Extracto
La mucina 1 (MUC1) es una proteína heterodimérica que se expresa de manera aberrante en diversos carcinomas humanos y ciertas malignidades hematológicas. La MUC1 transmembrana subunidad oncogénico C-terminal (MUC1-C) funciones en parte por la transducción de crecimiento y las señales de supervivencia de los receptores de la superficie celular. Sin embargo, poco se sabe acerca de la estructura del dominio citoplásmico C-MUC1 como un posible objetivo de drogas. El uso de métodos de predicciones estructurales, nuestros resultados indican que una secuencia CQCRRK altamente conservada, que es adyacente a la membrana celular, se forma un pequeño bolsillo que expone los dos residuos de cisteína para la formación de enlaces disulfuro. Por el contrario, el resto del dominio citoplásmico MUC1-C no tiene una estructura aparente, consistente con una proteína intrínsecamente desordenados. Así, nuestros estudios se centraron en la orientación de la región MUC1 CQCRRK. Los resultados muestran que los péptidos que contienen CQCRRK-ácido L- y D-amino se unen directamente al motivo CQC. Además, muestran que el péptido de D-aminoácido, designado GO-203, los bloques de la homodimerización del dominio citoplásmico MUC1-C in vitro y en células transfectadas. Además, IR-203 se une directamente a endógena MUC1-C en células de cáncer de mama y de pulmón. colocalización estudios demuestran además que GO-203 se une predominantemente a MUC1-C en la membrana celular. Estos hallazgos apoyan el desarrollo de agentes que se dirigen a la MUC1-C con motivos citoplasmática CQC dominio y por lo tanto la función MUC1-C en las células cancerosas
Visto:. Raina D, P Agarwal, Lee J, Bharti A, McKnight CJ , Sharma P, et al. (2015) Caracterización del dominio citoplásmico MUC1-C como un objetivo del Cáncer. PLoS ONE 10 (8): e0135156. doi: 10.1371 /journal.pone.0135156
Editor: M. Srinivasa Srinivasula, IISER-TVM, INDIA
Recibido: Abril 8, 2015; Aceptado: 17 Julio 2015; Publicado: 12 Agosto 2015
Derechos de Autor © 2015 Raina et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
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Financiación:. las investigaciones realizadas en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional del cáncer de los Institutos nacionales de Salud en virtud de premios CA097098 y CA166480, http: //www.cancer. gov (DK). Género Oncología proporcionó apoyo en forma de salarios de los autores D. R. y S. K. LeadInvent proporcionó apoyo en forma de salarios de los autores P. A. y P. S. Las funciones específicas de estos autores se articulan en la sección "autores contribuciones". Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. He leído la política de la revista y los autores de este manuscrito tener la siguiente intereses en competencia : DK tiene la equidad en el género Oncología y es consultor de la empresa. La afiliación de Género Oncología y LeadInvent con esta obra no altera nuestra adhesión a las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
Los epitelios son capas de células lateralmente conectados con la polaridad apical-basal que están protegidos del ambiente exterior por una barrera mucosa [1]. La familia de glicoproteínas de mucina secretada y transmembrana evolucionado en metazoos que se proteja de los epitelios que, por ejemplo, la línea de (i) los tractos respiratorio y gastrointestinal, y (ii) los conductos de órganos especializados [1]. La mucina 1 (MUC1) es un miembro de transmembrana de esta familia que fue identificado por su sobreexpresión en los cánceres de mama humanos [2]. MUC1 se compone de dos subunidades que se derivan de autoescisión de un único polipéptido y, a su vez, formar un complejo heterodimérico en la membrana apical de las células epiteliales normales [1]. La subunidad MUC1 N-terminal (MUC1-N) contiene tándem 20-amino repeticiones ácido (AA) que son modificados por
O
-glycans. La subunidad MUC1 C-terminal (MUC1-C) es el componente transmembrana del heterodímero y ancla MUC1-N a la superficie celular. MUC1 se sobreexpresa en diversos carcinomas, apoyando la idea de que la regulación al alza del complejo MUC1-N /MUC1-C representa una subversión de su función normal para promover la supervivencia de células de cáncer [1]. En este contexto y además de participar en la barrera mucosa, glicosilada MUC1-N puede mejorar la función del receptor de la superficie celular para apoyar el crecimiento y la supervivencia [3]. Además y en asociación con la pérdida de la polaridad, MUC1-C interactúa con las moléculas de la superficie celular, tales como receptores de tirosina quinasas, y promueve su activación y la señalización aguas abajo [4]. De manera significativa, la sobreexpresión de MUC1-C es suficiente para conferir anclaje independiente de crecimiento y la tumorigenicidad, el apoyo a la función oncogénica de esta subunidad [5].
