Extracto
Una estrategia potencial para el diagnóstico del cáncer de pulmón, la principal causa de cáncer- muerte relacionada, es identificar las firmas metabólicos (biomarcadores) de la enfermedad. Aunque los datos apoyan la hipótesis de que los compuestos volátiles pueden detectarse en el aliento de pacientes con cáncer de pulmón por el sentido del olfato o a través de técnicas de bioanálisis, el análisis de muestras de aliento es engorroso y técnicamente difícil, lo que limita su aplicabilidad. La hipótesis explorado aquí es que las variaciones en compuestos orgánicos volátiles de pequeño peso molecular ( "odorantes") en la orina podrían ser utilizados como biomarcadores para el cáncer de pulmón. Para demostrar la presencia y estructuras químicas de los biomarcadores volátiles, se estudió el comportamiento y la metabolómica de los componentes volátiles de la orina olfativa guiada ratón. ratones sensores podrían ser entrenados para discriminar entre los olores de los ratones con y sin tumores experimentales que demuestran que las sustancias olorosas volátiles son suficientes para identificar a los ratones portadores de tumores. En concordancia con este resultado, los análisis químicos de la orina volátiles demostraron que las cantidades de varios compuestos fueron dramáticamente diferente entre los ratones del tumor y de control. Utilizando el análisis de componentes principales y supervisado máquina-aprendizaje, discriminamos con precisión entre los grupos tumorales y de control, un resultado que fue cruzada validado con los grupos de ensayo novedosos. Aunque no fueron compartidos diferencias entre los animales experimentales y de control en los dos modelos de tumores, también encontramos diferencias químicas entre estos modelos, lo que demuestra la especificidad basada en el tumor. El éxito de estos estudios proporciona una nueva demostración de prueba de principio de diagnóstico del tumor de pulmón a través de odorantes volátiles urinario. Este trabajo debe proporcionar un impulso para búsquedas similares para los biomarcadores de diagnóstico volátiles en la orina de pacientes con cáncer de pulmón humano
Visto:. Matsumura K, Opiekun M, Oka H, Vachani A, Albelda SM, Yamazaki K, et al . (2010) Los compuestos volátiles urinarios como biomarcadores para el cáncer de pulmón: Un estudio de prueba de principio Uso de Olor Firmas en el ratón modelos de cáncer de pulmón. PLoS ONE 5 (1): e8819. doi: 10.1371 /journal.pone.0008819
Editor: Pan Xiaoping, Universidad de Carolina del Este, Estados Unidos de América
Recibido: 15 de agosto de 2009; Aceptado: 16 de diciembre de 2009; Publicado: 27 de enero 2010
Derechos de Autor © 2009 Matsumura et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio recibió el apoyo de Panasonic Corporation. Como se indica en la sección de interés en competencia, un empleado de Panasonic, el Dr. H. Oka, ayudó a concebir la idea original y revisó el manuscrito. Ningún otro papel en esta investigación fue jugado por el Dr. Oka y Panasonic
Conflicto de intereses:. Esta investigación fue apoyada por una beca de la Panasonic Corporation. Los autores declaran no tener otros intereses en competencia. No hay patentes o patentes pendientes en base a la obra y no hay productos derivados de la obra en fase de desarrollo. Ninguno de los autores, aparte de una co-autor que es empleado de Panasonic (Dr. Oka), tiene ningún conflicto de interés económico que pueda ser percibido como relevante, incluyendo la propiedad de acciones, acuerdos de consultoría, o bolsas de viaje u honorarios. El Dr. Oka ayudó a concebir la idea original de este trabajo y revisó el manuscrito, pero los otros coautores diseñó el estudio, llevado a cabo que, analizados los datos y escribió el manuscrito.
