Extracto
ARLTS1
es un gen supresor de tumores caracterizado recientemente en 13q14.3 , una región con frecuencia elimina en ambos cáncer de próstata esporádico y hereditario (PCA).
ARLTS1
variantes, especialmente Cys148Arg (T442C), aumentar la susceptibilidad a diferentes tipos de cáncer, incluyendo el CaP. En este estudio, el papel de las alternativas Cys148Arg se investigó como un factor de riesgo de CaP utilizando tanto el análisis genético y funcional. Cys148Arg genotipos y expresión de la
ARLTS1
fueron explorados en un gran conjunto de casos familiares y no seleccionados con CaP, muestras de tumores clínicos, xenoinjertos, líneas celulares de cáncer de próstata y la hiperplasia prostática benigna muestras (BPH). La frecuencia de la variante CC genotipo fue significativamente mayor en familiar (OR = 1,67, IC del 95% = 1,08 a 2,56,
P = 0,019
) y no seleccionados pacientes (OR = 1,52, IC 95% = 1.18-1.97 ,
P
= 0,001) y se aumentó el riesgo general (OR = 1,54, IC del 95% = 1,20 a 1,98,
P = 0,0007
). Un análisis adicional con los datos clínico-patológicos reveló una asociación con una enfermedad agresiva (OR = 1,28, IC del 95% = 1,05-∞,
P
= 0,02). El genotipo CC de la variante Cys148Arg también estaba contribuyendo a la
ARLTS1
estado de disminución en la expresión en células linfoblastoides de pacientes familiares. Además rebajado significativamente
se observó ARLTS1
expresión en muestras de tumores clínicas en comparación con muestras de BPH (
P
= 0,01). El
ARLTS1
firma co-expresión basa en los datos de microarrays se generó previamente publicada de 1587 muestras de cáncer que confirma la baja expresión de ARLTS1 en el CaP y demostró que
ARLTS1
expresión está fuertemente asociada con los procesos inmunológicos. Este estudio proporciona una fuerte confirmación de la importancia del papel de la variante
ARLTS1
Cys148Arg como contribuyente en el CaP predisposición y un marcador potencial para la evolución de la enfermedad agresiva
Visto:. Siltanen S, Wahlfors T, M Schindler , Saramäki O, Mpindi JP, Latonen L, et al. (2011) Contribución de los
ARLTS1
Cys148Arg (T442C) Variante con cáncer de próstata de riesgo y función ARLTS1 en células de cáncer de próstata. PLoS ONE 6 (10): e26595. doi: 10.1371 /journal.pone.0026595
Editor: Surinder. K. Batra, Universidad de Nebraska Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: Abril 26, 2011; Aceptado: September 29, 2011; Publicado: 20 Octubre 2011
Derechos de Autor © 2011 Siltanen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por la financiación competitiva de Investigación del hospital de Distrito Pirkanmaa (número de concesión 9L091), Fundación Reino Lahtikari, finlandés cáncer organizaciones, Fundación Sigrid Juselius y la Academia de Finlandia [126714 número de concesión de TW y 116.437 a J.S.]. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
similar al factor de ADP-ribosilación gen supresor de tumores 1 (
ARLTS1
), también conocida como proteína similar al factor de ADP-ribosilación 11 (
ARL11
), es una nueva gen caracterizado situado en el locus 13q14.3. ARLTS1 pertenece al factor de ADP-ribosilación (ARF) -ARF similar (ARL) de la familia de la proteína Ras superfamilia [1]. ARF son proteínas guanina-nucleótido vinculante que son componentes críticos de diferentes vías de tráfico de vesículas eucariota. Al igual que con otros miembros de la superfamilia Ras, ARF funcionan como interruptores moleculares por ciclo entre GDP inactiva y conformaciones activa unida a GTP [2]. ARLTS1 se ha caracterizado como una proteína que tiene la expresión específica de tejido intracelular en el pulmón y leucocitos.