MUC1-C consiste en un dominio extracelular de 58 aa, un 28- región transmembrana aa y un dominio citoplasmático de 72 aa. El dominio extracelular MUC1-C incluye un motivo de NPG con el residuo de asparagina sujetos a
N
-glycosylation [6]. La unión de la galectina-3 a ese sitio NPG glicosilada promueve la formación de puentes extracelulares entre otras moléculas de la superficie celular MUC1-C y, tal como el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) [6]. La MUC1-C dominio citoplásmico (MUC1-CD) contiene un motivo CQC adyacente a la región transmembrana, que es necesaria y suficiente para la formación de MUC1-C homodímeros [7,8]. Es importante destacar que la mutación del motivo a CQC AQA bloques importación de MUC1-C al núcleo y de la membrana externa mitocondrial [7,9,10]. Por otra parte, la mutación CQC → AQA abroga la función oncogénica MUC1-C, el apoyo a la importancia de MUC1-C homodimerización en la conducción de señales intracelulares que confieren crecimiento y la supervivencia [7,11]. Por consiguiente, el motivo MUC1-C CQC ha surgido como un objetivo atractivo para el desarrollo de péptido y los inhibidores de moléculas pequeñas que bloquean la homodimerización MUC1-C y la función [12,13].
Los presentes estudios han investigado la estructura del dominio citoplásmico MUC1-C sobre la base de su importancia potencial como un objetivo de cáncer. Demostramos que la citoplásmica motivo CQC MUC1-C reside en una configuración druggable y que el resto del dominio citoplásmico es estructurado, de acuerdo con otras moléculas oncogénicas que dirigen la activación de múltiples vías de señalización [14]. También muestran que el dominio citoplásmico MUC1-C puede ser dirigido selectivamente con péptidos que se unen directamente al motivo CQC y bloquean MUC1-C homodimerización in vitro y en células.
Materiales y Métodos
Dinámica molecular
(aminoácidos 1-15) MUC1-CD estructura fue construida
ab-initio
con los ángulos phi /psi preferidas de los respectivos aminoácidos. La estructura atómica resultante con moléculas de agua e iones explícitas se estudió sin una membrana de dos capas usando Asistida Building Modelo con el refinamiento de la Energía (ámbar) [15]. Siguiendo los pasos de estabilización de la minimización, la calefacción y el equilibrio, se realizaron simulaciones cortas 15 ns para generar 1500 conformaciones separadas por 10 picosegundos, que fueron analizados adicionalmente para la desviación cuadrática media (RMSD). En estudios adicionales, la región de la membrana MUC1-C, que tiene una conformación de hélice predominante según lo predicho por THMHMM y TMPRED, se insertó en un-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina 1-palmitoil bi pre-equalibrated (POPC) de capa y solvatada con agua y los iones explícita. Los restantes aminoácidos del dominio citoplásmico se construyeron con sus ángulos /psi phi preferido. dinámicas moleculares a nanoescala (NAMD) [16] se utilizó para llevar a cabo el estudio de dinámica molecular.
Análisis de RMN de MUC1-CD
Su-MUC1-CD se expresó a partir del PET-MUC1- plásmido CD (Novagen, Billerica, MA) y el
proteína marcada con 15N se preparó como se describe [17]. La muestra de RMN consistía en 1,7 mg /ml de Su-MUC1-CD, 1% D
2O, compuesto de referencia TMSP (250 mM) y 10 mM d
10-TDT. El pH se ajustó a 5,0 con la adición de HCl 1 M. Una y dos dimensiones
15N heteronuclear individuales recogidas de datos coherencia cuántica (HSQC) se realizaron a 20 ° C y 10 ° C en un sistema MHz Bruker Avance 500 III RMN en las instalaciones de la Universidad de Boston Core de RMN estructural. El análisis de datos se ha generado utilizando el software experto en efectos de Bruker.
