorrubicina y fluorouracilo se compraron a Sigma (St. Louis, MO). El plásmido pcDNA3.1-Lin28 se transfectó con Xtreme GENE HP reactivo de transfección de ADN (Roche Applied Science, Mannheim, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. clones que expresan Lin28 estables fueron seleccionados más y se cultivaron con el medio RPMI 1640 que contiene neomicina apropiado.
2. -PCR cuantitativa en tiempo real
en tiempo real Q-PCR se realizaron análisis con el ABI Prism 7500 secuencia sistema de detección (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). En pocas palabras, una mezcla de reacción de 20 l que contiene 2 l de cDNA plantilla y 1 l cada uno de los cebadores sentido y anti-sentido (sistema de Promega GoTaq q-PCR® Mix Master, Madison, WI, EE.UU.) se amplificó como sigue: desnaturalización a 95 ° C durante 10 min y 40 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 60 ° C durante 30 s, y 72 ° C durante 40 s. En tiempo real las reacciones q-PCR se realizaron por triplicado para cada muestra, y se utilizó el valor medio para el cálculo de los niveles de mRNA. El análisis cuantitativo se realizó mediante el método comparativo CT. El número de copias Lin28 y miR-107 en los tejidos tumorales se normalizaron a los mRNA número de copias del gen de limpieza gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) para obtener el valor 2
-Δ CT. El primer secuencias son como sigue en la Tabla 1.
3. De células resistentes a los medicamentos Ensayo
La viabilidad celular se midió utilizando un MTT [3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio] ensayo (Amresco, Solon, OH, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 5 * 10
3 células por pocillo. Después del tratamiento, las células se incubaron con 5 mg /ml de MTT durante 4 h. A continuación, se retiró el medio y se añadió 150 ml de solución de DMSO esterilizada, seguido de incubación a 37 ° C durante 4 h. Se obtuvo el valor de DO en el nm longitudes de onda de 570 y 630 nm. El valor de OD (570 nm a 630 nm) puede reflejar indirectamente el número de células y la actividad de acuerdo con la siguiente fórmula: Tasa de supervivencia = grupo dosificado OD570-630 /no OD570-630 grupo de dosis. A continuación, se genera una curva de concentración de la supervivencia celular /drogas.
4. Análisis Western Blot
Los lisados celulares se separaron por electroforesis en un minigel 4-15% de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida en gradiente (SDS-PAGE) (Bio-Rad, Hercules, CA) y se transfirió electroforéticamente a una membrana de nitrocelulosa (Amersham Pharmacia , Piscataway, NJ). Western blots se probaron con anticuerpos contra Lin28, GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), caspasas y caspasas escindidos, ciclina D1, NF-kB (Señalización Celular, Beverly, MA), CDK6, C-myc (Abcam Trading ( Shanghai) Company, Shanghai, china), P-gp, y Bcl-2 (Huan Biotecnología, Beijing, china). Las bandas de proteínas se detectaron mediante quimioluminiscencia potenciada (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ).
5. Ensayo de citometría de flujo
Las células (2 * 10
5 por pocillo) se sembraron en una placa de seis pocillos y tratados con paclitaxel. Después de 72 h, las células fueron fijadas en etanol al 70% y se tiñeron con yoduro de propidio (PI). El contenido de ADN se analizó con un Epopeyas flujo de Perfil II citómetro (Beckman Coulter, Fullerton, CA) con el software de multiciclo (Phoenix Flow Systems, San Diego, CA). Todos los experimentos se repitieron al menos dos veces. PI también se utiliza en conjunción con anexina V (BD Biosciences, San Jose, CA) para determinar si las células eran viables, apoptosis o necrosis.
