Extracto
sintetizados químicamente pequeños ARN de interferencia (siRNA) es una herramienta molecular generalizada utilizado para derribar los genes en células de mamífero. Sin embargo, el diseño de siRNA potente sigue siendo un reto. Entre las herramientas que predicen la eficacia siRNA, muy pocos han sido validados en objetivos endógenos en condiciones experimentales realistas. Hemos descrito previamente una herramienta para ayudar a los siRNA diseño eficiente (DSIR, diseñador de siRNA), que se centra en las características intrínsecas de la secuencia de siRNA. Aquí, se evaluó el rendimiento de DSIR mediante la investigación sistemática de la potencia del siRNA que diseña para apuntar diez genes relacionados con el cáncer. mRNA desmontables se mide por RT-PCR cuantitativa en ensayos basados en células, que revela que más del 60% de secuencias de siRNA diseñado por DSIR silenciado sus genes diana en por lo menos 70%. silenciando la eficacia se mantuvo incluso cuando se utilizaron concentraciones bajas de siRNA. Este análisis sistemático revelado, en particular, que, para un subconjunto de genes, la eficiencia de construcciones de siRNA aumenta significativamente cuando la secuencia se encuentra más cerca de el extremo 5 'de la secuencia de codificación del gen diana, lo que sugiere la distancia al extremo 5' como una nueva característica para la predicción de siRNA potencia. Una nueva versión de DSIR la incorporación de estos nuevos hallazgos, así como la lista de siRNA validado en contra de los genes del cáncer probadas, se ha hecho disponible en la web (http://biodev.extra.cea.fr/DSIR).
Visto: Filhol O, Ciais D, Lajaunie C, P Charbonnier, Foveau N, Vert JP, et al. (2012) DSIR: evaluación del diseño del siRNA muy potentes por las pruebas de un conjunto de genes diana Cáncer-Relevante. PLoS ONE 7 (10): e48057. doi: 10.1371 /journal.pone.0048057
Editor: Szabolcs Semsey, Niels Bohr Institute, Dinamarca
Recibido: August 1, 2012; Aceptado: September 20, 2012; Publicado: 30 Octubre 2012
Derechos de Autor © 2012 Filhol et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo es parte del programa nacional llamado "Cartes d'Identité des Tumeurs" programa (CIT), financiado y desarrollado por la Ligue Nationale Contre le cáncer. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
interferencia de ARN (RNAi) es el proceso por el que un ARN de doble cadena (dsRNA) silencia la expresión de genes, ya sea mediante la inducción de la degradación del ARN mensajero complementario específico de secuencia (ARNm) o por la represión de la traducción [1]. La vía de RNAi de mamífero endógeno usa microARN no codificantes (miRNAs) para modular la expresión génica a través de la represión de traducción y /o escisión de ARNm, apuntando a las regiones 3 'no traducidas (3'UTRs) de ARNm con la que comparten complementariedad parcial [2]. Siguiendo el modelo de estos miRNAs, sintetizado químicamente dsRNA reactivos se encontraron más corta de 30 nucleótidos para desencadenar una respuesta de RNAi específica de la secuencia sin inducir defensas inmunitarias innatas de la célula en los sistemas de mamíferos [3], [4]. pequeñas moléculas de ARN de interferencia (siRNA) Dúplex teóricamente tienen el potencial de inhibir específicamente la expresión de prácticamente cualquier gen diana. Por lo tanto, se han convertido en una herramienta molecular generalizada representa un poderoso medio para estudiar la función de genes [5], [6]. Los estudios preclínicos y algunos primeros ensayos clínicos ya han demostrado que siRNAs tienen potencial como nuevas terapias para una amplia gama de enfermedades, incluyendo el cáncer [7].
Para RNAi para ser fiable, siRNAs debe ser diseñado con cuidado, para asegurar la eficacia y la especificidad de la secuencia seleccionada para su gen diana [6], [8]. siRNA eficacia es una medida de la asociación de cooperación entre la guía de cadena y la maquinaria RISC conduce a la escisión del ARNm. Por el contrario, siRNA especificidad corresponde a un reconocimiento preciso de los sitios objetivo, evitando efectos secundarios no deseados (por ejemplo, de efecto "fuera de diana"). Los estudios basados en datos experimentales y métodos computacionales han informado de que la estructura secundaria de los objetivos y su accesibilidad también fueron importantes, aunque en menor medida, en la determinación de la actividad siRNA [9], [10], [11], [12].