Introducción
El cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en casi todo el mundo [1]. El único tratamiento que la que se consiga una alta velocidad de curado es la resección quirúrgica de la enfermedad temprana (antes de que ocurra la diseminación metastásica). Dado que sólo el 25% de los casos se diagnostican en esta primera etapa, se necesitan urgentemente técnicas de diagnóstico precoz eficaces.
agresivo y principios del pecho de imágenes de pacientes de alto riesgo está emergiendo como el enfoque dominante en el diagnóstico precoz, a pesar de los grandes estudios para validar este enfoque todavía están en curso [2], [3], [4]. Desafortunadamente, aunque las imágenes es bastante sensible, sino que también es relativamente no específica. Estudios recientes han demostrado que entre el 5-26% de los pacientes fumadores de alto riesgo tienen nódulos pulmonares detectables por la prueba CT, sin embargo, sólo un promedio de alrededor del 4% (con un rango de 2-11%) de estos nódulos son malignos [5]. Es evidente que la resección quirúrgica de la totalidad de estos nódulos es ni práctico ni deseable. por tanto, se necesitan enfoques para determinar qué nódulos deben ser removidos. Una estrategia atractiva sería combinar una técnica de imagen sensible con un biomarcador de cáncer de pulmón para aumentar la especificidad [6], [7], [8]. Debido a que la incidencia de cáncer de pulmón en este "población nódulo" es significativamente mayor que en las poblaciones actuales o ex fumadores, los biomarcadores en este contexto no se requieren las extremadamente altas sensibilidades y especificidades necesarias para el cribado de la población. Otro uso de un biomarcador como podría ser la de seguir el curso del tumor después del tratamiento.
Con el desarrollo de técnicas de alto rendimiento para el descubrimiento de biomarcadores [9], el campo de los biomarcadores de cáncer de pulmón se ha expandido recientemente sustancialmente. biomarcadores candidatos actuales a partir de sangre, esputo, y orina incluyen muchas clases de moléculas que incluyen proteínas, antígenos tumorales, anticuerpos anti-tumorales, teléfonos péptidos específicos del tipo, diversos productos metabólicos, y fenómenos epigenéticos tales como ADN hiper-metilado, ARN y específica la expresión del gen [10]. Sin embargo, ningún biomarcador identificado hasta la fecha ha demostrado tener una sensibilidad adecuada, especificidad y reproducibilidad para ser considerado suficiente para su uso para detectar y vigilar el desarrollo del cáncer de pulmón.
Otra clase de biomarcadores de cáncer de pulmón podría ser pequeño peso molecular compuestos orgánicos volátiles. Estas moléculas, que se pueden percibir como olores (especialmente por parte de los animales), han demostrado que funcionan como "firmas" que transmiten la información social, emocional y de salud a otros miembros de la especie [11]. Puede haber dos fuentes de marcadores volátiles en pacientes con cáncer de pulmón. Los estudios han demostrado que las líneas celulares de cáncer de pulmón pueden liberar los compuestos orgánicos volátiles específicos
in vitro
[12]. La presencia de un tumor en crecimiento también podría inducir metabólica específica o cambios nutricionales que podría alterar la producción o liberación de estos compuestos [6].
La "hipótesis volátil" para el cáncer de pulmón ha conducido a una serie de estudios que examinan la utilidad del análisis de estos compuestos en el aliento exhalado usando cualquiera de los animales (como perros) [13] o técnicas bioquímicas sofisticadas [14], [15]. Algunos de estos estudios han mostrado ser prometedor. Por ejemplo, un estudio reciente del grupo Chen [16] utilizando micro-extracción en fase sólida seguido por cromatografía de gases mostró que 1-butanol y 3-hidroxi-2-butanona se encontraron en concentraciones significativamente más altas en el aliento de pacientes con cáncer de pulmón en comparación con los controles. Dragonieri et al. utilizado una "nariz electrónica" y fueron capaces de discriminar a los pacientes con cáncer de pulmón en comparación con aquellos con enfermedad pulmonar obstructiva crónica con relativamente alta sensibilidad y especificidad [17].
Por desgracia, la recolección, la manipulación, el almacenamiento, la concentración y el análisis de la respiración muestras es engorroso, técnicamente difícil, y por lo tanto pueden no ser fáciles de aplicar ampliamente. Una solución parcial a estos problemas sería usar una fuente mucho más conveniente de las sustancias volátiles, tales como muestras de orina a pesar de orina, como la respiración, incluirá no sólo los volátiles endógenos, sino también las exógenas de fuentes tales como la dieta y el medio ambiente. En este sentido, Willis et al. (2004) reportaron que los perros podían ser entrenados para distinguir a los pacientes con cáncer de vejiga a partir de olor de la orina con más éxito de lo que sería de esperar por azar [18]. Por desgracia, un estudio de seguimiento por Gordon et1 al. [19] fue incapaz de reproducir estos hallazgos en muestras de orina de pacientes con cáncer de mama y de próstata.