medición de la unión Las afinidades
Las afinidades de unión de FITC-GO-202 y FITC-GO-203 se determinaron por el método de unión por saturación [18]. En placas cortas, de 96 pocillos glutatión o recubiertas de níquel (Thermo Fisher, Waltham, MA) se incubaron con 150 l de tampón de PBS que contiene 21.45 g /ml de GST-MUC1-CD, GST-MUC1-CD (AQA) o Su-MUC1-CD durante la noche a 4 ° C seguido de lavado con Tris 50 mM y NaCl 150 mM que contiene 0,1% de Tween-20 (TBST), y el bloqueo con 0,5% de BSA en TBS. A continuación, las placas se lavaron 3 veces con TBST. FITC-GO-202 o-GO-203 FITC se añadió a los pocillos a 0,19 M a 25 M. La unión no específica se determinó en presencia de GST solo. Las placas se incubaron durante 1 h a 37 ° C en un agitador seguido de lavado 3 veces con tampón de unión. La intensidad de fluorescencia se determinó en un Infinito M1000 PRO Tecan lector de microplacas (Tecan, NC) con excitación a 490 nm y emisión a 525 nm. GraphPad Prism 4.0 Software (San Diego, CA) se utilizó para calcular la constante de equilibrio de disociación (Kd) por un método de regresión no lineal.
Caracterización Complex por MALDI-TOF-MS
Encuadernación se llevaron a cabo experimentos con MUC1-CD y GO-203 como se describe [19]. Complejos se eluyeron de las perlas de glutatión, se dializa y se concentraron utilizando filtros Amicon de ultra centrífugas (Millipore, Billerica, MA). Los complejos se sometieron a continuación a electroforesis no reductora y se tiñeron con azul de Coomassie. Las bandas de proteínas se extirparon y se analizaron por MALDI-TOF-MS como se describe [20]. Brevemente, los geles se cortaron en trozos pequeños y uniformes; las piezas de gel fueron deshidratadas con acetonitrilo y después rehidratada en bicarbonato de amonio 100 mM seguido de 2 ciclos de lavado y secado con bicarbonato de amonio y acetonitrilo, respectivamente. Después de la deshidratación completa, piezas de gel se suspendieron en 12,5 ng /l de tripsina en bicarbonato de amonio 50 mM (50 l). En-gel de digestión se llevó a cabo a 37 ° C durante 10 a 12 h y las muestras se acidificó con 50 l de 0,5% de TFA. Treinta l de esta mezcla se desaló por C-18 que contiene Zip-Tip (Millipore, Billerica, MA). péptidos digerida con tripsina se analizaron por MALDI-TOF-MS (ABI-4800). análisis MALDI-TOF-MS se realizaron utilizando un método Reflector que se ha optimizado para adquisición para el intervalo de masas de 700 a 3.500 amu. Los datos fueron recogidos y analizados mediante el paquete de software Data Explorer (AB-Sciex, Framingham, MA) y la mascota (ver.2.0.04, Matrix Science, Boston, MA). El análisis de MS-puente se realizó utilizando Proteína Prospector (ver.4.27.2 básica y Ver.5.0, UCSF). Los parámetros de búsqueda de bases de datos fueron los siguientes: (i) tríptico digerir, (ii) Met oxidado, (iii) 2 divisiones perdidas, y (iv) puente disulfuro con moléculas de enlace máximos establecidos para 2 y una tolerancia de masa de 50 ppm. La búsqueda se realizó en contra GST-MUC1-CD y GO-203.
Construcción de plásmidos
Los vectores que expresan GST-MUC1-CD, GST-MUC1-CD (AQA) y Su-MUC1-CD , GFP-MUC1-CD y FLAG-MUC1-CD se han descrito [7]. Su-etiquetados MUC1-CD (ratas y perros) fueron clonados en el vector pET28a (Clontech, Mountain View, CA) y se expresa en
E
.
coli
BL21 (DE3).
in vitro
dimerización
purificado su-MUC1-CD se incubó en PBS o cantidades cada vez mayores de GO-203 durante 1 h a temperatura ambiente como se describe [19]. Las proteínas fueron separadas en geles no reductores de poliacrilamida y se analizaron por inmunotransferencia.