Varios programas y servidores web han sido desarrollados para automatizar el diseño de siRNA. Estos implementan reglas de diseño basados en las preferencias de nucleótidos en posiciones específicas, características de secuencia, la formación potencial de horquilla, perfiles de estabilidad, características de energía, patrones ponderadas y estructura secundaria de ARNm diana. Estas características siRNA se han resumido en los artículos de revisión [véase [13], [14]]. características óptimas siRNA se determinan mejor a partir de datos experimentales. Huesken et al. [15] publicaron un conjunto de 2182 seleccionados al azar siRNA, el cual se analizaron utilizando un sistema de gen indicador fluorescente de alto rendimiento. Esto llevó al desarrollo de una nueva generación de algoritmo basado en técnicas de aprendizaje automático que ha mejorado significativamente el diseño de siRNA, con un coeficiente de correlación de Pearson informado de 0,66-0,67 entre medir y predecir la eficacia. Recientemente, una evaluación de diversas herramientas siRNA-diseñar la conclusión de que
BIOPREDsi
[15],
Thermocomposition
[16] y
DSIR,
un modelo computacional desarrollado por nosotros, [ ,,,0],17] fueron predictores altamente precisos y fiables de siRNA activa [18], [19]. DSIR se basa en un modelo lineal combinando nucleótidos particulares en posiciones dadas y motivos específicos de la guía de cadena siRNA, incluyendo voladizos 2-nt en el extremo 3 '[17]. Esta combinación proporciona eficientes siRNA, probablemente debido a las altas tasas de RISC de unión y /o escisión mediada Ago2 del ARNm diana cadena complementaria [18].
Sin embargo, las características que son cruciales para la predicción óptima de siRNA eficaz es motivo de controversia [13], [14], [20]. Por lo tanto, a pesar de estas mejoras, se queda por determinar qué algoritmo y una herramienta web es óptima, y lo bien predichos siRNAs comportarse en condiciones experimentales realistas. Por un lado, ninguno de los métodos de diseño de siRNA disponibles actualmente cubre el proceso de siRNA-maquinaria completa. Por lo tanto, aunque la contribución relativa de las características tales como la eficiencia siRNA, especificidad o la accesibilidad de destino han sido examinados de forma independiente por su papel en la caída final resultante, un único estudio global aún no se ha realizado. Por otra parte, conjuntos de datos muy heterogéneos se han utilizado para diseñar la mayoría de estos modelos computacionales que predicen siRNA eficacia [21]. Estos conjuntos de datos se obtuvieron utilizando diferentes métodos para medir mRNA desmontables, diferentes concentraciones de ARNsi y longitudes (de 19 a 21 nt), y se usan diversos tipos de células o sistemas de transfección. Todas estas diferencias se resumen en la Tabla 1. En particular, el conjunto de datos Huesken, utiliza con frecuencia para desarrollar algoritmos de diseño de siRNA [15], [16], [17], [22], fue producido usando un plásmido que codifica tanto un gen indicador exógeno objetivo que lleva insertos de ADNc con su región 3 'no traducida (UTR), y un gen de referencia [15]. Este sistema de medición puede no ser apropiada cuando la investigación de cómo un siRNA se comporta hacia su objetivo mRNA en su ambiente celular natural. Otro problema que se presenta cuando la combinación de datos de fuentes heterogéneas es la falta de información detallada con respecto a la secuencia diana [23].
Para evaluar la precisión de las herramientas de diseño de siRNA automatizados en un entorno experimental realista, nos hemos centrado en la herramienta de diseño DSIR e investigado sistemáticamente lo bien que se comporta de la "vida real" mediante la medición de ARNm caída en un ensayo basado en células estandarizado. Para ello, hemos establecido un procedimiento experimental controlado, normalizada para la transfección de siRNA y PCR mediciones de tiempo en tiempo real cuantitativa (QRT-PCR). Se evaluó la potencia silenciamiento de un conjunto de secuencias de dúplex diseñados DSIR, 21-nt siRNA dirigidos contra diez genes diana relacionadas con el cáncer humano. Con este enfoque, se cuantificó la capacidad de predicción global de la DSIR siRNA algoritmo de diseño. También nos permitió investigar más a fondo los factores que podría mejorar el rendimiento DSIR.