Sobre la base de estas consideraciones, la hipótesis explorada en este trabajo es que las variaciones en los compuestos orgánicos volátiles de bajo peso molecular ( "odorantes ") en la orina podrían ser utilizados como biomarcadores para el cáncer de pulmón. Una de las principales dificultades en el intento de identificar inicialmente biomarcadores volátiles procedentes de pacientes humanos es la gran variación que puede ser debido a variables no controladas como las diferencias genéticas y dietéticos, el uso de productos de cuidado personal, y otras variables ambientales que pueden influir en los volátiles de olor corporal. La observación de que los perros pueden parecer filtrar estas posibles distracciones y concentrarse en la firma de la enfermedad (véase más arriba) sugiere que pueden existir biomarcadores potencialmente útiles.
A la luz de estos desafíos, hemos elegido para perseguir un animal más altamente controlada modelo de enfoque [20], [21], donde muchas de las variables que hacen que un paciente trabajo tan difícil puede ser controlado (Figura 1A). Nuestra estrategia era demostrar en primer lugar que los ratones pueden ser entrenados para discriminar muestras de orina de los ratones con tumores de los ratones de control por el olor solo. Una vez que habíamos establecido que esto era posible, que luego empleó perfiles metabólicos (en fase sólida-microextracción, seguido de cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas) para mostrar que podríamos identificar patrones específicos de compuestos volátiles en la orina que permiten distinguir los ratones portadores de tumores de los animales de control .
(A) Descripción general del procedimiento experimental. Empleamos el comportamiento olfativo ratón guiado (izquierda) y metabolómica (derecha) se aproxima. Se inyectaron (B) las células y células LLC LKR por vía subcutánea en los flancos de ratones machos adultos y el tamaño del tumor se midió cada semana posteriormente. Cada punto de tiempo muestra la media ± SEM tamaño del tumor. línea continua: los datos reales; línea de puntos: curva ajustada con la función cúbica; LKR: y = 0,092 * x
3 - 2.8 * x
2 + 38 * x - 18, LLC: y = 0,16 * x
3 - 0.83 * x
2 + 3,5 * x - 4. ratón se recogió la orina de forma individual una vez al día y se utilizó para el análisis químico y para el bioensayo durante los períodos indicados: para LKR - días 15-24 y 25-37 para el entrenamiento y los días 2-7, 9-14, 15-20 y 25-37 para la generalización; Por LLC - Días 17-26 para la formación y Días 1-8, 9-16, 17-26 y para la generalización. plot (C) Caja de generalización calificaciones de bioensayo y las correlaciones entre las pruebas. cajas azules representan los cuartiles inferiores y superiores. La barra horizontal de color rojo en cada cuadro indica la mediana. La línea de puntos representa el rango de observaciones. El signo más (+) marca observaciones de valores atípicos extremos. *;
P Hotel & lt; 0,01, **;
P Hotel & lt; 0,001, ***;
P Hotel & lt; 0,0001 en comparación con la hipótesis nula de un 50% puntuación de generalización. Desde la izquierda, la orina del ratón generalización entrenado LKR a LKR orina del ratón (Formación 1, Figura 1C-i); LKR- entrenado generalización de la orina del ratón para LKR orina del ratón (Entrenamiento 2, Figura 1C-II); entrenado LLC ratón orina generalización de la orina del ratón LLC (Figura 1 C-III); ratón orina generalización LKR-entrenado para ratón LLC orina (Figura 1C-IV); entrenado LLC ratón orina generalización a LKR orina de ratón (Figura 1C-v).