6. MIRNA Transfección y Detección
Las células se sembraron en placas de cultivo de seis pocillos y se transfectaron con 50 nM pre-miR-107 adquirido de Applied Biosystems (Carlsbad, CA) o el control de pre-miARN de acuerdo con el protocolo del fabricante. Cuantitativa en tiempo real cadena de la polimerasa La reacción (PCR) se realizó utilizando el TaqMan MicroARN Reverse Transcription Kit y el rápido sistema de PCR en tiempo real (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) de acuerdo con los protocolos del fabricante. El cambio veces en los niveles de miR-107 microARN se calculó y se normalizaron a un control de carga HSA-mir-423.
7. Animales
ratones BALB /c de 3-4 semanas de edad que pesaban 18-22 g fueron adquiridos de la empresa SLAC animal de laboratorio (SCXK-2007-004, Shanghai, China) y alojan cinco por jaula en un libre de patógenos específicos (SPF) medio ambiente. Los animales se les permitió aclimatarse a las instalaciones de la vivienda durante 7 días antes del inicio de los experimentos. procedimientos de manejo de animales se realizaron de conformidad con la legislación P. R. China sobre el uso y cuidado de los animales de laboratorio y aprobados por el Comité Ético de Experimentación Animal de la Universidad de Zhejiang (Zhejiang, China).
8. Xenoinjerto de ensayo y tratamiento
Brevemente, se inyectaron grupos de seis ratones BALB /c por vía subcutánea con 1 * 10
6 MKN45 /Lin28, MKN45 /Vector, o MKN45 células en el flanco derecho. El volumen del tumor se calculó utilizando la fórmula: V = 1/2 *
a
*
b
2, donde
a
y
b
son los más largos y más cortos los diámetros de la masa tumoral (en milímetros), respectivamente. Cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 80 mm
3, los ratones fueron tratados con inyección de ADM (50 mg /kg) y OXA (5 uM /kg) cada semana durante 2 semanas. Los cambios cuantitativos en el peso y el volumen del tumor se midieron cuerpo cada tres días por un solo individuo, utilizando una balanza y calibres Vernier. No hay anestésicos fueron utilizados en los experimentos con ratones.
9. El análisis estadístico
Todos los experimentos se llevaron a cabo tres veces con muestras por triplicado. Análisis de la varianza y la prueba t de Student se utilizó para comparar los valores de las muestras de ensayo y de control. Un valor de p inferior a 0,05 se consideró estadísticamente significativa. el software Statistica 6.1 se utilizó para todos los análisis estadísticos. La significación se evaluó por el test t de Student.
Resultados
1. Las pruebas in vitro de los cambios de sensibilidad quimioterapia en células de cáncer gástrico expresaban de forma estable Lin28
Se seleccionaron dos cepas de células de cáncer gástrico con la expresión Lin28 negativo (MKN45 y MKN28) y cultivadas. Se identificaron células de cáncer gástrico con la expresión Lin28 estable a partir de clones transfectados resistentes (MKN45 /Lin28 /C2 y MKN28 /Lin28 /C3) mediante Western Blot y q-PCR (Fig 1).
(A). línea celular de cáncer gástrico MKN45 y MKN 28 con Lin28 sobreexpresión se establecieron a través de Lin28 plásmido transfección, expresión Lin28 se detectó por Western-blot. (B). el nivel de ARNm de Lin28 fue detectado por QRT-PCR, cada punto de datos representa la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. (** P & lt; 0,01). (DO). MKN45 con Lin28 sobreexpresión mostró una mayor resistencia a OXA, PTX, ADM, 5-Fu. (RE). MKN28 con Lin28 sobreexpresión mostró una mayor resistencia a OXA, PTX, ADM, 5-Fu.
El seleccionado MKN45 /Lin28C2, MKN45 /vector, MKN45, MKN28 /Lin28C3, MKN28 /vector y las células MKN28 se ensayó la sensibilidad a los medicamentos de quimioterapia. Se seleccionaron los siguientes cuatro fármacos de quimioterapia clínicos utilizados comúnmente para el tratamiento del cáncer gástrico: OXA, PTX, ADM, y 5-FU. El tratamiento con OXA, PTX, y ADM duró 48 horas, mientras que el tratamiento de 5-FU se prolongó durante 72 horas. Después de Lin28 transfección, las células MKN45 y MKN28 tenían una sensibilidad disminuida al OXA, PTX, ADM, y 5-Fu que fue más pronunciada para OXA y PTX. Los valores de IC50 fueron más del doble que la del grupo control (Fig 1).