Materiales y Métodos
1 Target y siRNA Selección
Inicialmente se seleccionaron ocho genes humanos conocidos por ser clave molecular componentes en la transformación celular y los procesos de cáncer (Tabla 2). Estos genes fueron seleccionadas para la evaluación terapéutica en estudios preclínicos relacionados con diversos modelos de tumores por el "consorcio siRNA", un proyecto financiado por la Ligue Nationale Contre le cáncer. siRNA dirigidos contra las regiones de la secuencia completa del ARNm diana longitud fueron diseñados con DSIR. El modelo de 21-nt incluido voladizos 2-nt 3 '[17]. siRNAs con más del 80% del valor esperado actividad de extinción se mantuvieron, sin descartar siRNA extensiones que contiene polinucleótidos. Entre estas secuencias de siRNA, siRNA que se superponen o se cierra eran demasiado espaciados en sitios diana no fueron retenidos si es posible. El conjunto final constaba de 88 dúplex de siRNA. Un siRNA control positivo de orientación CSNK2B (previamente validado por [24]), y un control negativo siRNA frente a GFP fueron también incluidos en esta primera lista de siRNA.
En una segunda serie de experimentos, un adicional conjunto de 40 siRNA dirigido contra dos de los ocho genes diana en la primera ronda, ERCC2 y HDAC6, y dos nuevos genes diana, PARP1 y ADN ligasa 1 (LIG1) se preparó. Este conjunto se utiliza para comprobar la contribución de las entidades de destino intrínsecas detectadas durante la primera ronda de experimentos. Los criterios para la inclusión de siRNA en la segunda ronda fueron: & gt; actividad de la extinción del 80% predicho por DSIR, un lugar en la secuencia de codificación (CDS) parte del objetivo, no hay extensiones de polinucleótidos y ningún potencial fuera de los objetivos permitidos, un grupo ampliado de los sitios diana de la cobertura complementaria de la secuencia general de transcripción con respecto a la secuencia de siRNA diseñado para el primer conjunto. Los detalles de los dos conjuntos de siRNA se enumeran en la Tabla 1. complementaria
síntesis de siRNA.
Todos los siRNA para el derribo de los diez genes humanos fueron sintetizados por Sigma como dúplex Proligo como meros 21 ( Tabla S2).
2 Cultivo de células y transfección
Las células HeLa se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS), 100 unidades /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina, en un incubador humidificado a 37 ° C en 5% de CO
2. Aproximadamente 1 × 10
se inocularon 5 células en placas de 12 pocillos y se cultivaron durante 24 h. El medio se cambió a 0,4 ml de OPTI-MEM (Gibco) antes de transfectar células con 20 nM de ARNsi utilizando Oligofectamine (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Se incubaron las células transfectadas durante 5 h. Las células fueron lavadas una vez con PBS, se añadió DMEM 10% de FBS, y las células se cultivaron durante otras 72 h (excepto para Bcl2l1 donde las células se cultivaron durante solamente 24 h).
3 en tiempo real el ensayo de PCR y Medidas
Tres días después de siRNA transfección, las células se recogieron y el ARN se aisló utilizando Absolutamente kit de ARN miniprep (Stratagene). La concentración de ARN se determinó utilizando un NanoDrop. La transcripción inversa se realizó con el kit de síntesis de ADNc StrataScript QPCR (Stratagene), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. cebadores específicos de genes (avance y retroceso) fueron diseñados para ser compatibles con un solo perfil térmico QRT-PCR de tal manera que múltiples transcritos podrían ser analizados simultáneamente. PrimerQuest (http://www.idtdna.com/SCITOOLS/Applications/PrimerQuest/) se utilizó para su diseño. Primer secuencias se enumeran en la Tabla S2 complementario. PCR cuantitativa se realizó con FullVelocity SYBR Green QPCR Master Mix utilizando las concentraciones de cebador indicadas en la Tabla 2. Las condiciones de PCR (concentraciones de cebador, la cantidad de ADNc) se determinó fueron optimizados y la eficiencia de PCR para cada gen diana. mezclas de reacción de PCR (25 l) se colocaron en el instrumento Mx3000P donde fueron sometidos a la siguiente programa de ciclos, optimizado para un bloque de 96 pocillos: 95 ° C durante 5 min, seguido inmediatamente por 45 ciclos de 10 segundos a 95 ° C y 30 seg a 60 ° C. Al final, los productos PCR fueron disociadas por incubación durante 1 min a 95 ° C y después 30 segundos a 55 ° C, seguido de una rampa hasta 95 ° C. calidad PCR y especificidad se verificaron mediante el análisis de la curva de disociación. Para cada conjunto de cebadores, se incluyeron un control sin plantilla (NTC) y un control sin reversa-amplificación (NAC). QRT-PCR reacciones se realizaron por triplicado, y la cuantificación se realizó mediante el método de la comparativa ciclo umbral. PCR datos cuantitativos se analizaron utilizando el software comparativamente MxPro (Stratagene, "La cuantificación comparativa" de la aplicación), ya sea con el 36B4 o amplificación de la señal hHPRT como "normalizador" interno (para corregir el contenido total de ARN) y se burlan de etiquetado tranfected muestra como "calibrador". Los resultados se expresan como el cambio relativo en la expresión en comparación con el control. Los experimentos se realizaron por triplicado para cada muestra.