ARLTS1
variantes, tales como el polimorfismo sin sentido Trp149Stop (G446A) y el polimorfismo missense Cys148Arg (T442C), se ha sugerido que desempeñar un papel en diferentes tipos de cáncer [3] - [6].
el cáncer de próstata es el cáncer más frecuentemente diagnosticado en los hombres en muchos países, entre ellos Finlandia. Envejecimiento y la mejora de los diagnósticos más evidente que aumentan el número de nuevos casos, pero la incidencia está influenciada también por algunos factores desconocidos. Creciente número de nuevos casos crear presión para el sistema de salud y las nuevas herramientas para el diagnóstico de CaP, pronósticos y tratamientos son necesarios, sobre todo para evitar el exceso de tratamiento y biopsias innecesarias. Durante los últimos años ha habido una extensa investigación en varias alteraciones genéticas de baja penetrancia comunes CaP etiología y estudios de asociación de genoma completo han revelado. La asociación de estas variantes con características clínico y el pronóstico sigue siendo poco clara y los resultados se carece de implicaciones clínicas.
Recientemente, hemos mostrado una variante withCys148Arg (T442C) asociación significativa y el riesgo de CaP [7]. Una evaluación más profunda de esta variante está garantizado para aumentar el poder de la asociación y estudiar el papel funcional de la variante en el CaP. También se necesitan más muestras para evaluar la implicación de esta variante con el resultado clínico y un papel potencial en biomarcador predictivo de CaP.
Además de las variantes genéticas, el número de copias de ADN aberraciones son uno de los cambios genéticos observados con mayor frecuencia en familiar y esporádica CaP [8] - [10]. En la mayoría de los casos los genes objetivo para las aberraciones no están completamente identificados. Curiosamente, el desequilibrio alélica (AI) se ha detectado en 13q14.2-13q14.3, y es un evento importante en la progresión de CaP localizado [11]. Las diferencias de 13q14 pérdida de heterocigosidad (LOH) en diferentes grupos CaP también podrían ser utilizados para distinguir clínicamente insignificante CaP [12], [13].
En este estudio se analizó el papel de
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con más detalle, sobre todo el papel de Cys148Arg (T442C) en el riesgo de CaP. aberración cromosómica en 13q14.3 se analizó con aCGH para evaluar la
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copia número cambia en xenoinjertos de CaP y líneas celulares. La expresión de
ARLTS1
se estudió en muestras tumorales clínicas, muestras de HPB y datos de formulario de datos también co-expresión publicó anteriormente se analizó.
Métodos
Estudio de la población
Todas las muestras recogidas son de origen finlandés. Identificación y recolección de las familias finlandesas HPC se han descrito en otra parte [14]. Las muestras de familiares genotipo en este estudio tenían al menos un afectado primer o segundo grado. Las características clínicas de los pacientes familiares se pueden encontrar en la Tabla S1.
Los pacientes no seleccionados con cáncer de próstata consecutiva fueron diagnosticados con CaP entre 1999 y 2005 en el Departamento de Urología del Hospital Universitario de Tampere. El hospital es un centro de referencia regional en la zona para todos los pacientes con CaP, lo que resulta en una colección seleccionada, basado en la población de pacientes. Las características clínicas de la CP consecutivos no seleccionados se pueden encontrar en la Tabla S1.
Un conjunto de casos de hiperplasia prostática benigna (BPH) también se utilizó en este estudio. El diagnóstico de esta cohorte HPB se basa en los síntomas del tracto urinario inferior, flujometría libre, y la evidencia de un aumento de tamaño de la próstata obtenidos mediante palpación o ecografía transrectal. Si el PSA fue elevado o tacto rectal o transrectal ecografía mostró ninguna anomalía indicativa de CaP, los pacientes se les realizó una biopsia para excluir el diagnóstico de CaP, de alto grado de neoplasia intraepitelial prostática (PIN), la proliferación de células pequeñas acinar atípica (ASAP), o la sospecha de malignidad.
tumores de próstata clínicos se obtuvieron de hospital Universitario de Tampere (Tampere, Finlandia), incluyendo muestras de tumor de próstata recién congelado en representación de la hiperplasia prostática benigna (BPH,
n
= 14), dependiente de andrógenos (
n
= 14) y de la hormona-refractario (
n = 6)
carcinomas. Los especímenes se examinaron histológicamente para detectar la presencia de células tumorales utilizando H & amp; E tinción. Sólo las muestras que contienen & gt; se seleccionaron 60% de células epiteliales cancerosas o hiperplásicas para los análisis. Las muestras se obtuvieron a partir de la HBP piezas de prostatectomía de pacientes con cáncer y fueron histológicamente verificado que no contienen ningún células cancerosas. Las muestras de carcinomas refractarios a las hormonas se obtuvieron de resecciones transuretrales de la próstata (RTUP) de los pacientes que experimentan obstrucción uretral pesar de la terapia hormonal en curso. El tiempo desde el comienzo de la terapia hormonal para la progresión (RTUP) varió de 15 a 60 meses. El uso de material clínico del tumor fue aprobado por el Comité Ético del Hospital Universitario de Tampere.