Sobre la base del ensayo de MTT, se utilizó citometría de flujo para detectar las diferencias en la apoptosis entre las células Lin28-positivos y negativos-Lin28 después de la quimioterapia exposición PTX. El MKN45 /Lin28, grupos de células MKN45 MKN45 /Vector y recibió 0 M y 0,1 M de tratamiento PTX durante 24 horas, y la doble tinción se realizó para detectar la apoptosis de células. La tasa de apoptosis de las células transfectadas Lin28 fue menor que la de las células no transfectadas (p & lt; 0,05). Además, transferencias de Western de proteína obtenidos de células tratadas con 0,1 M PTX mostraron que la apoptosis se redujo en las células MKN45 /Lin28 como se muestra por las disminuciones en la activación de la caspasa 9 y caspasa 3 (Fig 2).
( A y B). Se visualiza tasa de apoptosis de MKN45 /Lin28, MKN45 /vector, MKN45 tratados con PTX en 0.1um. Los datos mostraron MKN45 /Lin28 tenía menos tasa de apoptosis de MKN45 /vector y MKN45. Cada punto de datos representa la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. (* P & lt; 0,05). (DO). caspase9 Cleaved- y caspase3 fueron detectados por Western blot. casepase Cleaved- 9 y 3 casepase se redujeron en MKN45 /Lin28.
La transfección transitoria de siARN-Lin28 Lin28 debería inhibir los niveles de expresión en MKN45 /Lin28 y MKN28 /Lin28 células 48 horas después de la transferencia de acuerdo con la directrices experimentales del fabricante de los reactivos. se detectó la expresión de proteínas Lin28, y la sensibilidad a los fármacos asociada fue probado. la expresión del ARN Lin28 en células de cáncer gástrico se detectó por q-PCR, mientras que la expresión de proteínas se detectó mediante transferencia de western (Fig 3).
(A) .MRNA nivel de Lin28 Lin28 después de caída se detectaron mediante qRT-PCR a las 48 h, 72 h después de la transfección en MKN45 /Lin28 C2 y MKN28 /Lin28 C3. Cada punto de datos representa la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. (** P & lt; 0,01, * p & lt; 0,05). (B). el nivel de proteína de Lin28 en MKN45 /Lin28 C2 y MKN28 /Lin28 C3 fueron detectados por Western-blot 72h después de Lin28-siRNA transfección. (DO). Quimio-sensibilidad de MKN45 /Lin28 y MKN28 /Lin28 de OXA, PTX y ADM por el ensayo MTT después de la expresión Lin28 se desmontables. (D) y el cambio (E) .Apoptosis entre MKN45 /Lin28 /SI-Lin28, MKN45 /Lin28 /SI-control, MKN28 /Lin28 /SI-Lin28, MKN28 /Lin28 /SI-control en OXA 3.2ug /ml, PTX 1uM.After Lin28 era knock-down, la apoptosis de MKN45 /Lin28 se redujeron. Cada punto de datos representa la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. (* P & lt; 0,05) guía empresas
Q-PCR mostró que la expresión de mRNA en Lin28 MKN45 /Lin28 /SI-Lin28 (48 h) y MKN45 /Lin28 /SI-Lin28 células (72 h) fue. mucho más baja que en MKN45 /Lin28 /células de control si (p & lt; 0,01). Este efecto también se verificó la transfección en células MKN28 /Lin28. Western Blot reveló que Lin28 si-ARN, inhibió la expresión de proteínas en células MKN45 Lin28 /Lin28 y MKN28 /Lin28.