4 cuantitativa en tiempo real PCR Normalización de datos y análisis estadístico
Cada ciclo de PCR incluyeron tres repeticiones biológica para cada tratamiento analizada. Además, todos los experimentos se repitieron tres veces de forma independiente, con diferentes muestras biológicas. Todo el procedimiento se realizó también dos veces, utilizando dos genes normalizadores diferentes. 18 Relación de las estimaciones de extinciones
Q
* fueron obtenidos a partir de estos datos, en base a la siguiente fórmula estándar: ¿dónde está la tasa de amplificación en la etapa temprana (ARES) del proceso de la molécula diana, es el ARES de la molécula de la normalización, y
C
es el número de ciclos necesarios para alcanzar un nivel predefinido de señal. Hubiera sido conveniente combinar la independencia y homogeneidad supuestos, para determinar las regiones de confianza. Sin embargo, este proceso aquí es claramente cuestionable, ya que algunos pares de experimentos comparten condiciones de diseño que otros no (por ejemplo, el mismo plazo, o el mismo gen normalizador). Por esta razón, se realizó un análisis diferente, cuyos detalles se pueden encontrar en el material complementario. valores de extinción para cada molécula de siRNA se proporcionan en el cuadro complementario S3.
5 Ensayo de Western Blot
Tres días después de siRNA transfección, se recogieron las células HeLa para la extracción de la proteína en tampón RIPA (Tris HCl pH 7,4 10 mM, NaCl 150 mM, SDS 0,1%, Na desoxicolato 0,5%, EDTA 1 mM, Triton X100 1%, leupeptina 5 g /ml, aprotinina 5 g /ml). Las proteínas se separaron por electroforesis en un gel de SDS-PAGE 12% antes de la transferencia a una membrana de PVDF para 1 h a 100 V. anticuerpos primarios: anticuerpo policlonal CK2alpha (αCoc) [25] y el anticuerpo monoclonal Hsp90 (clon 16F1 de Stressgen) se diluyeron 1 /500 en PBS que contenía 3% de leche en polvo no grasa. Cabra anti-conejo o anti-IgG de ratón-peroxidasa (Interchim) se utilizaron como anticuerpos secundarios, se diluyó 1:5000 en PBS. anticuerpo secundario de unión se reveló usando reactivos ECL plus (Amersham, #RPN 2105).
6 Análisis estadísticos
La influencia de varios factores sobre la eficacia siRNA medida se analizó mediante modelos lineales de montaje y las pruebas el significado de cada término usando software de análisis estadístico R (http://www.r-project.org/). El significado de cada término del modelo y de variables explicativas adicionales se probó usando las estadísticas de ANOVA.
7 estructura secundaria de ARNm diana y Accesibilidad
accesibilidad del sitio de destino se evaluó sistemáticamente, ya sea usando el servidor web SFold ( http://sfold.wadsworth.org), donde el perfil de probabilidad de acceso prevista del blanco se puede inspeccionar visualmente utilizando el módulo de siRNA (ver Figura suplementaria S2). Alternativamente, se utilizó el programa RNAplfold (Viena liberación paquete 1.7.2) con los parámetros óptimos de plegado previamente definidos (W = 80, L = 40 y T = 16), como se describe en [22]. Cuanto mayor es la probabilidad RNAplfold, más accesible el sitio diana es. Las probabilidades RNAplfold para cada secuencia de siRNA se enumeran en el cuadro complementario S3.