Resultados
Ratón Modelos de cáncer de pulmón
Los tumores de pulmón derivado de célula de ratón líneas tienen similitudes en la morfología, histopatología, y las características moleculares con los adenocarcinomas de pulmón humanos y pueden servir como modelos útiles primeros [22]. Se utilizaron dos líneas celulares de cáncer de pulmón de ratón, LKR que se deriva de un animal transgénico que expresa mutado Kras y LLC, el carcinoma de células de pulmón de Lewis que surgió de manera espontánea. Los tumores se indujeron mediante la inoculación de cada uno de estas líneas celulares en diferentes grupos de ratones (ratones de control fueron inyectados con el vehículo, solución salina, en el mismo horario). Las curvas de crecimiento del tumor para estas dos líneas celulares mostraron patrones similares (Figura 1B). Sobre la base de las curvas de crecimiento tumoral, se recogieron muestras de orina que se extendió por etapas de crecimiento del tumor para el bioensayo y para su posterior análisis químico.
Detección olfativa del olor urinario
Hemos capacitado a los ratones de sensor (véase métodos) para discriminar entre los olores de las muestras de orina de ratón recogidos de los ratones inyectados con LKR tumores grandes (días 25-37 de inyección de células posterior) en comparación con los ratones de control genéticamente idénticas sin tumores. Cuando esto se ha realizado correctamente, hemos probado para determinar si este aprendizaje generalizado a las primeras etapas del desarrollo del tumor. Como se muestra en la Figura 1C-i, los ratones entrenados con éxito distinguidos entre las orinas recogidas de los ratones con tumores en 25-37, 15-20 y 9-14 días después de la inyección, pero no generalizar a los tumores en etapas muy tempranas (1-7 Días ). A continuación, hemos entrenado aún más estos mismos ratones sensor utilizando muestras de orina recogidas en los días 15-24 de inyección posterior. Aunque estos ratones generalizar esta formación a nuevas muestras recogidas de los ratones con tumores del mismo tamaño, no lo hacen por las orinas recogidas en los días 9-14 o 1-7 (Figura 1C-ii). Los experimentos de control verifican que los ratones entrenados no distinguió entre los ratones inyectados y no inyectados antes de las inyecciones, lo que demuestra que no hubo sesgo en la orina del ratón original o el aparato de Y-laberinto.
Para investigar la generalidad de este resultado, capacitamos a un grupo separado de ratones sensor para discriminar muestras de orina de los ratones con- y sin tumores inducidos LLC. El patrón de resultados fue casi idéntica a la de los tumores inducidos por LKR (Figura 1 C-III).
A continuación pregunta si los olores asociados con los tumores LKR y LLC fueron perceptualmente similares, probando los ratones entrenados en las muestras de orina recogidas de tumor-cojinete vs. ratones de control desde el modelo animal diferente de la que habían sido formados en. Es decir, nos preguntamos si los ratones entrenados para discriminar muestras de orina de los ratones con y sin tumores inducidos por LKR reconocerían (generalizar esta respuesta a) los ratones portadores de tumor LLC y viceversa. La respuesta fue afirmativa (Figura 1C-VI y -v). Estos resultados muestran que los tumores inducidos por estas líneas celulares de cáncer producen comunes. (Aunque no idénticas; véase más adelante) biomarcadores volátiles que pueden ser reconocidos por los sistemas olfativo de ratones
Caracterización de compuestos volátiles urinarios
a continuación se caracteriza la naturaleza de la variación química distinguir los ratones con tumores de los que no tienen mediante el análisis de compuestos volátiles con urinarios de fase sólida microextracción, seguido por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas. A partir de los cromatogramas de iones totales típicas (tics) un gran conjunto diverso de picos podía distinguirse (Figura S1). Se seleccionaron cuarenta y siete picos para la identificación de las TIC en función de su tener suficientemente grandes alturas de los picos y los tics que no se solapan tal como se determina por inspección visual. Como puede verse en la Tabla 1 y S1, los picos se componen de una variedad de estructuras químicas y son potencialmente implicado en diversas funciones biológicas, por ejemplo en la comunicación de feromonas (2-heptanona, 3,4-deshidrogenasa
exo
-brevicomin y 2 a
seg
butil-4,5-dihidrotiazol, 6-hidroxi-6-metil-3-heptanona,
β
-farnesene [23]). También se identificaron compuestos reportados previamente en la orina humana (nitrometano, dimetil sulfona,
o
toluidina, ácido 2-etilhexanoico [24]).