Un ensayo MTT se realizó en los cuatro tipos de células (MKN45 /Lin28 /SI-control, MKN45 /Lin28 /SI-Lin28, MKN28 /Lin28 /SI-control y MKN28 /Lin28 /SI-Lin28 células) que fueron transfectadas con siRNA Lin28 durante 48 horas para evaluar la sensibilidad de la quimioterapia. Se optó por utilizar los medicamentos de quimioterapia que tuvieron los efectos más pronunciados en la pre-prueba: OXA, PTX y ADM. Hemos seleccionado a un gradiente de concentración de 5-6 de acuerdo con los resultados preliminares de experimentos preliminares. La interferencia de siRNA redujo la expresión de Lin28, y las líneas celulares Lin28-positivas tenido un aumento de la sensibilidad a los fármacos quimioterapéuticos (Fig 3).
A continuación detectó la sensibilidad de las células a diferentes medicamentos de quimioterapia después de la baja regulación de Lin28 . Las células se dividieron en 4 grupos, MKN45 /Lin28 /SI-de control, MKN45 /Lin28 /SI-Lin28, MKN28 //de control de SI Lin28 y MKN28 /Lin28 /SI-Lin28, y se pusieron a prueba con los medicamentos de quimioterapia OXA y PTX, respectivamente . Las concentraciones de los fármacos de quimioterapia (OXA 3,2 g /ml y PTX 1 mM) fueron seleccionados de acuerdo a los resultados de los experimentos preliminares. El número de apoptótica MKN45 /Lin28 y las células MKN28 /Lin28 era menor que la de MKN45 /Lin28 /si-Lin28 y las células MKN28 /Lin28 /si-Lin28 (p & lt; 0,05). Este resultado indica que la baja regulación de la expresión Lin28 puede aumentar la apoptosis de las células (Figura 3).
2. Los mecanismos moleculares por los cuales los cambios en la sensibilidad a la quimioterapia Lin28
Hemos detectado relacionados con la resistencia a los fármacos niveles de expresión génica por Q-PCR en MKN45 /Lin28 y MKN45 /vector cells.P-gp, y los niveles de ARN de c-Myc estaban aumentó notablemente y el nivel de ARN de ciclina D1 se disminuyó, mientras que otra Bcl-2, CDK6, NF-kB, TOP II no mostró diferencia significativa entre MKN45 /Lin28 y MKN45 /vector cells.Also estos relacionados-resistencia a los medicamentos expresiones de genes fueron investigados por Western blot en MKN45 /Lin28 y células /vector MKN45, que mostraron tendencia consistente que la P-gp y expresión de la proteína C-myc, mientras que aumentaron ciclina D1 se redujo. Sin embargo, Bcl-2 expresión disminuida, la expresión de NF-kB no cambió, y la expresión de la ciclina D1 y la CDK6 proteína quinasa se redujo (Fig 4).
(A) expresión .Differential de fármaco resistencia asociada- proteína entre MKN45 /Lin28 y MKN45 /vector. (B) y (C) .P-gp y el nivel de expresión de c-myc se redujeron en proteínas y los niveles de ARN después de Lin28 caída en células MKN45 /Lin28, mientras que se incrementó la expresión de ciclina D1. Cada punto de datos representa la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. (** P & lt; 0,01, * p & lt; 0,05).
Después de la expresión Lin28 fue inhibida por la transfección con ARNip Lin28, se evaluaron de nuevo los niveles de ARN de P-gp, C-myc y ciclina D1. Después de la reducción en el nivel de ARN de Lin28, P-gp y C-myc fueron significativamente regulados hacia abajo, mientras que los niveles de ciclina D1 aumentaron significativamente. La detección de P-gp, C-myc, y la expresión de ciclina D1 por el Western Blot reveló que después de la inhibición de la expresión de Lin28, P-gp y expresión de la proteína C-myc fue significativamente reducido regulado, mientras que la expresión de ciclina D1 se reguló de manera significativa ( la figura 4).