Cell Cultura
ZR-75-1 humana de cáncer de mama (ATTC) y cáncer de pulmón H1975 (ATTC) líneas de células se crecido en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (HI-FBS), 100 unidades /ml de penicilina inactivado por calor, y 100 mg /ml de estreptomicina. células 293T se cultivaron en DMEM con 10% HI-FBS, antibióticos y 2 mmol /L de L-glutamina. Las células se trataron con FITC conjugado-GO-202 (FITC-GO-202), FITC-GO-203 o no conjugada GO-203 sintetizado por el biopolímero Laboratorio MIT (Cambridge, MA) y AnaSpec, Inc (San Jose, CA). El p3XFLAG-CMV-10 (Sigma, St. Louis, MO), pEGFP-C1 y pDsRed-monómero-N1 (Clontech, Mountain View, CA) vectores se usaron para la transfección de ratas y perros MUC1-CD y MUC1 humana de longitud completa en células 293T en presencia de Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Grand Island, NY).
inmunoprecipitación y análisis de inmunotransferencia
los lisados celulares se prepararon como se describe [19]. Las proteínas solubles se inmunoprecipitaron con anti-FLAG (Sigma, St. Louis, MO), anti-MUC1-C (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) o un IgG de control. Los precipitados y los lisados no sometidos a inmunoprecipitación se inmunotransfirieron con anti-MUC1-C, anti-GFP (Abcam, Cambridge, MA), anti-FLAG y anti-FITC (Life Technologies, Grand Island, NY). La reactividad se detectó con peroxidasa de rábano conjugada secundaria de anticuerpos y quimioluminiscencia.
Análisis de GO-203 Localización
Las células 293T fueron transfectadas con MUC1-pDsRed-monómero-N1 en presencia de Lipofectamine 2000 48 h. Las células se incubaron con FITC-GO-203 para 3 h y se examinaron usando un sistema de epifluorescencia de campo amplio Nikon-deconvolución con un objetivo de inmersión en aceite de 100x. Las imágenes fueron capturadas usando software de NIS-elemento (Nikon) y se analizaron mediante el software ImageJ.
Resultados
Análisis de la Estructura MUC1-C dominio citoplásmico
Para definir la estructura de la ácido 72-amino MUC1 dominio citoplásmico (MUC1-CD), se utilizó por primera vez varias condiciones para generar cristales con la proteína MUC1-CD purificada. Estos intentos de cristalización no tuvieron éxito, nos llevó a explorar los estudios de simulación molecular. En primer lugar, volvimos hacia el modelado de homología como un enfoque para asignar los aspectos estructurales de MUC1-CD. Notablemente, sin embargo, MUC1-CD exhibe poca o ninguna homología de secuencia con proteínas conocidas. De acuerdo con ello, se estudió la estructura secundaria predicciones para MUC1-CD utilizando diferentes métodos, incluyendo Robetta [21] y IGB-SSPro [22]. Los resultados de estos estudios indican que colectivamente MUC1-CD no se ajusta a una estructura secundaria típica.
por lo tanto centramos nuestros esfuerzos en los primeros 15 aminoácidos de MUC1-CD (CQCRRKNYGQLDFIP) mediante el estudio de su dinámica molecular atomísticos . La MUC1-CD (1-15) modelo fue construido
ab-initio
con los ángulos /psi phi preferidas de aminoácidos. A continuación, la estructura resultante se estudió con agua y los iones explícita. El uso de simulaciones cortas 15 nanosegundos (1500 conformaciones separadas por 10 picosegundos) con ámbar y como se demuestra por RMSD, hemos encontrado que la MUC1-CD (1-15) secuencia es también, por naturaleza no estructurada sin conformaciones preferidas (figura 1A). Además, el análisis de RMN de MUC1-CD confirmó la ausencia de una estructura secundaria detectable (Fig 1B-1D), como se muestra por la presencia de los picos entre 7,5 y 8,5 ppm, en consonancia con MUC1-CD es una proteína no estructurada.
(a) RMSD de instantáneas obtenidas por el primer
ab initio
estructura de MUC1-CD (1-15). Eje Y es la RMSD y el eje X es la secuencia instantánea (picosegundos). (B) los espectros de RMN de protón (1D) y
15N-HSQC espectros de MUC1-CD (1-15) fueron adquiridos a 500 MHz a (C) 20 ° C y (D) 10 ° C a pH 5,0.