Las muestras de control consistieron en muestras de ADN de los donantes de sangre anónimas, voluntarias y sanos obtenidos del Centro de Sangre de la Cruz Roja Finlandesa en Tampere. Las muestras de sangre EDTA utilizados como referencia en Q-RT-PCR fueron de donantes anónimos sanos.
información y muestras de los pacientes se obtuvieron con pleno consentimiento informado. El estudio se realizó bajo los permisos apropiados de investigación de los Comités de Ética del Hospital Universitario de Tampere, Finlandia, así como el Ministerio de Asuntos Sociales y Salud de Finlandia.
Las líneas celulares y xenoinjertos
La CaP líneas celulares LNCaP, DU145, PC-3, NCI-660 y 22Rv1 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.), mientras que LAPC-4 fue proporcionado amablemente por el Dr. Charles Sawyers (UCLA, Los Ángeles, CA ), y la línea celular VCAP fue proporcionado por el Dr. Jack Schalken (Radboud University Nijmegen Medical Centre, Nijmegen, Países Bajos). Todas las líneas celulares se cultivaron en las condiciones recomendadas. PrEC células primarias se obtuvieron de Lonza (Walkersville, MD, EE.UU.). EP156T es una línea celular inmortalizada epitelial prostático normal h-ter [15] que fue puesto a disposición por uno de los autores (visto bueno). Se extrajo el ADN de acuerdo a los protocolos estándar de laboratorio y el ARN total se extrajo con el reactivo Trizol (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.).
Diecinueve xenoinjertos CaP humanos de la serie LuCaP utilizados en la secuenciación directa y quince de ellos se utiliza en Q-RT-PCR fueron puestos a disposición por uno de los autores (RLV) y se han descrito en otra parte [16], [17].
las líneas de células linfoblásticas se obtuvieron mediante la transformación del virus de Epstein-Barr de los leucocitos mononucleares periféricas de pacientes. líneas de células linfoblastoides se cultivaron en medio RPMI-1640 (Lonza, Walkersville, MD, EE.UU.) suplementado con suero bovino fetal al 10% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) y antibióticos. Los sedimentos celulares se congelaron rápidamente-y el ARN total fue extraído a partir de células con Trizol® de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.).
Mutación de cribado
La mutación de cribado el ADN genómico se realizó por secuenciación directa. La secuenciación se realizó en un Biosystems 3130xl analizador Applied Genetic (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Los cebadores y las condiciones de PCR utilizadas en la detección de mutaciones están disponibles bajo petición.
Genotipado
La genotipificación se realiza con la genotipificación de SNP TaqMan ® ensayo personalizado utilizando el sistema de detección de secuencias ABI Prism 7900HT (Life Technologies Corporación , Carlsbad, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Los cebadores y sondas para los rs3803185 Cys148Arg (T442C) SNP fueron suministrados por Applied Biosystems través del Generador de archivos de software 3.1.