3. MiR-107 es el objetivo de microARN Lin28
Mientras se probaba el ARN Lin28 y los niveles de miR-107 en líneas celulares de cáncer gástrico, se encontró una inhibición mutua de Lin28 y miR-107 en las líneas celulares MKN45 y AGS. Además, el miR-107 se redujo reguladas en las células MKN45 /Lin28 y MKN28 /Lin28. Desmontables de la expresión de Lin28 revirtió esta inhibición. En un experimento de seguimiento, las células Lin28-positivas, MKN45 /Lin28 y MKN28 /Lin28, se transfectaron con pre-mir-107 y fueron adelante se le denominará MKN45 /Lin28 /pre-miR-107 y MKN28 /Lin28 /pre células de miR-107. células pre-miR-transfectadas de control fueron llamados MKN45 /Lin28 /pre-miR-Control y MKN28 /Lin28 /pre-miR-control. Anti-miR-107 o el control de transfecciones en células Lin28-negativas, MKN45 /vector, rindieron MKN45 /vector /células anti-miR-107 y MKN45 /vector /anti-miR-control, respectivamente. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, el ARN se recogió y se sometió a q-PCR para detectar las diferencias de miR-107 expresión en MKN45 /Lin28, MKN28 /Lin28, MKN45 /Vector, y las células /vector MKN28. También se evaluó el efecto de la caída de expresión Lin28 Lin28 por siRNA. Después de la transfección con Lin28, miR-107 expresión fue significativamente reducido regulado, mientras que después de la caída de expresión Lin28, la expresión de miR-107 aumentó. Cuarenta y ocho horas después de la transfección de pre-miR-107, los niveles de ARN Lin28 se redujo significativamente, y 96 horas después de la transfección, la expresión de proteínas Lin28 era todavía inferior a la del grupo no transfectadas control. Este hallazgo indica que el miR-107 puede regular la expresión de Lin28 (figura 5).
(A) .RNA nivel de Lin28 y miR-107 se detectaron mediante QRT-PCR en la línea celular gástrica. (B) el nivel de expresión .MiR-107 fueron detectados por QRT-PCR después de Lin28 sobreexpresión (en MKN45 y MKN28) o desmontables Lin28 (en MKN45 /Lin28). (DO). Pre-miR-107-transfección el regulado en Lin28 MKN45 /Lin28 de una manera dependiente del tiempo. (RE). sensibilidad a la quimio-fármaco de MKN45 /Lin28C2 y MKN28 /Lin28C3 aumentó después de la transfección de pre-miR-107. (MI). tasa de apoptosis de MKN45 /Lin28 (tratado con OXA en 3.2ug /ml) aumentó después transfectadas con pre-miR-107. (F). sensibilidad a la quimio-fármaco de células transfectadas MKN45 cambiado después de anti-miR-107. (G) y (H). P-gp, la expresión de c-Myc se redujo, mientras que la expresión CyclinD1 se incrementó en las células MKN45 /Lin28 después de transfección con punto de datos pre-miR-107.Each representa la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. (** P & lt; 0,01, * p & lt; 0,05).
4. MiR-107 participa en la resistencia a los medicamentos de quimioterapia mediada por Lin28
La sensibilidad de la quimioterapia 4 grupos de células, MKN45 /Lin28 /pre-miR-de control, MKN45 /Lin28 /pre-miR-107, MKN28 /Lin28 /pre-miR-control y MKN28 /Lin28 /pre-miR-107, se ensayó utilizando el método de MTT 48 horas después de la transfección con pre-miR-107. Elegimos los medicamentos de quimioterapia que tuvieron los efectos más pronunciados durante la pre-prueba, OXA, PTX y ADM, y seleccionamos un gradiente de concentración de 5-6 según los resultados preliminares de los experimentos preliminares. Los resultados sugieren que la introducción de pre-miR-107 en células Lin28-positivo puede aumentar la sensibilidad de células a la quimioterapia. Apoptosis pruebas mostró que el número de células apoptóticas MKN45 /Lin28 aumentó después de la transfección con pre-miR-107 (p & lt; 0,05). las pruebas MTT de MKN45 //anti-miR-control de Lin28 y MKN45 /Lin28 /anti-miR-107 sensibilidad quimioterapia mostró que la inhibición de la expresión de miR-107 en MKN45 redujo la sensibilidad a la PTX (Fig 5).