MUC1-CD (1-15) contiene un motivo de CQC seguido de tres residuos cargados positivamente (RRK). La región citoplasmática CQCRRK se encuentra adyacente a la membrana celular (predicho por TMpred & amp; Phobius) y por lo tanto podría jugar un papel en la estructura de MUC1-CD debido a las interacciones carga-carga con las capas de lípidos cargados negativamente. Por ello, estudiaron el efecto potencial de la capa lipídica de la membrana celular de los residuos CQCRRK. Una secuencia de MUC1 ácido amino 45 (SAQSGAG-VPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAV-CQCRRKNYGQ) fue construido
ab initio
con parte del dominio MUC1-C /extracelular (MUC1-C /ECD; SAQSGAG), la MUC1 de 28 aminoácidos -C dominio /transmembrana (MUC1-C /TMD; VPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAV) y los primeros 10 residuos de MUC1-CD (CQCRRKNYGQ). Según lo determinado por los estudios de dinámica molecular, el TMD tiene una conformación de hélice predominante (Fig 2A). Los aminoácidos restantes se construyeron con sus ángulos /psi phi preferido. La estructura resultante se insertó en un parche de membrana representante (POPC bicapa) y los estudios de dinámica molecular atomizados se llevaron a cabo durante 55 ns utilizando el software NAMD. Hemos observado una estructura equilibrada con RMSD estable y una conformación preferida (a su vez) en la región de CQC (figura 2A). También se encontró que los dos residuos Arg orientan preferentemente hacia la membrana debido a las interacciones carga-carga con los fosfatos cargados negativamente de la bicapa lipídica, creando de ese modo un pequeño bolsillo para el motivo CQC (Fig 2B). Esta orientación de bolsillo pequeño preferido, combinado con su proximidad a la bicapa lipídica, apoya la noción de que los residuos de Cys motivo CQC han reducido la libertad conformacional, predispone a formar enlaces disulfuro de manera más eficiente con entrópica pena limitado.
(A ) secundaria de distribución de la estructura de las instantáneas se obtuvieron con respecto al tiempo simulado y evaluado con el algoritmo DSSP. Eje Y es la secuencia de residuos: (1-7-SAQSGAG), (8-35 -VPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAV), (36 a 45 -CQCRRKNYGQ). El eje X es el tiempo en picosegundos (ps). (B) La figura representa una región de la bicapa lipídica destacó como palos de color rosa, rojo y naranja representan monómeros de fosfolípidos con el helicoidal MUC1-C DTM. Los residuos citoplasmáticos de MUC1-C que consiste en CQCRRK se resaltan como un modelo de bolas y palo. Las argininas cargadas positivamente se detuvieron y encerraron a los grupos fosfato cargados negativamente.
Los estudios con la MUC1 CQC Motif
Encuadernación
El motivo MUC1-C CQC confiere la formación de MUC1- homodímeros C necesarios para la función de MUC1-C [7,8]. Por lo tanto, se generaron péptidos que contienen la secuencia CQCRRKN como agentes potenciales que podrían unirse a la bolsa de CQC y bloquear MUC1-C homodimerización. Uno de estos péptidos, designado GO-202, contiene una secuencia poli-Arg para la célula-penetración vinculado a CQCRRKN (L-aminoácidos; Fig 3A). GO-202 se sintetizó con una etiqueta FITC N-terminal para evaluar la unión directa de este péptido a GST-MUC1-CD unido a placas de ELISA de glutatión-revestido. Como se determinó por el método de unión por saturación, la constante de disociación (Kd) era 0,88 M (Fig 3A). También se evaluó la unión de un péptido, denominado GO-203, en el que el dominio de penetración celular de poli-Arg está vinculada a CQCRRKN (D-aminoácidos; Figura 3B). La incubación de GO-203 marcado con FITC a GST-MUC1-CD demostró una Kd de 0,63 M (figura 3B). Para confirmar la especificidad de la unión, FITC-GO-203 se incubó con Su-MUC1-CD unido a placas de ELISA recubiertas de níquel (figura 3C). En estos estudios, la Kd fue de 0,86 M, lo que indica que la interacción entre GO-203 y MUC1-CD no es conferido por la GST o His-tag. Para confirmar la especificidad de la interacción, FITC-GO-203 también se incubó con GST-MUC1-CD en el que el motivo CQC fue mutado a AQA. Aquí, no hay interacción fue evidente entre FITC-GO-203 y GST-MUC1-CD (AQA) como el apoyo de la detección de solamente la fluorescencia de fondo (datos no mostrados). Estos resultados demuestran que tanto los L- y D-formas del péptido CQCRRKN se unen directamente a MUC1-CD y que la unión es específica para el motivo CQC.
(A) Se muestra la secuencia de L-aa de GO -202 y (B) secuencia de D-aa de GO-203. La aparente Kd para la unión de (A) FITC-GO-202 a GST-MUC1-CD, (B) FITC-GO-203 a GST-MUC1-CD y (C) FITC-GO-203 a Su-MUC1-CD proteínas se determinaron mediante experimentos de unión de saturación.