8 Potencial fuera de objetivo potencial gen desmontables fuera del objetivo se detectó Buscar
mediante la aplicación de una implementación interna de la Wu -Manber algoritmo, una variante del método de Baeza-Yates [26] SHIFT-añadir. En contraste con la explosión, este programa realiza una búsqueda exacta de un modelo dado (la secuencia de siRNA corto) en un banco de datos de secuencias (división de NCBI RefSeq, liberar 32) teniendo en cuenta los desajustes. En nuestro estudio, el valor predeterminado para el número de desajustes permitidos se establece en tres, como se recomienda [13]. La identidad entre el ARNm y las semillas-regiones siRNA que abarca los nucleótidos 2-8 de la cadena antisentido se calcularon. Esto implicó que ejecuta la aplicación Wu-Manber sin desajuste permitido, y la comprobación de secuencias de semillas heptámero contra un banco de datos de secuencia 3'UTR de ARNm (construido a partir de los genes humanos que figuran en RefSeq, liberar 48). El número de secuencias 3'UTR emparejados en el transcriptoma mundial, el número de semillas coincide con una secuencia de 3'UTR uno, dos y tres o más veces están reportados (Tabla S3). Estas características se han sugerido para ser vinculado a RNAi fuera de objetivos [27], [28].
Resultados
Configuración Experimental 1
El objetivo principal del presente estudio fue evaluar la eficacia de las secuencias de siRNA diseñado por DSIR. La eficacia se evaluó de forma endógena por la medición del porcentaje de permanecer no hendidas ARNm con relación a un control, no específica del ARNm. Un procedimiento estandarizado se estableció para evitar sesgos debido a las condiciones experimentales (es decir, el tipo de células, condiciones de transfección, concentración, cuantitativa en tiempo real RT-PCR, etc.). En una primera ronda de experimentos, nos centramos en ocho genes diana relacionadas con el cáncer. ERCC1 y ERCC2 son conocidos por estar involucrados en la vía de reparación por escisión de nucleótidos (NER) y son esenciales para la reparación de aductos de cisplatino inducida por ADN (complementario cruzado de reparación por escisión de roedor de deficiencia de reparación) [29]. HDAC6 muestra la actividad de la histona desacetilasa y reprime la transcripción [30]. Bcl2l1 (Bcl-X
L) es un miembro de la familia antiapoptótico Bcl-2 y regulador clave en el proceso de apoptosis [31]. HIF1A (HIF1α) es un factor de transcripción inducida por la hipoxia [32]. Para estos, hemos añadido las tres subunidades de la proteína quinasa CK2, (i) CSNK2A1 (CK2α), (ii) CSNK2A2 (CK2α ') y (iii) CSNK2B (CK2β) [33]. Estos genes diana de ARNm se describen, sus características, y el número correspondiente de reactivos siRNA ensayados se enumeran en la Tabla 2. Todos estos genes se expresan de forma natural en las células HeLa humanas, que se sabe que son fácilmente transfectables. Se eligieron estas células para evitar cualquier variación adicional debido a la etapa de transfección. Para cada objetivo, 10 o más 21-nt siRNA fueron diseñados con DSIR, y seleccionado como se describe en Materiales y Métodos. Teniendo en cuenta que una alta concentración de siRNA puede dar lugar a efectos fuera de la meta, y una baja concentración puede resultar en el silenciamiento de genes indetectable, que tuvo como objetivo de un compromiso mediante la fijación de la concentración de siRNA a 20 nM. Los factores de cambio en la expresión génica se determinaron por el método ΔΔCt, ya sea con la normalización de los genes HPRT casa de mantenimiento o 36B4. Esta estrategia de normalización, basado en dos genes de referencia, se ha demostrado que es más fiable que la normalización con un único gen de referencia [34]. la eficiencia de transfección de células HeLa se comprobó en todos los experimentos mediante la cuantificación del efecto de un siRNA validado previamente [24] de orientación CSNK2B. El experimento se consideró como validado cuando este siRNA control positivo el regulado CSNK2B por al menos 80%. También hemos desarrollado un nuevo modelo que permite la normalización de relaciones con los dos genes de limpieza, 36B4 y HPRT, juntos. Nuestro enfoque de análisis que participan la normalización utilizando múltiples genes de referencia y calibración inter-run. Esto ayudó a evitar la propagación de errores y la desviación entre las placas (ver detalles en el material complementario). Finalmente, puesto que el efecto de la siRNA es en última instancia requiere en el nivel de producto, se utilizó un ensayo de transferencia Western para la proteína CSNK2A1 para validar nuestras observaciones. Todos estos resultados y su análisis completo se presentan la Figura 1 para este gen (y en la Figura complementario S1 para otros genes diana).