Por el Western Blot y q-PCR, se han detectado los relacionados con la resistencia a los niveles de expresión de genes y proteínas de drogas en las células MKN45 /Lin28 que habían sido transfectadas con pre-miR-107, incluyendo los de C-myc, P-gp, y ciclina D1. Los resultados mostraron que 48 horas después de la transfección con miR-107, la expresión de ARN y la proteína de c-myc y P-gp disminuyó (P & lt; 0,01), mientras que la expresión de la ciclina D1 se incrementó (p & lt; 0,05) (Fig 5).
5. Lin28 asociado resistencia químico-fármaco in vivo
Después de 2 ciclos de quimioterapia, se encontró que los xenoinjertos de tumores de células MKN45 /Lin28 no redujeron en volumen y se hizo más grande que los de otros grupos (MKN45 /vector y MKN45 ). En ambos grupos, la MKN45 /Lin28 y MKN45 /vector, uno de los ratones murieron, lo que la quimioterapia se detuvo. Los tumores fueron extirpados y sus volúmenes analizados. Se encontró que los tumores de xenoinjertos MKN45 /Lin28 eran más grandes que los otros tumores después de ADM y la quimioterapia OXA (p & lt; 0,01) (Fig. 6)
MKN45 /Lin28, MKN45 /vector, se inocularon células MKN45 /parentales por vía subcutánea en la axila de ratones macho BALB /c-nu /nu. El volumen del tumor se midió y se construyó la curva de crecimiento después de la inyección de ADM y OXA
a través de
vena de la cola. Cada punto de datos representa la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. (** P & lt; 0,01).
Discusión
En el presente estudio, se investigó la asociación de la expresión Lin28 con quimio-sensibilidad en células de cáncer gástrico. Se encontró que la transfección con Lin28 reduce la sensibilidad de las líneas celulares de cáncer gástrico MKN45 y MKN28 a cuatro tipos de reactivos quimioterapéuticos (OXA, PTX, ADM, y 5-FU). Utilizando la tecnología de interferencia siRNA desmontables expresión Lin28 podría revertir la quimio-resistencia. También puso de manifiesto que el miR-107 podría regular negativamente la expresión Lin28, mientras que también se sirve como una de las posibles micro ARN diana que está regulado por Lin28. La sobreexpresión de Lin28 hasta reguladas C-myc y P-gp, mientras reguladas por ciclina D1, esta fenómenos podrían revertir por Lin28 siRNA transfección o pre-miR-107. Esto podría ser por mecanismos críticos que Lin28 disminuyó la quimiosensibilidad en células de cáncer gástrico. Para nuestro conocimiento, este es el primer estudio que demuestra Lin28 /miR-107 vía de señalización podría estar implicado en la resistencia químico-fármaco en el cáncer gástrico.