GO-203 Formas disulfuro vínculos con MUC1-CD en el CQC Motif
a fin de evaluar la asociación de GO-203 con MUC1-CD , IR-203 se incubaron con GST-MUC1-CD. Los complejos se separaron por SDS-PAGE y digiere trípticos se analizaron por MALDI-TOF-MS (Fig 4A). la identificación de péptidos se basa en el análisis de MS-puente de los datos digest MALDI-TOF trípticos contra las secuencias de los 2 componentes conocidos de la reacción, es decir GST-MUC1-CD (S1 Fig) y GO-203. El dímero peptídico con un único puente disulfuro en el motivo CQC estuvo representado por el pico de m /z 1483,6084 Da (Fig 4B) y las propiedades que figuran en la Tabla 1. Este pico no se observó en los digestos trípticos de GST + GO-203 y las muestras de GST-MUC1-CD, lo que indica que GO-203 formularios puentes disulfuro específicamente con MUC1-CD, y no con GST.
(A) de digestión con tripsina de la de 35 kDa de GST-MUC1-CD y GO 203 complejo se analizó mediante la huella dactilar de masas MALDI-TOF. (B) El área resaltada en (A) se amplió para mostrar un pico de péptido específico en un m /z 1483 Da debido a la formación de un puente disulfuro entre GO-203 y MUC1-CD.
GO-203 bloques de MUC1-CD Homodimerización
in vitro
La secuencia de MUC1-CD se limita a las especies de mamíferos de haber aparecido tarde en la evolución [6]. La secuencia CQCRRK se conserva en la rata, perro y las proteínas humanas (Figura 5A). Un análisis de proteínas de homología de secuencia utilizando Clustal Omega demostró además que (AAA60019.1) acciones de CD-MUC1 humana significativa homología de secuencia del 83% con las proteínas MUC1-CD de rata (AAI66505) y el perro (NP_001181906.1) (figura 5A). Para evaluar la importancia funcional de CQCRRK, generamos purificado marcado con His proteína de rata MUC1-CD (~ 10 kDa) (Figura 5B). La incubación de la rata Su-MUC1-CD a pH 7,4 se asoció con la formación de homodímeros de ~ 20 kDa (Fig 5B). Por otra parte, la adición de GO-203 en cantidades cada vez mayores en relación con Su-MUC1-CD disminuyó homodimerización (figura 5B). Perro y proteínas MUC1-CD con cola de histidina humanos también forman homodímeros que fueron inhibidas eficazmente por GO-203 (Figura 5C y 5D). Por el contrario, el péptido CP-2, que incluye AQARRKN, no tuvo efecto sobre la homodimerización MUC1-CD humano (Fig 5D).
(A) humano, proteínas de rata y perro MUC1-CD comparten alta homología de secuencia como se alineados utilizando Clustal Omega. Las regiones conservadas se muestran en las cajas, con el cuadro rojo que denota la región CQCRRK. (B) de la rata y el perro (C) purificado su-MUC1-CD proteínas se incubaron con PBS (control) o cantidades crecientes de GO-203 (50, 150 y 450 mM) de 1 h a temperatura ambiente. Las proteínas se separaron en un gel de poliacrilamida no reductor y se analizaron por inmunotransferencia con anti-MUC1-C. (D) purificada humana Su-MUC1-CD proteína se incubó con PBS (control), CP-2 (150 M) o GO-203 (150 M) durante 1 h a temperatura ambiente. Las proteínas se separaron en un gel de poliacrilamida no reductor y se analizaron por inmunotransferencia con anti-MUC1-C.
GO-203 bloques de MUC1-CD Homodimerización en células
A fin de evaluar los efectos de la orientación del motivo MUC1-CD CQCRRK en las células, las células 293T transfectadas para expresar rata Bandera de etiquetado GFP-etiquetados o MUC1-CD (figura 6A, izquierda). Los estudios demostraron que coimmunoprecipitation FLAG-MUC1-CD de forma dímeros con GFP-MUC1-CD (figura 6A, derecha). En particular, el tratamiento de las células 293T transfectadas con GO-203 se asoció con la inhibición de los complejos de FLAG-MUC1-CD /GFP-MUC1-CD (Fig 6a, derecha). Por el contrario, el tratamiento con CP-2 no tuvo ningún efecto aparente (Figura 6A, derecha). La transfección de células 293T para expresar perro etiquetada MUC1-CD (Fig 6B, izquierda y derecha) o humana MUC1-CD (Fig 6C, izquierda y derecha) confirmó la formación de homodímeros de MUC1-CD. Por otra parte, IR-203 de tratamiento dio lugar a la inhibición de la homodimerización MUC1-CD (figura 6B, 6C y derecha, derecha). Además, la demostración de que el tratamiento CP-2 no tiene ningún efecto sobre la formación del homodímero MUC1-CD apoyó la especificidad de la orientación del motivo CQC (figura 6B, 6C y derecha, derecha).