células HeLa fueron transfectadas con siRNA diez CSNK2A de orientación, y dos de control de siRNA, (GFP como control negativo y CSNK2B como control positivo) a una concentración final de 20 nM usando reactivo Oligofectamine. Un control adicional consistió en simulacros de transfección de las células (sin siRNA). Tres días más tarde, el ARN y las proteínas se extrajeron para su posterior análisis. A. Efecto del tratamiento siRNA a partir de un experimento típico. Para cada siRNA la cantidad relativa de ARNm diana para HPRT (negro) o 36B4 (gris) se representó usando el módulo de análisis comparativo en software MxPro (Stratagene). B. La transfección de control de la eficiencia. Para cada experimento, las eficacias de transfección se verificaron mediante la cuantificación de silenciamiento génico en relación con un control de siRNA de la eficiencia conocida. Los resultados de experimentos en los que este control no silenciar la expresión en más de un 70% fueron excluidos del conjunto de datos porque la eficiencia de transfección se considera que es pobre. C. Caja de la representación gráfica de la eficiencia siARN de 10 secuencias. Para cada siRNA, la eficiencia predicha por DSIR y se mide la eficiencia se indican. eficiencia medida se determinó estadísticamente de RT-qPCR por triplicado cuantificación de ARNm diana después del tratamiento siRNA, basado en tres experimentos independientes. Los niveles de expresión se normalizaron a HPRT (negro) y 36B4 (rojo) genes de la casa de mantenimiento. Log (Q) = 1 representa ninguna reducción en ARNm diana después del tratamiento y log (Q) = 1/4 equivale a la eficiencia de aproximadamente 75%. Consulte la sección 2.6 para más detalles del análisis estadístico. los valores globales de eficiencia siRNA y de significación se proporcionan en el material complementario. D. Análisis de transferencia de Western de silenciar la eficiencia, utilizando anticuerpos anti-CK2alpha. La carga de proteína se normalizó los niveles de Hsp90.
2 Evaluación DSIR Diseño de Medición de la Actividad siRNA
La tasa de eficiencia siARN total para cada gen diana se resume en la Tabla 3. Para evaluar el éxito con el modelo de diseño DSIR diseña siRNAs, hemos desarrollado un sistema de clasificación. siRNAs que produjeron al menos 70% del gen diana desmontables fueron considerados altamente eficiente; otros siRNA se consideraron ya sea moderadamente eficaz (de 50 a 70%) o ineficiente (& lt; 50%). De acuerdo con esta clasificación, todo el conjunto de datos siRNA contiene más de 56% altamente eficiente, y 25% moderadamente eficaz siRNA. Esta tasa de éxito global muestra que DSIR se desempeña bien en experimentos reales.
A continuación centramos en cada objetivo por separado para determinar la tasa de éxito para la extinción contando el número de secuencias de siRNA eficaces sobre el número total de siRNA probado para cada gen (Tabla 3). Estos datos revelan una heterogeneidad notable de la tasa de éxito de un gen diana a la siguiente, lo que sugiere diferentes reacciones a la vía de siRNA mediada por silenciamiento. De hecho, las mediciones de QRT-PCR de las siguientes transcripciones, ERCC1, CSNK2B, CSNK2A1, CSNK2A2, revelan un perfil de silenciamiento satisfactoria (con 9/10, 7/10, 7/10 y 10/10 eficientes siRNA, respectivamente). Por el contrario, ERCC2 y HDAC6 (4/15 y 3/13, respectivamente) parecen ser bastante resistentes a silenciar, con sólo unos pocos siRNA eficiente a pesar de un mayor número de reactivos siRNA ensayados. Intermedio éxito se observa para HIF1A y Bcl2l1, con actividad siRNA eficiente en 5/9 y 7/12 de los casos, respectivamente. Esto contrastaba foto pone de manifiesto que, en términos de silenciamiento, todos los genes no son iguales. Esto fue algo sorprendente, ya que los niveles de expresión de todos estos genes diana se documentó ser igualmente baja. Por lo tanto, si descartamos genes diana que son los más refractarios a silenciamiento, ERCC2 y HDAC6, DSIR predice más de 70% secuencias de siRNA altamente eficientes. Estas observaciones ponen de relieve el papel no despreciable que desempeña el ARNm diana en la evaluación de los modelos computacionales para predecir la eficacia de siRNA.