Cuantitativo en tiempo real PCR con transcripción inversa
La expresión génica análisis se realizaron utilizando LightCycler ® (Roche, Mannheim, Alemania) y Bio-Rad CFX96 ™ real-Time PCR sistema de detección (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.). ARN total fue aislado de las líneas celulares, muestras de tumores clínicas y xenoinjertos como se describe anteriormente [18], [19]. ARN a partir de líneas celulares transcrito fue invertir en primera línea de cDNA utilizando superíndices ™ III primer capítulo de síntesis Supermix kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y hexámeros aleatorios. ARN a partir de muestras de tumores clínicas y xenoinjertos fue transcrito inverso como se describe anteriormente [18], [19]. ARN normal de la próstata humana se obtuvo de Ambion (Cambridgeshire, Reino Unido). Para los análisis de LightCycler®, cebadores y sonda fija se obtuvieron de TIB MOLBIOL (Berlín, Alemania). Las reacciones de PCR se realizaron con un LightCycler® FastStart DNA Maestro
PLUS kit HybProbe (Roche, Mannheim, Alemania). software LightCycler® (Roche, Mannheim, Alemania) se utilizó para el análisis de datos. El ensayo TaqMan para
ARLTS1
fue utilizado para los análisis de Bio-Rad. Los cebadores y sondas se obtuvieron de TIB Molbiol (Berlin, Alemania). Bio-Rad iQ Supermix se utilizó para las reacciones de PCR y el Administrador de CFX ™ Software versión 1.6 para el análisis de datos. Los niveles de expresión de
ARLTS1
se normalizaron en contra de la limpieza de genes
TBP gratis (proteína de unión a TATA box) o en contra de los niveles de ARN.
TBP
fue elegido como el gen de referencia, porque no hay retropseudogenes conocidos por él, y la expresión de
TBP
es inferior a la de muchos, los genes de referencia, expresado abundantemente utilizadas frecuentemente [20] .
Western blotting
Las células se lisaron en un tampón que contiene 50 mM Tris-HCl pH 7,5, NaCl 150 mM, 0,5% de Triton-X-100, DTT 1 mM, PMSF 1 mM y 1 x completo cóctel inhibidor de proteasa (Roche, Mannheim, Alemania). Los lisados se sometió a ultrasonidos 4 x 30 s con el instrumento Bioruptor (Diagenode, Lieja, Bélgica) y los restos celulares se eliminaron por centrifugación. Las proteínas se separaron por electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) y se transfirieron a una membrana de PVDF (Immobilon-P; Millipore, Billerica, MA, EE.UU.). Los anticuerpos primarios utilizados fueron anti-ARL11 (Aviva Biología de Sistemas, San Diego, CA, EE.UU.) y anti-actina (pan, clon ACTN05, Neomarkers, Fremont, CA, EE.UU.), que fueron detectados por anticuerpos secundarios conjugados con HRP (Dako, Dinamarca) y el reactivo luminol Western Blot (Santa Cruz biotecnologías, CA, EE.UU.) por autorradiografía.
array hibridación genómica comparada
array hibridación genómica comparada (aCGH) se realizó en líneas celulares y xenoinjertos CaP con el Genoma humano CGH Microarray Kit 244A (Agilent, Santa Clara, CA, EE.UU.), y como se describe en Saramäki O et al, 2006 [19].
el análisis estadístico
Asociación de la Cys148Arg (T442C) variante se ensayó mediante análisis de regresión logística con el programa SPSS paquete de software estadístico (SPSS 15.0; SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.). Asociación con características clínicas y patológicas de la enfermedad (la edad de inicio, el valor del PSA en el diagnóstico, T, N y M-estadio, el grado de la OMS y la puntuación de Gleason) se puso a prueba entre los casos familiares y no seleccionados con CaP por la prueba de Kruskal-Wallis, Fisher La prueba exacta, y t-test incluidos en el paquete R "estadísticas". pacientes con CaP fueron clasificados con una enfermedad agresiva si tenían alguna de las siguientes características: a localmente avanzado o tumor metastásico (estadio T3, T4, N1 o M1, basado en la patología si se realiza una prostatectomía radical, de lo contrario, el estadio clínico), tumor de grado de Gleason ≥7 el momento del diagnóstico, mal diferenciada de grado (grado III de la OMS, si ningún grado de Gleason está disponible) o PSA pretratamiento en el diagnóstico ≥20 ng /ml.
análisis de Co-expresión de
ARLTS1
previamente publicados en microarrays de datos
El
ARLTS1
firma co-expresión se generó a partir de los GeneSapiens [21] base de datos de expresión de ARNm.
se determinó ARLTS1
expresión entre 1587 muestras de tumores y entre 497 muestras normales. Se utilizó la correlación de Pearson para identificar los genes que positiva y negativamente correlacionados con
ARLTS1 Estar entre muestras normales y muestras tumorales.