A continuación utiliza el análisis cuantitativo de estos 47 picos para determinar si los ratones con y sin tumores inducidos experimentalmente podían distinguirse. La variación en las alturas de los picos primas mostró claramente las diferencias en las cantidades relativas de diversos compuestos sobre la base de la presencia o ausencia de tipos de tumores y el cáncer (Figura 2A y la Figura S2). Hemos observado cambios relativamente consistentes para muchos picos y para ambos grupos tumorales con ser el patrón más común de una disminución en la producción (regulación a la baja) en los grupos tumorales y, o bien un aumento de la producción (regulación) o un cambio insignificante en los grupos de placebo (Figura S3). Por ejemplo, el pico 13 (5-hepeten-2-ona) se había reducido regulado drásticamente como consecuencia de la presencia del tumor (Figura 2B). Por lo tanto, una baja regulación general de compuestos volátiles puede ser una característica común de crecimiento del tumor. Sin embargo, hubo otros patrones de cambio para una minoría de compuestos volátiles. Por ejemplo, la producción de (ácido 2-etilhexanoico) 37 pico se elevó en ambos grupos tumorales. Los cambios en otros picos dependen de los tipos de cáncer (y /o cepa de ratón). Máximo de 29 (acetofenona) fue baja regulación en el grupo LKR-tumoral y sobre regulación en el grupo de LLC-tumoral mientras que el pico 33 era baja regulación sólo en el grupo del tumor LKR. La trama de serie de imágenes (Figura 2C) muestra claramente los efectos globales diferenciales de crecimiento del tumor.
(A) Comparación entre la etapa inicial y la etapa tardía de 4 picos ilustrativos seleccionados de 47 picos analizados. El eje vertical indica la intensidad (cantidad) de TIC; líneas verticales alrededor de media indican SEM en cada punto de muestreo. El azul representa la primera etapa, mientras que el rojo representa la etapa tardía. El eje horizontal indica el tiempo de retención. (B) diagrama de barras de intensidad de 4 picos ilustrativos seleccionados a partir de los 47 picos analizados. la intensidad media de los picos se representa en cada pico. Las barras rojas representan grupos tumorales; barras azules representan los grupos de control. Un fondo azul claro indica una diferencia significativa a
P Hotel & lt; 0,0001 entre los grupos tumorales y control. (C) cruda intensidad de 47 analizados picos obtiene restando el período inicial desde el período posterior (n = 25 para cada uno de los 4 grupos). gris más oscuro significa el pico aumentado tras el desarrollo del tumor, mientras que el gris más claro significa el pico disminuyó tras el desarrollo del tumor.
Discriminación de tumor y el grupo placebo
A continuación se procedió al establecimiento de perfiles metabolómicos de vista estadístico discriminar entre los grupos y para identificar picos característicos. Con este fin, se combinaron dos enfoques diferentes: el análisis de componentes principales (ACP) y la máquina de vectores de soporte (SVM). El primero, PCA, permite que la estructura en un conjunto de datos para dictar la separación de las muestras en grupos basados en la similitud general de los valores de pico sin conocimiento previo de la identidad de la muestra. Los gráficos de las puntuaciones de PCA calculadas a partir de los valores normalizados de los 47 picos mostraron una separación distintiva del perfil químico entre los grupos tumorales y los grupos de placebo en ambas líneas celulares de cáncer (Figura 3A y 3B). En segundo lugar, se empleó un enfoque de aprendizaje de máquina supervisado en base a la SVM para determinar el límite entre los grupos tumorales y los grupos de placebo. Este algoritmo considera los dos primeros componentes principales, PC1 y PC2, para crear descripciones de las muestras en este espacio de alta dimensional y, a continuación, se define un hiperplano que separa mejor muestras de las dos clases. El clasificador SVM separó con éxito las muestras tumorales en categorías y placebo (que se visualiza en el contorno fino con el color de azul a rojo en la Figura 3A y 3B). La SVM clasificado con éxito la mayoría de los individuos que dan una clasificación de precisión de 94% con una sensibilidad de 88% y especificidad de 100% (LKR) y una precisión del 94% con una sensibilidad del 100% y una especificidad de 88% (LLC). Cabe destacar que sólo 3 de los 50 ratones individuales en nuestro conjunto de prueba fueron clasificados erróneamente. Por lo tanto, los picos seleccionados contienen características químicas que distinguen tumores de los ratones tratados con placebo.