3 Relación entre siRNA eficacia y potencial fuera de objetivo efectos
Se ha demostrado que siRNA se pueden orientar de forma no específica la presentación de genes no relacionados complementariedad de secuencia parcial. Esto se conoce como efectos fuera de la meta (OTE). Hay dos tipos de OTA se distinguen ahora [35]. El primero de ellos es OTE mediada por Ago2 que actúa en objetivos que son muy similares a los objetivos siRNA reales. Esto parece ser muy potente, aunque este tipo de efecto fuera del objetivo es relativamente rara vez se encuentra. El segundo tipo de OTA se ha observado en los objetivos que contienen semillas partidos en su región 3'UTR [36]. Esto implica un mecanismo que parece ser similar a la de la regulación de los genes miARN [27], [36], [37]. Desde OTE podría ser responsable de una menor eficiencia por un efecto de dilución, se investigó este aspecto mediante el cribado sistemático de cada siRNA para los posibles sitios fuera de objetivos. En primer lugar, observamos que ni el número de plantas fuera de los objetivos complementarios parciales, ni los determinantes asociados a la clase de frecuencia complemento semillas fueron significativamente relacionados con la eficiencia siRNA (ver más abajo 3.4). Además, Du et al. [38] informaron de que la posición de la falta de coincidencia dentro del dúplex y la identidad de la base que constituye la falta de coincidencia podría influir en la funcionalidad de siRNA. Para estudiar los efectos de los desajustes entre siRNA y ARNm objetivo más precisamente en relación con la actividad silenciar RNAi, nos centramos en la reacción cruzada que pudiera existir entre el objetivo gen CSNK2A2 y siRNA dirigido contra CSNK2A1, para los cuales tres secuencias de siRNA de nuestro conjunto de datos ( si_031, si_034 y si_035) se han identificado como teniendo potencial OTA (véase la figura 2). Aunque estos tres siRNA han demostrado reducir drásticamente la expresión CSNK2A1, ninguno de ellos tenía ningún efecto sobre el nivel de transcripción CSNK2A2, según lo revelado por QRT-PCR (véase la figura 2B). Por otra parte, nos dimos cuenta de que la posición de la falta de adaptación para cada secuencia de siRNA guía-hilo (si_031: 6,19,21; si_034: 3,6,12; si_035: 2,5,8) dentro de la transcripción CSNK2A2 no eran necesariamente en de acuerdo con los desajustes dependientes de la posición tolerados descritos anteriormente [38]. Por ejemplo, se ha encontrado la posición 12 para ser tolerado débilmente, mientras que las posiciones 1, 2, 5, 7, 8, 18 y 19 resultaron ser bien tolerado. En nuestro caso, el siRNA activa (si_035) contiene tres posiciones de alta tolerancia que también podrían haber causado CSNK2A2 caída. Sin embargo, no se observó efecto. Esto sugiere que esta combinación no se tolera, o que OTE debido a la casi perfecta complementariedad es mucho más compleja.
A. Tres secuencias de siRNA dirigidos contra CSNK2A1 fueron identificados como posibles objetivos para off-CSNK2A2, con tres desajustes en diferentes posiciones (en minúsculas). células HeLa fueron transfectadas con siRNA contra tres CSNK2A1 (CK2α) (si_31, si_34 y si_35), o en contra de CSNK2A2 (CK2α ') (si_41) y el control GFP siRNA. Todos los siRNAs se utilizaron a una concentración final de 20 nM, y se transfectaron usando el reactivo Oligofectamine. También se incluyeron células transfectadas de manera simulada (sin siRNA). Tres días más tarde, se extrajo el ARN para el análisis adicional. B. cantidad de ARNm CSNK2A2 relativa determinada por QRT-PCR. Para cada siRNA, la cantidad de destino (o fuera del objetivo) con respecto al ARNm HPRT (negro) o 36B4 (gris) se representó.