La quimioterapia es un tratamiento importante para los pacientes con cáncer gástrico, pero más de 50% de los pacientes progresará a la resistencia a la quimioterapia. Los posibles mecanismos de quimio-resistencia en el cáncer gástrico se consideran actualmente para incluir el transporte transmembrana de transportadores ABC, glutatión S transferasa, la actividad de topoisomerasa de ADN, gen del cáncer de la mutación de p53 y las vías relacionadas con la apoptosis. Un estudio reciente encontró que los micro ARN juega un papel importante en la resistencia a los medicamentos gástrica quimioterapia contra el cáncer [15]. En un modelo de resistencia de las células tumorales, se observó que las células madre de cáncer también juegan un papel importante en la resistencia a la quimioterapia. El gen c-myc es uno de los marcadores de superficie de las células madre del cáncer, sino también un oncogen asociado con la proliferación indefinida, la inmortalización infinita, y la promoción de la división celular [16]. Un estudio informó que el 40% de los pacientes con cáncer gástrico tiene C-myc gen y que una mayor expresión de c-myc se asocia con un peor pronóstico [16-18]. Los estudios también han reportado una correlación entre el gen c-myc y apoptosis. la expresión de c-Myc puede conducir a la disminución de la apoptosis de las células tumorales. La tasa de apoptosis celular y la sensibilidad a factores inducidos dependen de los niveles de proteína c-myc [19]. Por otra parte, la sobreexpresión de c-myc está asociada con la radiación y la resistencia a la quimioterapia. Además, C-myc puede regulado hasta-P-gp, que puede inducir effluxing de reactivos quimioterapéuticos condujo a resistencia a la quimioterapia [20]. detención del ciclo celular puede afectar a la respuesta de las células cancerosas para ciertos medicamentos de quimioterapia (como la PTX), que desempeña un papel en la fase G2 /S reduce la sensibilidad al fármaco. La proteína del ciclo celular ciclina D tiene tres subtipos, D1, D2, y D3, y es un factor de iniciación del ciclo celular. Su supresión por factor de crecimiento transformante -β1 (TGF-β1) evita que las células entren en el ciclo celular de tal manera que permanecen en un estado de reposo [21]. Ciclina D combina específicamente con CDK4 /6 de fosforilar e inactivar la proteína retinoblastoma (pRb), contribuyendo así a transición G1 /S y el inicio de la síntesis de ADN [21]. En el presente estudio, encontramos Lin28 no eran pertinentes con Bcl-2, NF-kB y TOPO II en células de cáncer gástrico. La asociación entre Lin28 y microRNAs ha sido bien establecido, como let-7, miR-200c, miR-143 [4,22]. sobreexpresión Lin28 regula a la baja microARN, mientras microARN también puede afectar negativamente la expresión de Lin28. Lin28 junto con TUT4 constituye un regulador negativo, que influye en la maduración y la homeostasis de microRNAs [4,22]. Mediante la regulación de genes aguas abajo, microRNA está implicado en la diferenciación celular y la proliferación, el metabolismo celular, las respuestas al estrés y la formación de vasos sanguíneos. Cheng et al [23] encontró que después de la inhibición, se promovió el crecimiento de células de cáncer cervical HeLa y células de cáncer de pulmón A549 miR-107. Marijn et al [24] encontró que la expresión de miR-107 en células de cáncer de ovario resistentes a los medicamentos se redujo reguladas. Nuestro estudio encontró que Lin28 también puede frenar la maduración de miR-107, y la introducción de miR-107 aumentar la célula de cáncer gástrico quimio-sensibilidad a OXA, PTX, y ADM. Después de la transfección de anti-miR-107, esta sensibilidad disminuida. Pre-miR-107 causó una disminución en la expresión de Lin28, lo que ilustra que la vía Lin28 /miR-107 pueden estar involucrados en los cambios chemosensitivity de cáncer gástrico.
En resumen, nos mostró que podría inhibir la Lin28 expresión de miR-107, de ese modo hasta la regulación de C-myc, P-gp y abajo de la regulación de ciclina D1, posteriormente da lugar a la quimio-resistencia de las células de cáncer gástrico. La vía Lin28 /miR-107 podría servir como una de las muchas vías de señalización que se asocia con el cáncer gástrico quimio-resistencia. Nuestro estudio puede proporcionar nuevos conocimientos sobre el mecanismo de la quimio-resistencia cáncer gástrico. Lin28 /miR-107 puede ser una nueva potenciales dianas terapéuticas para el cáncer gástrico resistente a la quimioterapia.
Apoyo a la Información sobre Table S1. datos mínimos para todas estas cifras
doi: 10.1371. /journal.pone.0143716.s001 gratis (XLSX)