La separación de los grupos tumorales y las de placebo Principio de análisis de componentes (PCA) y su determinación de límites de máquinas de vectores soporte (SVM) se muestran en A (LKR ) y B (LLC). Los círculos representan los individuos de los grupos tumorales y los triángulos representan los individuos de los grupos de placebo (vectores de soporte: círculos y triángulos sólidos). El color de fondo del contorno, que van del rojo al azul, indica la probabilidad de clases para diferentes regiones del avión.
Validación Cruzada y la combinación esencial de Picos
Para validar estos análisis, emplea un método de validación cruzada 10 veces mediante el uso de todas las 25 muestras. Para un análisis más detallado, se seleccionaron los 11 picos de los originales 47 picos que difieren entre los grupos tumorales y de placebo con un
P Hotel & lt; 0,0001 (Tabla 1). Entrenamos el clasificador SVM mediante la aplicación de todas las combinaciones posibles lógicamente sin repeticiones de estos 11 picos para cada uno de los dos sistemas modelo (LKR) y LLC. La generalización de rendimiento de los clasificadores SVM que emplean diferentes conjuntos de agrupaciones pico se ilustra en el espacio de funcionamiento del receptor característica (ROC). No solo pico clasificado con éxito con una precisión de más de un 95%. Sin embargo, la clasificación con varios pares de picos dio lugar a una precisión de hasta un 98 ± 2% para LKR y 100% para la LLC (Tabla 2-i, II y Tabla S2, figura S4), confirmando que mejor generalización se basa en una combinación de los picos. En otros análisis (datos no mostrados) se encontró que SVM tuvo un rendimiento superior al de Fisher análisis discriminante, que utiliza métodos de aprendizaje sin supervisión. Por lo tanto, las agrupaciones característicos picos pueden diferenciar de forma fiable tumor grupos de placebo y los grupos pueden tener potencial diagnóstico.
Para evaluar el poder de generalización de los racimos de pico a un grupo novedoso, hemos creado las series de entrenamiento independientes (13 de las 25 muestras) y unidades de prueba se mantuvieron (12 muestras). Los clasificadores SVM entrenado con los 11 grupos punta seleccionados del conjunto de entrenamiento generaron una mejor combinación de picos que tienen una precisión de 95% para LKR y del 100% para la LLC para la prueba de conjuntos (Tabla 2-iii, v y el cuadro S3, S5 figura ).
Aunque las líneas de células LKR y LLC son diferentes sistemas modelo y se inyectaron en diferentes cepas de ratón endogámica (que probablemente sí mismos difieren en los olores corporales), nuestros estudios de comportamiento sugieren que compartían olores comunes indicativos de la presencia o ausencia de tumores. Esto también se encontró que era el caso en los análisis metabolómicos. El grupo de los picos (el clúster) que mejor predice el estado de los datos de LKR LLC como se determina por SVM (Tabla 2-iv) tenía una precisión de 98%. Por el contrario, el grupo de picos que mejor predijeron LKR de LLC (Tabla 2-vi) tenía una precisión de 91%. Sólo un pico (# 22; véase la Tabla 2-iv, -VI) era común a estos dos conjuntos de grupos de predicción. Clasificación por otros grupos de pico también se genera alta precisión diagnóstica (95%) con potencial diagnóstico sustancial (Figura S6).
Interactivo Efecto de tumores y líneas celulares
A pesar de que había similitudes entre los dos modelos de tumores, análisis estadísticos adicionales también demostraron que los efectos de los dos modelos de tumores en los perfiles metabólicos no eran idénticos. Se analizó la interacción entre dos líneas diferentes de células (LKR y LLC) y tumor frente a placebo con los análisis de 2 vías de varianza (grupos tumorales y el placebo para cada uno de los dos modelos de tumor) para cada uno de los 47 picos (Figura 4 y S7 ). Una interacción significativa indica especificidad tumor. De los 47 análisis por separado, la interacción w'as significativa (
P Hotel & lt; 0,05) en 11 casos (Tabla S3). Para el control de falsos positivos debido a las pruebas 47 picos, que limita la consideración de 4 picos (# 1, 7, 29, y 33) con
P Hotel & lt; 0,002. Estas interacciones se ilustran en la figura 4 donde, por ejemplo, máximo de 29 no muestra ninguna diferencia entre el tumor y el placebo (
P
= 0,0387), pero una gran diferencia entre los modelos de tumores (
P
= 0,0002) . Hay suficiente especificidad para distinguir entre los perfiles de volátiles de los dos tipos de tumores.