Análisis Funcional anotación
Conjuntos de genes fueron exploradas para el enriquecimiento de funciones categorías de anotación como ontología de genes (GO), utilizando herramientas dentro del programa EASE (http://david.abcc.ncifcrf.gov/) [22]. Los mejores 100 genes que fueron correlacionar positivamente con
ARLTS1 Estar entre muestras normales se comprobó la ontología de genes enriquecido.
Resultados
Toda la región de codificación de
ARLTS1
fue proyectado previamente en un total de 164 pacientes con CaP familiares y en un total de 377 pacientes con CaP no seleccionados, así como en 381 muestras de control [7]. Aquí el (T442C) Cys148Arg se genotipo variante más familiar en 48 pacientes con CaP, 1.471 pacientes no seleccionados con CaP, 375 pacientes con HBP y 379 controles. Mediante la utilización de nuestros datos anteriores y genotipificación de los casos más familiares y no seleccionados con CaP, se validó una asociación estadísticamente significativa entre Cys148Arg (T442C) y el riesgo de CaP (Tabla 1). Al considerar los casos de CaP familiares, y la asociación con el alelo de riesgo C, la forma homocigotos CC alcanzó un
P
valor de 0,019 (OR 1,67; IC del 95%: 1,08 a 2,56). Dentro de los casos no seleccionados, el riesgo también fue significativa (OR 1,52, IC del 95%: 1,18 a 1,97,
P
= 0,001). Al combinar los conjuntos de datos de casos familiares y no seleccionados (2060 muestras en total), se encontró el (T442C) Cys148Arg variante que se asociaron significativamente con el riesgo de CaP (OR 1,54; IC del 95%: 1,20 a 1,98,
P = 0,0007
). asociación significativa sólo se encontró al comparar las frecuencias de la forma homocigotos del alelo C de riesgos a las frecuencias de la forma homocigótica del T. alelo de tipo salvaje no se encontró asociación entre la frecuencia de CC y la HPB (Tabla 1).
Cuando se estudia la segregación de los genotipos Cys148Arg (T442C) CC en 86 familias en las que se detectó el índice como un portador, la segregación completa de la variante CC con cáncer de fenotipo se observó en una familia (familia 427 en la figura . 1). En el resto de la segregación de las familias era incompleta, sin embargo, lo que indica una clara asociación con
ARLTS1
genotipo CC o CT y fenotipo del cáncer (familias 402 y 408 en la Fig. 1).
Los cuadrados representan los machos ; círculos representan las hembras. Los símbolos abiertos indican que no hay neoplasia, y los símbolos sólidos muestran los casos de cáncer de próstata. + Indica la presencia de la variante T442C en la muestra de ADN de los miembros de la familia, seguido por el genotipo real. Una flecha indica el individuo proyectó inicialmente para
variantes ARLTS1
secuencia. La edad de diagnóstico para pacientes con cáncer de próstata (en años) se indica debajo del símbolo para cada miembro de la familia. Un asterisco (*) denota las personas con ninguna de las muestras disponibles.
La secuenciación directa se utilizó para examinar las frecuencias de
ARLTS1
variantes en los tumores de próstata clínicos. En los carcinomas de próstata clínicos, encontramos variantes en cuatro sitios, Gly65Val (G194T), Pro131Leu (C392T), Cys148Arg (T442C) y Trp149Stop (G446A) (Tabla 2). En el sitio Cys148Arg (T442C), la frecuencia de la cáncer asociado genotipo de riesgo CC era relativamente alta (28,3%) en comparación con la frecuencia combinada de los casos familiares y no seleccionados 21.2% (Tabla 1). Sin embargo, se detectó la mayor frecuencia de Cys148Arg genotipo (T442C) CC en muestras de xenoinjerto (42,1%). Esto es intrigante ya que las muestras LuCaP xenoinjertos son considerados como una representación muy homogénea de CaP.
Para investigar el papel de Cys148Arg (T442C) genotipo en
ARLTS1
expresión se seleccionaron 24 pacientes familiares , incluyendo ocho de cada grupo de genotipo TT, CT y CC. Expresión analiza por Q-RT-PCR se llevaron a cabo utilizando el ARN extraído de las líneas celulares linfoblastoides de los pacientes.
ARLTS1
ARNm se expresó diferencialmente entre los tres grupos de genotipos (Fig. 2). La expresión se redujo significativamente en los pacientes que portan el genotipo CC (
P
= 0,02).