Las células 293T se transfectaron transitoriamente a expresar un vector vacío y (A) de la rata GFP-MUC1-CD y FLAG-MUC1-CD, (B) perro GFP-MUC1-CD y FLAG-MUC1-CD o (C) humana GFP-MUC1-CD y FLAG-MUC1 -DISCOS COMPACTOS. A las 48 h, las células se dejaron sin tratar (control) o tratadas con 5 mM GO-203 o CP-2 cada día durante 3 días. Las células se recogieron a continuación por inmunotransferencia con anti-GFP y anti-FLAG (paneles de la izquierda). lisados de células enteras también se precipitaron con anti-FLAG y se immunoblotted los precipitados con los anticuerpos indicados (paneles de la derecha).
La unión de GO-203 a Endógeno MUC1-C en células
Para determinar si GO-203 se asocia con endógena MUC1-C, que tratan ZR-75-1 células de cáncer de mama con FITC-GO-203. Análisis de anti-MUC1-C precipita por inmunotransferencia con anti-FITC indicó que GO-203 forma complejos con MUC1-C (Figura 7A). Estudios similares realizados en FITC-GO-203-tratadas las células de cáncer de pulmón H1975 previstas más apoyo a la idea de que IR-203 asociados con endógena MUC1-C (Figura 7B). MUC1-C se expresa como una forma kDa N-glicosilada ~ 25-20 y como 17/15 kDa especies no glicosiladas [6,8]. Además, MUC1-C es detectable como homodímeros y oligómeros de orden superior en condiciones no reductoras, como se usa en estos experimentos [8]. En este contexto y como se muestra en la totalidad de las inmunotransferencias obtenidos a partir de los resultados presentados anteriormente (figura 7A y 7B), FITC-GO-203 interactúa con las diferentes formas monómeros y oligómeros MUC1-C (S2A y S2B Fig). Para definir la localización de los complejos de GO-203 /MUC1-C, micoroscopy de inmunofluorescencia se realizó en células 293T transfectadas para expresar DsRedMN1 marcado con MUC1 y /o tratados con FITC-GO-203. 293T células de control incubadas con colorante Hoechst para teñir los núcleos no tenían señales de FITC (Figura 7C) DSred detectable o. Por el contrario, en las células transfectadas para expresar DSRedMN1-MUC1, las señales de DsRed se localizaron predominantemente a lo largo de la membrana celular con algunos puntos del detectables en el núcleo (Fig 7D). En las células 293T tratadas con FITC-GO-203 solo, las señales de FITC fueron localizados a lo largo de la membrana y en el citosol (Fig 7E). Por otra parte, en células 293T que expresan DSRedMN1-MUC1 y tratados con FITC-GO-203, co-localización de las señales de DsRed y FITC (rojo + verde → amarillo) se observó a lo largo de la membrana (Fig 7F). La tinción brillante FITC-GO-203 en las células 293T que expresan MUC1 en comparación a la de la configuración de MUC1 nulo podría explicarse por la retención de FITC-GO-203 en complejos con MUC1-C en la membrana celular.
(A) ZR-75-1 y (B) H1975 células se dejaron sin tratar (control), y se trató con 5 mM FITC-GO-203 durante la noche. La lisis se lleva a cabo en un tampón no reductor. Los lisados se precipitaron con anti-MUC1-C o un IgG de control seguido por adición de no-tampón de muestra reductor. Los precipitados se sometieron a inmunotransferencia con anti-FITC y anti-MUC1-C. células 293T se dejaron sin tratar (C; control), (D) transfectadas transitoriamente con DsRedMN1-MUC1, (E) tratados con 5 M FITC-GO-203, o (F) transfectadas con DsRedMN1-MUC1 y se trató con 5 mM FITC GO-203. Distribución de MUC1 (rojo) o FITC-GO-203 (verde) y colocalización (amarillo) se evaluó mediante microscopía de inmunofluorescencia. Los núcleos se counterstained con colorante Hoechst (azul).