intensidad normalizada (en el eje vertical) de los cuatro picos (A-D) en el que un ANOVA de dos vías indicó significativa (
P & lt
. El eje horizontal de cada uno de los 4 paneles (A-D) indica las dos etapas, temprano - antes del desarrollo del tumor significativo a la izquierda y más tarde - después del desarrollo de tamaño significativo de tumor. Rojo: el tumor, Azul: placebo, Círculo: LKR, Estrella:.
LLC
Discusión
La identificación de biomarcadores volátiles en la orina para el diagnóstico de la enfermedad es un área de gran promesa, sin embargo, se basa en la investigación en humanos antes limitado. Los datos de este estudio son consistentes con la hipótesis de que los compuestos volátiles útiles para el diagnóstico se producen en pacientes con cáncer de pulmón y secretadas en la orina, lo cual apoya este enfoque diagnóstico en el contexto del cáncer de pulmón.
En concreto, nuestros estudios mostraron que el olfato animal en especies como el ratón (que tiene un sistema olfativo sensible [25], [26]), puede tener éxito de diagnóstico en la detección de firmas de cáncer de pulmón en la orina. Más importante aún, hemos sido capaces de imitar esta capacidad utilizando técnicas bioanalíticos. Esto sugiere que será posible crear un sensor biomimético basado en el conocimiento de sistema olfativo para el cribado de sustancias odoríferas de diagnóstico que podría ser práctico para aplicaciones generalizadas [27], [28], [29], [30]. De hecho, la levadura de ingeniería genética que expresa un receptor olfativo y su sistema de transducción de señales se ha demostrado que ser capaz de detectar 2,4-dinitrotolueno, un diagnóstico compuesto de explosivos [31]. olfato artificial con un epitelio y modelo de polímero glomérulos podría detectar odorantes imitando de ese modo un sistema olfativo biológica [32]. En última instancia, estos sensores podrían conducir al desarrollo de kits de prueba disponibles en el mercado. Sin embargo, también parece que el perfil metabólico (en fase sólida-microextracción, seguido de cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas) es una alternativa viable que debe ser explorado más.
El origen metabólico de muchos de los biomarcadores de diagnóstico que identificado no se conoce y no pudimos identificar las características químicas comunes. En su lugar, que tenían su origen en cualquiera de una variedad de vías bioquímicas endógenas o de fuentes ambientales (exógenos). Estos últimos compuestos (por ejemplo,
o
toluidina, y ácido 2-etilhexanoico) son poco probable que sea útil para el diagnóstico. Entre los metabolitos endógenos, se informa de 2-heptanona, una feromona, para aumentar la concentración en ratas estresadas, y se ha observado en la orina humana [33]. 6-hidroxi-6-metil-3-heptanona también ha sido identificado previamente en la orina del ratón, aunque podemos encontrar ningún informe de este compuesto en la orina humana. La variación observada de cetonas como una función del crecimiento del tumor sugiere que las vías ketogenesic pueden estar implicados en estos modelos de cáncer de pulmón. se requiere investigación adicional para determinar cuál de estos metabolitos de diagnóstico son de origen tumoral y que se originan a partir de procesos metabólicos normales y son ya sea hacia abajo o hasta reguladas por los tumores
.