Determinado por Q-RT-PCR. *,
P Hotel & lt; 0,05. Columnas, con una media de ocho personas; bares, Dakota del Sur.
ARLTS1
niveles de expresión se analizaron también en quince Lucap muestras de xenoinjerto, seis líneas celulares de CaP, dos líneas de células epiteliales de la próstata y en el ARN de muestra normal de la próstata. Entre las muestras de xenoinjerto analizadas, una reducción significativa en
se observó ARLTS1
expresión en dos de las muestras (13%) en comparación con su expresión en la muestra normal de la próstata (Fig. 3A). La pérdida total de la expresión se observó en 11 (73%) de las muestras de xenoinjerto (Fig. 3A). Dos de las muestras de xenoinjerto, LuCaP23.1 y LuCaP49, tenían mayores
ARLTS1
niveles de expresión en comparación con el tejido normal. Seis de los catorce (43%)
ARLTS1
muestras de xenoinjerto-regulado tenían un genotipo CC para la variante Cys148Arg (T442C). Cuando array de hibridación genómica comparada (aCGH) se realizó utilizando estas muestras, 12/15 muestras de xenoinjertos mostraron una pérdida en la región cromosómica de 13q14.3 (Fig. 3A).
El Cys148Arg (T442C), así genotipo como se muestra la aberración choromosomal. C, Cys148Arg (T442C) variante en dos muestras de tejido de cáncer clínicos y en dos ADN normal de la sangre (secuencias están en orientación inversa). * Determinado como en el Saramäki O et al., 2006.
En las líneas celulares de CaP, 5/6 (83%) mostraron una disminución en la expresión o la perdida de
ARLTS1
si se compara con RNA de próstata normal (Fig. 3A). Un
ARLTS1
locus de eliminación en 13q14.3 fue encontrado en PC-3, VCAP, LNCaP y DU-145. Entre estos, el último también tenía el genotipo CC para Cys148Arg (T442C). Curiosamente, el Cys148Arg (T442C) variante era la única
ARLTS1
variante se encuentra en cualquiera de las líneas de células de CaP. Epitelial de próstata EP156T línea celular mostró pérdida de la expresión. Estos resultados indican que es probable
ARLTS1
expresión es baja en las células epiteliales del PCA.
ARLTS1
expresión también se evaluó con el mismo criterio en un panel de muestras de tejido de HBP catorce , catorce primaria y seis muestras de tumores refractarios a las hormonas (Fig. 3B).
ARLTS1
expresión era signinificantly más baja (
P
= 0,01) en los tumores clínicos en comparación con muestras de HPB, que apoya aún más su papel como una proteína supresora de tumores (Fig. 3B).
En los tumores de próstata clínicos, se estudió la existencia de LOH. ADN germinal de pacientes portadores de la variante Cys148Arg (T442C) se analizó por secuenciación directa. Secuenciación resultados mostraron que en dos casos (muestras de 261 y 530) el alelo T en la sangre había sido sustituido con un alelo C en el tejido canceroso (Fig. 3C), que sugiere un papel para
ARLTS1
en la supresión tumoral es decir, la inactivación de ambos alelos en la carcinogénesis. Cuando los parámetros clínicos (OMS grado, Gleason y el T-score) se examinaron, una de las dos variantes de transporte de "Loh-pacientes" tenían una puntuación de Gleason de 9 y de la OMS grado 3, lo que indica una forma agresiva de la enfermedad. El otro caso tuvo un grado de la OMS de 3, pero no hay puntuación de Gleason estaba disponible.
Expresión
ARLTS1, se determinó por Western Blot (Fig. 4). Los lisados celulares estaban disponibles a partir de líneas celulares de cáncer de próstata seis, (22Rv1, LAPC-4, PC-3, VCAP, LNCaP, DU-145) y de la línea celular epitelial de próstata EP156T normal. ARLTS1 expresión fue altamente convergente con el estado ARLTS1 ARNm mostró en la Fig. 3A. Como era de esperar, las líneas celulares LNCaP y DU-145 EP156T mostraron expresión negativa. En líneas celulares de cáncer de próstata 22Rv1 y PC-3 expresión ARLTS1 fue correspondiente a valores relativos de expresión de ARNm, mientras que en PCA línea celular estado de la expresión de proteínas LAPC4 era más bajo que el nivel de expresión mRNA. PCA línea celular VCAP mostró la expresión más alta ARLTS1 que no se corresponde con el estado de expresión relativa negativo visto en Q-RT-PCR.
Proteína estado de expresión en líneas celulares de cáncer de próstata y de seis en una línea de células epiteliales normales de la próstata. La actina se muestra como control de carga. ARL11 espera /Mw observó 21,4 kDa. Una banda no específica está marcado con un asterisco (*).
Cuando las características (edad al momento del diagnóstico, el valor del PSA en el diagnóstico clínico, grado de la OMS y la puntuación de Gleason T, N y M-etapa, ) se incluyeron en los análisis de genotipo de datos de la línea germinal, el genotipo CC se asoció significativamente con una menor edad en el diagnóstico y el valor de PSA (
P = 0,05
y
P
= 0,03, respectivamente) entre el material no seleccionado. Este fenómeno también se observó en nuestro estudio anterior, donde el genotipo CC de Cys148Arg (T442C) se asoció con altas puntuaciones de Gleason (
P
= 0,01) y PSA elevados (≥ 7) al momento del diagnóstico (
P
= 0,05) [7]. Cuando se examinó la correlación entre el estado de la enfermedad agresiva y la aparición del genotipo CC, encontramos una asociación estadísticamente significativa (
P
= 0,02) entre los casos no seleccionados (Tabla 3). Dentro de los casos de CaP familiares, no se encontró asociación entre el genotipo CC en el locus Cys148Arg (T442C) y cualquiera de las variables clínicas o con CaP agresivo.
ARLTS1
expresión en el diferentes tejidos del cuerpo se muestran en la Figura S1. La figura ilustra que
ARLTS1
es altamente expresado en el hematológicos y del sistema linfático. Los resultados del análisis de la co-expresión ilustran una fuerte asociación con los procesos del sistema inmune, revelando una puntuación de enriquecimiento para el grupo de 6,67 y un valor de p de 2.1e-7. Estos resultados se generaron a partir de los 100 mejores genes con un valor de correlación superior a 0,3 entre las muestras normales. Entre las muestras de cáncer, la categoría de los procesos del sistema inmunológico tenía la puntuación más alta del enriquecimiento 14.89 con un p-valor de 5.3E-21 y la puntuación Benjamin ajustado de 2.8e-17. No se identificó ningún fuerte ontología de genes asociados con las 100 principales genes que se correlacionaron negativamente con
ARLTS1 Estar entre las muestras de cáncer. Se confirmó nuestros hallazgos utilizando un conjunto de datos separada de la expo (CIG:. Proyecto Expresión de Oncología 2008 [http://www.intgen.org/expo.cfm]). Los resultados muestran que el 56% de los genes fueron identificados comúnmente para correlacionar positivamente con
ARLTS1
, ya sea en el conjunto de datos compuesta por las muestras de cáncer. Los genes con una correlación positiva por encima de 0,3 identificado en la intersección produjeron una muy fuerte puntuación gen ontología enriquecimiento de 18,12 para el proceso de sistema inmune con un valor de p de 2.1e-24 como se muestra en la Figura S2. La expresión de genes entre las muestras de CaP se demuestra que es muy bajo para
ARLTS1
. No hemos podido establecer de forma fiable cualquier relación significativa con CaP de
ARLTS1
utilizando los datos de expresión de genes debido a los bajos niveles de expresión.
Discusión
El
ARLTS1
gen y
ARLTS1
polimorfismos se han demostrado tener un papel en la patogénesis de muchos tipos de cáncer. El polimorfismo sin sentido al final de la región de codificación se ha puesto de manifiesto que predisponen al cáncer familiar [8]. Análisis funcional de la proteína truncada han indicado que la variante Trp149Stop podría afectar a la apoptosis y la supresión de tumores. Otro
ARLTS1
variante, el polimorfismo missense Cys148Arg (T442C), y especialmente el genotipo CC, se ha encontrado que se asocia significativamente con alto riesgo de cáncer de mama familiar [4]. También se encontró la misma variante de estar asociado con la predisposición al melanoma [5]. Las funciones de los
ARLTS1
variantes también se han estudiado con el cáncer colorrectal [23] y la leucemia linfocítica crónica (LLC) [24], pero no se han encontrado asociaciones.