Discusión
La subunidad transmembrana MUC1-C interactúa con las RTK, tales como EGFR, en la superficie celular y contribuye a su activación y aguas abajo vías de señalización intracelular [6,19,23]. En consecuencia, ha habido un interés emergente en la función del dominio citoplásmico MUC1-C como una oncoproteína. En este contexto, la sobreexpresión del dominio citoplásmico MUC1-C es suficiente para conferir el crecimiento y la tumorigenicidad de anclaje independiente [5]. Cómo el dominio citoplásmico MUC1-C induce la transformación ha sido el objeto de estudio considerable; Sin embargo, poco se sabe acerca de la estructura de esta proteína oncogénica. Así, la presente estudios investigaron las características físicas del dominio cytoplastic ácido 72-amino y demuestran que, aparte de la secuencia CQCRRK que reside adyacente a la membrana celular, el resto de esta proteína no tiene una estructura aparente.
La ausencia de identificación hélices alfa o beta-hojas era de interés en que las secuencias de dominio citoplásmico MUC1-C aguas abajo del motivo CQC están sujetos a la fosforilación por quinasas múltiples que incluyen, entre otros, EGFR, MET, SRC, ABL, GSK3 y PKC [ ,,,0],1,4]. A su vez, estas modificaciones post-traduccionales regulan las interacciones del dominio citoplásmico MUC1-C con efectores de diversas vías de señalización que están asociados con la transformación [1,4]. Como un ejemplo, la fosforilación del dominio citoplásmico MUC1-C confiere la unión al efector WNT vía, β-catenina, y por lo tanto la activación de genes diana WNT [5,24]. Otros trabajos han relacionado la MUC1-C dominio citoplásmico a la activación de la p65 de NF-kB [25,26] y STAT1 /3 vías [27,28]. De esta manera, la estructura intrínsecamente desordenados del dominio citoplásmico MUC1-C aparentemente tiene la capacidad de someterse a diversas modificaciones post-traduccionales y de interactuar con múltiples efectores.
Las proteínas con estructuras intrínsecamente desordenadas se encuentran en todo el genoma y incluir oncoproteínas, tales como p53 [29], PTEN [30], el receptor de andrógenos [31] y otros [14]. Estas proteínas pueden presentar desafíos para el desarrollo de fármacos, dada la ausencia de bolsillos o pliegues tridimensionales bien definidas [14]. Por lo tanto, nos centramos en el diseño de agentes que se dirigen el motivo CQC, basado en las observaciones de que las formas MUC1-C endógenos homodímeros y las cisteínas CQC son necesarias y suficientes para esta interacción [7,8]. Por otra parte, se encontró que la mutación del motivo a CQC AQA abrogó la capacidad de MUC1-C para promover la transformación [7]. Los presentes resultados demuestran que un L-amino [R]
9-CQCRRKN que contienen péptido (GO-202) se une directamente al dominio citoplásmico MUC1-C. Curiosamente, se obtuvieron resultados similares con un ácido D-amino [R]
9-CQCRRKN péptido (GO-203), consistente con un efecto de retro-inverso en el que el motivo CQC está flanqueado en ambos lados por aminoácidos básicos. La especificidad de estas interacciones mediadas por cisteína se confirmó en estudios que demuestran que la mutación de CQC a AQA en el dominio citoplásmico MUC1-C o en el péptido de control CP-2 abrogada vinculante.
En concierto con la unión directa a la MUC1- C citoplasmática de dominio CQC motivo, IR-203 fue eficaz en la interrupción de homodímeros MUC1-CD in vitro. Además, IR-203 de tratamiento inhibe la formación de GFP-MUC1-CD /homodímeros FLAG-MUC1-CD en las células, en consonancia con la unión de GO-203 a monómeros-MUC1-CD etiquetado intracelular y bloqueando así la disponibilidad de la MUC1-C citoplasmática motivo de CQC de dominio para la formación de homodímero. En este sentido y de manera importante, los estudios demostraron además coimmunoprecipitation que se asocia con endógena MUC1-C-203-FITC IR en las células de mama y cáncer de pulmón. Además, los estudios indicaron que confocal GO-203 se une predominantemente a MUC1-C en la membrana celular. Estos hallazgos apoyan la idea de que colectivamente IR-203 se une a la MUC1-C citoplasmática de dominio motivo CQC en las células y por lo tanto bloquea la homodimerización MUC1-C y la función.