Otra forma de minimizar OTA es disminuir la concentración de siRNA. Nuestra validación se realizó con 20 nM siRNA, pero también probó cantidades inferiores para evaluar adicionalmente secuencias eficientes. Como se muestra en la Figura 3, las concentraciones tan bajas como 1 nM son tan eficientes como 20 nM durante tres secuencias de siRNA dirigidos contra CSNK2B y dos secuencias de siRNA dirigidos contra LIG1 (objetivo gen añadido en la segunda ronda de pruebas, ver más abajo). Estos resultados indican que el siRNA diseñado por DSIR puede ser de gran alcance, incluso en condiciones "fisiológicos", donde las concentraciones pueden ser tan bajo como 1 nM.
Una gama de concentraciones de tres siRNAs dirigidos contra CSNK2B, todos con alta eficiencia mundial (siRNA_26, _29 y si_30) (panel a), y dos siRNA dirigido contra LIG1 (siRNA_133 y _137) (panel B) se transfectaron en células HeLa para determinar la relación entre la eficiencia global y la cantidad transfectadas. siRNA_GFP se utilizó como control negativo. El gráfico muestra los valores medios +/- desviaciones estándar de RT-qPCR cuantificación de dos experimentos independientes normalizado al gen casa de mantenimiento HPRT.
4 Exploración de las características que afectan a siRNA potencia
Todo el siRNA diseñado utilizando DSIR tenía una potencia predicha de al menos 80%. La contribución y la importancia de varios criterios de diseño de siRNA previamente publicados o factores que se cree que desempeñan un papel en el silenciamiento de genes, y que no se toman en cuenta explícitamente por el modelo DSIR, fueron analizados. Se analizó la influencia de algunas de estas características en las variaciones observadas en las eficacias de los 88 siRNA probados en la primera ronda de experimentos. Para ello, en primer lugar se ajustaba a un modelo lineal para explicar las eficacias siRNA medidos en función de 13 características: (1) la puntuación DSIR, (2) el gen diana, (3) la posición en el gen diana (en pb en relación al extremo 5 '), (4) la ubicación en el gen diana (5' UTR, CDs o 3 'UTR), (5) el número de potenciales fuera de objetivos para el siRNA, (6) la ausencia o presencia de un tracto polinucleótido (con & gt; = 4 idénticos nucleótidos consecutivos) en la siRNA, (7) la cantidad de visitas a la siRNA en el transcriptoma humano mundial, (8-10) el número de secuencias de ARNm a juego en su región 3'UTR , (11) la longitud del exón diana, (12) la presencia de una unión exón-exón en el sitio diana, y el sitio de accesibilidad (13) objetivo, calculado como se describe en Materiales y Métodos. Toda esta información se proporciona en la Tabla S3 suplementaria. pruebas de ANOVA con un umbral de significación del 5% para los valores de P reveló que sólo tres de estos trece covariables se correlacionaron significativamente con la eficacia; estos fueron los siguientes: la identidad del gen diana, la posición en el gen diana, y la ubicación en el gen diana (como se define más arriba). En particular, en el estrecho rango por encima del 80%, no parece estar correlacionado significativamente con la eficacia medidos, lo que sugiere que sólo debe utilizarse para seleccionar siRNA encima de un umbral, pero no para clasificarlas en el marcador DSIR. Por otra parte, ninguna de las otras variables que han sido sugeridas como criterios de diseño (número de plantas fuera de los objetivos, la presencia de un tracto polinucleótido, sitio diana accesibilidad) mostró ninguna evidencia de ser capaz de predecir la eficacia se mide en nuestro conjunto de siRNA (no se muestra ).
Por lo tanto, reestimen un modelo lineal con sólo los tres covariables que contribuyen de manera significativa. Primero, la ubicación del sitio de destino en el 'UTR, los CDS o el 3' UTR 5 tiene un impacto significativo sobre la eficacia medida (Pval & lt; 0,0003).