En el presente estudio, se mostró una asociación con el
ARLTS1
Cys148Arg variante (T442C) y el elevado riesgo de CaP, validar nuestros resultados anteriores [7]. Anteriormente, hemos secuenciado 164 familiares y 377 muestras no seleccionados con CaP junto con 809 controles, y Cys148Arg (T442C) mostró una asociación significativa con el riesgo de CaP (OR 1,19; IC del 95%: 1,02-1,39,
P
= 0,020), pero el importancia no se mantuvo cuando los datos se subdividen en los casos familiares y no seleccionados. Sin embargo, cuando el alelo C se supone que es recesiva, todos los datos (familiar y no seleccionados) mostraron asociación significativa entre el genotipo CC y el riesgo de CaP (
P
= 0,005). Aquí se genotipo más casos familiares y no seleccionados con CaP y Cys148Arg (T442C) reveló una asociación estadísticamente significativa con el riesgo de CaP entre tanto familiar (OR = 1,67, IC del 95% = 1,08 a 2,56,
P = 0,019
) y no seleccionado pacientes con CaP (OR = 1,52, 95% CI = 1,18-1,97,
P
= 0,001). En el conjunto de datos combinados de ambos casos familiares y no seleccionados, se incrementó aún más el riesgo general (OR = 1,54 IC 95% = 1,20 a 1,98,
P = 0,0007
). Por consiguiente, el hecho de que el análisis anterior no se mantuvo cuando se divide a las subclases podría explicarse por el tamaño del estudio. El presente estudio tiene una potencia de aproximadamente 100% para detectar asociación en comparación con 94% del estudio anterior. seguimiento con el tamaño de muestra más grande es probable que la asociación aún más fuerte. No se encontró asociación entre esta variante y la HPB, lo que sugiere que el papel de la Cys148Arg (T442C) es menor y el efecto de predisposición de cáncer emerge sólo en los casos más avanzados, especialmente aquellos con un estado agresivo CaP. Como alternativa, la HBP y CaP son eventos independientes o al menos
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no es consecuencia de la transformación de la HPB CaP. Se necesita el tiempo de seguimiento de los pacientes con HBP para evaluar la cuestión de si los pacientes portadores de genotipo CC (16%) son las que en desarrollo del cáncer más adelante.
Sólo la forma homocigotos del alelo C del Cys148Arg (T442C) variante dio lugar a una asociación con el riesgo de CaP en comparación con el genotipo TT. Esto apoya los resultados de estudios anteriores con cáncer de mama [4] que demostraron que C es el alelo de riesgo, mientras que el alelo T tiene un efecto protector o neutro en la carcinogénesis.
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Cys148Arg (T442C), en particular, tiene un efecto predisponente en CaP esporádica. Además, la Cys148Arg era la única
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variante observada a una mayor frecuencia entre las muestras y xenoinjertos de tejido CaP, donde las frecuencias fueron 28,3% y más de 40 por ciento, respectivamente. Esto también indica un papel probable para
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en la carcinogénesis de próstata. Curiosamente, se observó una ausencia total de Trp149Stop (G446C), tanto en muestras de tumores clínicas y en xenoinjertos que indican que esta variante no tiene un papel importante en el desarrollo del CaP.
La población de control en nuestro estudio no estaba en Hardy Weinberg (HWE), lo que sugiere que Cys148Arg podría ser una nueva variante. En nuestros datos, se observó un exceso de heterocigotos que puede indicar la presencia de más de selección dominante o la ocurrencia de exogamia. El fenómeno de la ventaja heterocigotos permite la selección natural para mantener el polimorfismo. La misma población de control se ha utilizado muchas veces en diferentes análisis, y nunca antes ha sido discordante de HWE [25]. Curiosamente, en la población de África subsahariana, el genotipo CC no existe, y en la población asiática que está presente sólo en una pequeña fracción (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Sólo dentro de la población europea hace CC existe en una mayor proporción. Teniendo en cuenta el posible papel de
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en el sistema inmune, puede ser que el genotipo CC ha proporcionado un efecto protector entre los europeos.