El común regulación a la baja se observó siguiente el desarrollo de tumores en muchos compuestos es notable. La mayoría de los biomarcadores reportados por otros investigadores han sido hasta reguladas. Una explicación para estos hallazgos puede residir diferentes con estrategias de detección empleados por otros para identificar biomarcadores. En algunas investigaciones puede haber un sesgo hacia una búsqueda de compuestos biomarcadores para la novela (y por lo tanto hasta reguladas), mientras que nuestros métodos no tenían tal sesgo. Otra posibilidad es que esta frecuencia baja regulación resulta de los efectos complejos del tumor en el metabolismo del animal
A pesar de SVM encontraron grupos de picos que predijeron entre los dos modelos de cáncer (LKR a LLC y viceversa: Tabla. 2) con gran precisión, los grupos eran principalmente diferente para la predicción en las dos direcciones. Este resultado parece ser incompatible con los estudios de entrenamiento de animales que indicaban que los ratones entrenados para discriminar en uno de los modelos de tumores generalizó esta respuesta aprendida sin más entrenamiento para el otro modelo. Esto implica que debe haber un conjunto de compuestos volátiles (odorizantes) comunes a los dos modelos que diferencian tumor de ratones no tumorales. Una posible explicación de esta aparente anomalía es que las combinaciones de componentes volátiles que hemos identificado con SVM clasificadores no son los mismos que los ratones se pre-escucha en el durante el entrenamiento y las pruebas; tal vez hay otros componentes en común con los dos modelos que aún no hemos identificado. Si este es el caso, uno de los próximos desafíos será la identificación de estos nuevos biomarcadores. Por otra parte, observamos que no era un compuesto que era común a la predicción en ambas direcciones (# 22) y no podemos excluir la posibilidad de que fuera este compuesto los ratones utilizados para hacer la distinción en ambos casos
.
Un consideración importante para cualquier herramienta de diagnóstico práctico es su capacidad para discriminar entre diferentes tipos de enfermedades. Aunque los dos modelos de cáncer de pulmón tienen claramente similitudes en los perfiles volátiles, también tienen suficientes diferencias que puedan ser discriminados en los análisis metabolómicos (Figura 4). Esta capacidad para discriminar entre modelos de ratón estrechamente relacionadas de cáncer de pulmón implica que determinados tipos de cáncer pueden ser susceptibles a la diferenciación de diagnóstico a través de análisis de perfiles volátiles como se ilustra en la investigación actual.
El trabajo futuro con modelos animales podría continuar a lo largo de tres líneas convergentes. En primer lugar, es importante para controlar los cambios en el desarrollo en los marcadores en las primeras etapas del desarrollo del tumor. Esto no sólo es relevante para determinar cómo los primeros marcadores de diagnóstico se pueden detectar, pero podría arrojar luz sobre los mecanismos posibles cambios en las sustancias volátiles como consecuencia de la progresión tumoral subyacentes. En segundo lugar, una variedad de diferentes tipos de tumores debe ser investigado además de las dos estrechamente relacionados que se describen aquí. Esto también podría proporcionar pistas importantes en cuanto al mecanismo. En tercer lugar, los estudios in vitro sobre células tumorales serán cruciales para la comprensión de los mecanismos.
En resumen, hemos sido capaces por primera vez para identificar firmas químicas volátiles en la orina de los modelos de ratón de cáncer de pulmón utilizando rigurosa experimental del comportamiento y analítica técnicas. La importancia de este estudio es que establece la viabilidad de utilizar volátiles urinarios para detectar el cáncer de pulmón. La capacidad de recoger con facilidad y almacenar muestras de orina será una de las principales ventajas de este enfoque sobre el análisis de volátiles en el aliento exhalado. Aunque este estudio ha planteado muchas preguntas sobre la identidad y la fuente de los compuestos detectados en nuestros modelos de ratón, no estamos pensando en seguir esta dirección. En su lugar, consideramos que este estudio como una importante prueba de principal para el valor de estudiar volátiles de orina usando técnicas bioquímicas y bioinformáticas en el diagnóstico de cáncer de pulmón humano (y quizás otros tipos de cáncer). En consecuencia, hemos iniciado estudios clínicos con pacientes humanos. Estos estudios se referirán a aspectos clave sobre la sensibilidad, la especificidad, el tamaño de los tumores que se pueden detectar con precisión, los mecanismos que subyacen a los cambios observados en los perfiles volátiles, la capacidad de generalizar entre los diferentes tipos de cánceres de pulmón y el impacto del tabaquismo actual o anterior .
Materiales y Métodos
líneas celulares de cáncer de pulmón
el Kras inducida por el cáncer de pulmón murino (LKR) y carcinoma de células de pulmón de Lewis (LLC) líneas celulares fueron comprados a la ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA).