Extracto
El carcinoma de ovario (CO) es la neoplasia ginecológica más letal. A pesar de los avances en el tratamiento de la CO con regímenes combinatorios, incluyendo la cirugía y la quimioterapia basada en platino, los pacientes generalmente presentan un mal pronóstico debido a la alta resistencia a la quimioterapia. En esto, hemos probado la hipótesis de que la respuesta al daño del ADN (DDR) vías participan en la resistencia de los pacientes a la quimioterapia de platino OC. señales de DDR seleccionados se evaluaron en dos líneas humanas de ovario de células de carcinoma, uno sensible (A2780) y una resistencia (A2780 /C30) al tratamiento de platino, así como en las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de pacientes OC, sensible (
n
= 7) o resistentes (
n
= 4) a la quimioterapia subsiguiente. PBMCs de voluntarios sanos (
n
= 9) fueron estudiados en paralelo. el daño del ADN se evaluó mediante tinción de inmunofluorescencia γH2AX y ensayo cometa. Mayores niveles de daño del ADN intrínseca se encontraron en A2780 que en las células A2780 /C30. Por otra parte, los niveles de daño del ADN intrínsecos fueron significativamente mayores en los pacientes OC relativos a voluntarios sanos, así como en pacientes sensibles al platino en relación con los resistente al platino (todo
P
& lt; 0,05). Después del tratamiento con carboplatino, A2780 células mostraron una menor eficiencia de reparación del ADN de las células A2780 /C30. También, después del tratamiento de carboplatino PBMCs
ex vivo
, la eficacia de la reparación del ADN fue significativamente mayor en voluntarios sanos que en pacientes resistentes al platino y más baja en los sensibles al platino (t
medio de la pérdida de γH2AX focos: 2,7 ± 0,5 h, 8,8 ± 1.9h y 15,4 ± 3,2H, respectivamente; usando el ensayo de cometa, t
1/2 de platino inducida por reparar el daño: 4,8 ± 1,4H, 12,9 ± 21,4 ± 1.9h y 2.6h, respectivamente; todo
P Hotel & lt; 0,03). Además, la tasa de apoptosis carboplatino inducida fue superior en A2780 que en las células A2780 /C30. En PBMCs, las tasas de apoptosis se correlacionaron inversamente con la eficiencia de reparación del ADN de estas células, siendo significativamente mayor en platino-sensible que en los pacientes resistentes al platino y el más bajo en voluntarios sanos (todo el
P Hotel & lt; 0,05). Llegamos a la conclusión de que las perturbaciones de las vías de reparación del ADN, según lo determinado en PBMCs de pacientes OC se correlacionan con la sensibilidad a los fármacos de estas células y reflejan la respuesta individualizada a la quimioterapia basada en platino
Visto:. Stefanou DT, Bamias A, H Episkopou , Kyrtopoulos SA, Likka M, Kalampokas T, et al. (2015) aberrante daño en el DNA respuesta vías podrían predecir el resultado de platino quimioterapia en el cáncer de ovario. PLoS ONE 10 (2): e0117654. doi: 10.1371 /journal.pone.0117654
Editor Académico: Goli Samimi, Instituto Garvan de Investigación Médica, AUSTRALIA
Recibido: 16 Julio, 2014; Aceptado: 12 Noviembre 2014; Publicado: 6 Febrero 2015
Derechos de Autor © 2015 Stefanou et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Los datos están disponibles desde el Repositorio digital Helios:. http://helios-eie.ekt.gr/EIE/handle/10442/14421
Financiación: Este trabajo fue apoyado en parte por la subvención Escuela de Medicina de la Universidad de Atenas ELKE 097, y por el ECNIS (cáncer del medio ambiente, la nutrición y la susceptibilidad individual) Red de Excelencia de la Unión Europea (contrato. no 513943). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario (CO) es el quinto tipo de cáncer más común en las mujeres y la causa principal de la mortalidad por tumores malignos ginecológicos, con carcinoma epitelial siendo la variedad más frecuente [1,2]. OC generalmente se diagnostica en etapas avanzadas y, a menudo lleva un pronóstico sombrío, a pesar de que las estrategias actuales de tratamiento, incluyendo la citorreducción quirúrgica agresiva y la quimioterapia de platino-paclitaxel parecen haber mejorado significativamente la supervivencia relativa de estos pacientes a una tasa de supervivencia a 5 años de más del 40% [3]. factores de pronóstico establecidos para OC incluyen etapa, el subtipo histológico, el grado del tumor y el volumen de la enfermedad residual después de la cirugía citorreductora [4,5].
Tres compuestos de platino diferentes, a saber, cisplatino, carboplatino y oxaliplatino, se utilizan actualmente en el la práctica clínica, con numerosas indicaciones, que cubren un amplio espectro de tumores sólidos [6]. Su acción citotóxica se ejerce a través de la reacción con el ADN y el desarrollo de daño en el ADN por la formación de enlaces cruzados, Pt-d [GPG] (1,2-intrastrand entrecruzamientos, 65%), Pt-d [ApG] ( 1,2-intrastrand entrecruzamientos, 25%) y en menor medida Pt-d [] GpNgG (1,3-intrastrand enlaces cruzados), entre cadenas enlaces cruzados (ICL, el daño más citotóxica) y de un solo nucleótido de guanina [7]. la reparación por escisión de nucleótidos (NER) es el proceso principal mediante el cual se reparan reticulaciones intrastrand platino y el daño de un solo nucleótido de guanina [8,9]. Por otro lado, la reparación ICL es complejo y requiere de una combinación de NER, vía de reparación anemia de Fanconi, translesion síntesis y recombinación homóloga [10-12]. Curiosamente, los ingresos de reparación ICL a través de la formación de ADN de doble filamento se rompe (DSBs) que representan la forma más letal de los daños del ADN [13]. La formación de DSBs siempre es seguido por la fosforilación de la histona H2AX, una variante de la familia de proteínas H2A, que es un componente del octámero de histona en nucleosomas. La histona H2AX es fosforilada por quinasas tales como ataxia telangiectasia mutada (ATM) y relacionados-ATM-Rad3 (ATR) en la ruta de PI3K [14]. Esta nueva proteína fosforilada, γH2AX, es el primer paso en el reclutamiento y la localización de las proteínas de reparación del ADN.
El genoma de los mamíferos está protegida contra los insultos genotóxicos por una red de respuesta al daño del ADN (DDR) vías, que se desencadena por la la detección de ADN a través de lesiones de sensores específicos [15]. El siguiente paso es la iniciación de una cascada de transducción de señales, que activa diversas vías de protección de genoma. Desde DDR es un proceso de señalización integral que determina el destino de la célula, ya sea mediante la reparación de daños en el ADN o someterse a apoptosis, su papel ha sido implicado en el proceso de la enfermedad y en el éxito de la quimioterapia. De hecho, se ha demostrado que las anormalidades en las vías de reparación del ADN desempeñan un papel importante en la transformación maligna de OC [16]. Además, la expresión de las proteínas de reparación del ADN, tales como el cáncer de mama 1 (BRCA1) y la reparación por escisión del grupo de complementación cruzada 1 (ERCC1) han correlacionado con una pobre supervivencia en OC avanzada y se encontró que eran marcadores de resistencia a los fármacos basados en platino [17- 19]. Además, nuestros estudios anteriores se centraron en los niveles de daño del ADN en las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de pacientes con mieloma múltiple han demostrado que el daño del ADN podría distinguir de forma prospectiva entre pacientes con diferentes grados de respuesta terapéutica, proporcionando la base para la pre-selección y selección de los pacientes más susceptibles de beneficiarse de este tratamiento [20-24].
Aquí, se llevó a cabo un estudio para probar la hipótesis de que el DDR, un mecanismo crucial para la supervivencia celular, está implicada en la resistencia a la quimioterapia de platino . Se encontró que los pacientes de OC se caracterizan por daño en el ADN intrínseca más alta en comparación con voluntarios sanos, y que la eficiencia de la reparación del ADN como se mide en PBMC de pacientes OC se correlaciona con la sensibilidad a los fármacos de estas células y refleja la respuesta individualizada a la quimioterapia basada en platino.
Materiales y Métodos
Los pacientes
Todos los pacientes incluidos en este análisis fueron administrados en una sola institución (Alexandra hospital, Atenas, Grecia). Las muestras de sangre se obtuvieron a partir de los dieciocho (
n = 18)
pacientes sometidos a cirugía para el cáncer de ovario sospecha (edad media 62 años, rango 34-77) (Tabla 1) antes de cualquier tratamiento terapéutico. Nueve (
n
= 9) individuos sanos, la edad y con los pacientes (todas mujeres, edad media 60 años, rango 29-73) sirvieron como controles emparejados por sexo. Todos los pacientes se clasifican de acuerdo a un sistema de estadificación de la FIGO. La quimioterapia se inició dentro de un mes a partir de la cirugía. Paclitaxel a 175 mg /m
2 más de 3 horas seguido inmediatamente por carboplatino 5-6 AUC de más de 60 minutos se administraron cada 3 semanas. Se administraron seis ciclos de quimioterapia. Siete pacientes no recibieron quimioterapia después de la cirugía: 3 tenían tumores borderline, 1 paciente falleció en el postoperatorio, mientras que 3 pacientes rechazaron cualquier tratamiento después de la cirugía. sensibilidad al platino para los 11 pacientes que recibieron quimioterapia de primera línea se evaluó de acuerdo con los criterios Ginecológica Comité Intergrupo del Cáncer (GCIC) [25]. Por estos criterios, hubo 4 resistente al platino y 7 pacientes sensibles al platino. Los pacientes supervivientes deben tener un seguimiento mínimo de 2 años. Todos los participantes dieron su consentimiento informado por escrito de acuerdo con la Declaración de Principios de Helsinki, y el estudio fue aprobado por el Consejo de Revisión Institucional Alexandra Hospital.
Célula de tratamiento
El A2780 sensible al platino y las líneas celulares A2780 /C30 resistente al platino [26] fueron amablemente proporcionados por el Dr. George Koukos (ovárico Centro de Investigación del cáncer de la Universidad de la Escuela de Medicina, Filadelfia, Pensilvania, EE.UU. Pensilvania). Las células fueron cultivadas en monocapa utilizando RPMI 1640 que contiene 10% de suero de ternera fetal, 100μg /ml de estreptomicina, 100 unidades /ml de penicilina, 0,3 mg /ml de glutamina y 0.3unit insulina /ml en una incubadora a 37 ° gaseados continuamente con 5% de CO
2. Las células se trataron con cisplatino (0-100μg /ml para 0-24h), seguido de incubación en medio libre de fármaco para 0-24h o carboplatino (0-300μg /ml para 0-24h), seguido de post-incubación en drogas medio exento de 0-24 h.
PBMCs se aislaron de sangre periférica recién extraída utilizando métodos estándar [23]. Luego, las células se estimularon en proliferación usando 10μg /ml de fitohemaglutinina (PHA) durante 48 horas a 37 ° C en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de FCS, 50 mg /l de penicilina, 50.000lU /l de estreptomicina y posteriormente tratados con cisplatino (0-300μg /ml para un máximo de 3 h), seguido de incubación en medio libre de fármaco para 0-24h o carboplatino (0-1800μg /ml para un máximo de 24 horas), seguido de post-incubación en medio libre de drogas para 0-24h.
ensayo de citotoxicidad
Después del tratamiento de drogas, las células viables se contaron por azul de tripano colorante de exclusión por [27]. En pocas palabras, después de la incubación con el fármaco, las células se lavaron y se resuspendieron en medio completo. Se añadió un volumen igual de 0,4% de reactivo de azul de tripano a la suspensión celular y se evaluó el porcentaje de células viables. Los ensayos se realizaron por triplicado.
electroforesis en gel de células individuales (ensayo cometa)
El ensayo de electroforesis en gel de una sola célula se llevó a cabo bajo condiciones alcalinas como se describe anteriormente [28]. Brevemente, alícuotas de 5x10
4 células tratadas con fármaco no tratados o de platino se suspendieron en agarosa de bajo punto de fusión (1%) en PBS (135 mmol /l de NaCl, 2,5 mmol /l KCl, pH 10) a 37 ° C, y la propagación en portaobjetos de microscopio totalmente helados recubiertas previamente con una capa delgada de 1% de agarosa de fusión normal (Biozyme, Hameln, Alemania). La suspensión de células se cubrió inmediatamente con un cubreobjetos y los portaobjetos se mantuvieron a 4 ° C durante 1 hora para permitir la solidificación de la agarosa. Después de retirar el cubreobjetos, las células se expusieron a tampón de lisis (2,5 M NaCl, 100 mM de EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 10, 1% de Triton X-100) a 4 ° C durante 1 h. A continuación, los portaobjetos se colocaron en una cámara de electroforesis en gel horizontal. La cámara se llenó con tampón de electroforesis en frío (1 mM EDTA, 300 mM NaOH, pH 13) y se desliza se mantuvieron a 4 ° C durante 40 minutos para permitir que el ADN se desenrolle. La electroforesis se realizó durante 40 min (1V /cm, 255mA). Después de la electroforesis, los portaobjetos se lavaron con tampón de neutralización (0,4 M Tris-HCl, pH 7,5) durante 10 min y luego con H
2O durante 10 min. Todas las etapas preparativas se llevaron a cabo en la oscuridad para evitar daños en el ADN adicional. Los portaobjetos se tiñeron con 20μl de 1μg /ml DAPI y se analizaron con un microscopio de fluorescencia (Nikon Eclipse 400) equipado con una cámara de vídeo CCD-4230A. Las imágenes digitales fueron adquiridos usando un sistema de análisis de imágenes (análisis cinético, Wirral, Reino Unido). Momentos de oliva Tail [OTM = (cola media-Head media) x (% de ADN) /100] se evaluaron de 100 células /condición de tratamiento.
antígeno tinción de inmunofluorescencia y láser confocal de barrido microscopio análisis
alícuotas de 2x10
se adhirieron 4 células tratadas con fármaco no tratados o de platino a cubreobjetos recubierto con HCl 1 M y 50 mg /ml de poli-D-lisina antes de su uso, fijado por la adición de una solución de paraformaldehído al 4% para 6min a temperatura ambiente y se almacena a -70 ° C hasta que el análisis de patm (serina-1981, Santa Cruz), Patr (serina-428, Señalización celular), pChk1 (serina-345, Santa Cruz), pChk2 (treonina-68, Abcam) y γH2AX (serina-139, Señalización celular) [29]. Las células se lavaron con PBS frío y se bloquearon con 0,5 ml por pocillo tampón de bloqueo (0,1% de Triton X-100, 0,2% de leche desnatada seca en PBS) durante 1 hora a temperatura ambiente en una caja humidificada. células bloqueadas se incubaron con anticuerpos contra patm, Patr, pChk1, pChk2 o γH2AX en tampón de bloqueo a 4 ° C durante la noche. Después de lavar con tampón de bloqueo, las células se incubaron con anticuerpo de cabra anti-ratón, marcado con FITC, se combina con cabra anti-conejo, TRITC marcado, por el doble etiquetado (Invitrogen) a una dilución de 1: 4000 en tampón de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Se aplicaron cubreobjetos, y los bordes se sellaron con esmalte de uñas transparente. Las imágenes fueron visualizadas con una Leica TCS SP-1 microscopio láser confocal de barrido. Los focos se contaron manualmente en 200 células /condición de tratamiento y los resultados se expresan como el% de células positivas γH2AX (media ± SD) a partir de tres experimentos independientes; células positivas se definen como células con más de 5 focos por célula.
Apoptosis ensayo
La apoptosis se evaluó mediante el uso de la muerte celular de detección ELISA-PLUS kit (Roche Applied Sciences), de acuerdo con el fabricante del instrucciones. En resumen, las células se trataron con diversas dosis de carboplatino (líneas celulares, 0-300μg /ml; PBMCs, 0-1800μg /ml) durante 24 h seguido de incubación en medio libre de fármaco durante 24 h. A continuación, se recogieron las células para preparar las fracciones citosólicas que contenían fragmentos de ADN. Volúmenes iguales de estas fracciones citosólicas se incubaron en pocillos recubiertos con anticuerpos anti-histonas (placas de 96 pocillos), y se dejó que las histonas de los fragmentos de ADN que se unen a los anticuerpos anti-histona. Los anticuerpos de ADN monoclonales de ratón marcados con peroxidasa fueron utilizados para localizar y detectar el ADN fragmentado con destino usando la detección fotométrica con 2,29-azino-di- (sulfonato de 3-etilbenzotiazolina) como sustrato. La prueba cuantifica apoptosis como el aumento pliegue (expresado como Enrichment Factor, EF) en el nivel de apoptosis en las muestras tratadas con las muestras no tratadas. Se calculó el enriquecimiento específico de mono- y oligo-nucleosomas liberados en el citoplasma usando la siguiente fórmula: (EF) = [(absorbancia de las células tratadas) /(absorbancia de las células sin tratamiento de drogas)]. Por último, la tasa de apoptosis individuo se expresó como la dosis de carboplatino suficiente para desencadenar la inducción de un determinado factor de enriquecimiento (EF = 3).
El análisis estadístico
La eficacia de la reparación del ADN y la inducción de la apoptosis se compararon entre los grupos de personas que utilizan pruebas no paramétricas. En concreto, se utilizó el análisis de Kruskal Wallis para las comparaciones entre los tres grupos, y la prueba de suma de rangos de Wilcoxon para las par sabia comparaciones. Las correlaciones entre los valores de los diversos parámetros relacionados con DDR-dentro de las líneas celulares o PBMCs de los diferentes pacientes OC se evaluaron mediante el coeficiente de correlación de Spearman (todos los grupos combinados). Para evaluar la asociación lineal entre el daño del ADN y la dosis del fármaco de platino, la apoptosis y el daño del ADN, así como la apoptosis y la tinción pan-nuclear, se realizó la regresión lineal de estos parámetros. Un
P
-valor inferior a 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Para dar cuenta de las comparaciones múltiples se utilizó la corrección Bonferonni.
Resultados
reparación del ADN del daño inducido por el platino en líneas celulares de carcinoma de ovario se correlaciona con la sensibilidad a los fármacos de estas células
para examinar los mecanismos moleculares implicados en la sensibilidad a los fármacos de quimioterapia con platino, cambios en las moléculas clave de la vía DDR celular (patm, PATR, pChk1, pChk2, γH2AX) fueron evaluados en dos líneas celulares de carcinoma de ovario: uno sensible al platino (A2780) y uno resistente al platino (A2780 /C30) [26]. Las células se trataron con diversas dosis de cisplatino (0-100μg /ml) durante 0-24 h, seguido de incubación en medio libre de drogas para 0-24h. Ambas líneas celulares mostraron un aumento dependiente de la dosis en la formación de todas las moléculas clave en estudio (Fig. 1A, D). Se observaron niveles máximos de estas moléculas en el post tratamiento 6h, manteniéndose estable o ligeramente decreciente a partir de entonces (fig. 1B). Curiosamente, γH2AX mostró las tasas más altas de inducción entre las moléculas clave examinados. La concentración de cisplatino más bajo al que se pudo detectar la inducción γH2AX era 2.5μg /ml durante 1 hora (Fig. 1C). Por otra parte, las células fueron tratadas con carboplatino (0-300μg /ml) durante 0-24 h, seguido de post-incubación en medio libre de drogas para 0-24h. Se encontraron resultados similares a los obtenidos a partir de los experimentos de cisplatino. Es decir, en ambas líneas celulares se observó un aumento dependiente de la dosis en la formación de todas las moléculas clave (Fig. 1E, F). Además, se observaron niveles máximos de estas moléculas en el final del tratamiento de 24 horas, disminuyendo después de eso. Una vez más, la γH2AX mostró las tasas más altas de inducción entre las moléculas clave examinados. Tomados en conjunto, estos resultados indican que la cuantificación de inmunofluorescencia γH2AX focos es un enfoque poderoso para medir el daño en el ADN inducido por fármacos de platino.
A2780 células /C30 (representativos de las dos líneas celulares OC) fueron tratados (A) con cisplatino (0-100μg /ml) durante 3 h, o (B) con 100μg /ml de cisplatino, posteriormente se incubaron en medio libre de fármaco para varios períodos de tiempo (0-24h), o (C) con dosis relativamente pequeñas (0- 15μg /ml) de cisplatino para un máximo de 3 h, y se analizaron al final del tratamiento mediante microscopía confocal. Las células positivas: células con más de 5 focos por célula. Las barras de error representan la desviación estándar. En (D) imágenes típica que muestra las moléculas clave en estudio mediante el análisis de microscopio de A2780 /células C30 tratadas con 100μg /ml de cisplatino durante 3 h; imágenes superiores, la tinción de inmunofluorescencia de antígenos; imágenes de fondo, los núcleos de células marcadas con DAPI. (E) A2780 /células C30 se trataron con carboplatino (0-300μg /ml) durante 24 horas o (F) con 100μg /ml de carboplatino para varios períodos de tiempo (0-24h) y se analizaron mediante microscopía confocal. Las barras de error representan la desviación estándar. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.
Los niveles de daño del ADN inducido por platino en ambas líneas celulares también se evaluaron usando el ensayo de cometa alcalino. Esta versión del ensayo cometa detecta la migración del ADN causado por la ruptura de cadenas, sitios lábiles alcalinos, y sitios de reparación transitorios [30]. Después del tratamiento de las células con cisplatino 0-150μg /ml durante 3 h (Fig. 2A, C) o carboplatino ml /0-300μg durante 24 h (Fig. 2B, C), un aumento dependiente de la dosis lineal de los niveles de daño de ADN se obtuvo en ambas líneas celulares, lo que indica que el método tiene la sensibilidad y la precisión para detectar y cuantificar el daño del ADN inducido platino.
A2780 /células C30 (representativos de las dos líneas celulares OC) fueron tratados con cisplatino (a) ( 0-150μg /ml) durante 3 h o (B) carboplatino (0-300μg /ml) durante 24 h, y se analizaron al final del tratamiento usando el ensayo de cometa. Las barras de error representan la desviación estándar. En (C) imágenes del ensayo de cometas típicos de A2780 células /C30 no tratadas (NT), se trató con 50? G /ml de cisplatino (cis-50), 100μg /ml de cisplatino (cis-100), 150μg /ml de carboplatino (carbo-150 ) o 300μg /ml de carboplatino (carbo-300). Todos los ensayos se realizaron por triplicado.
Además, usando los dos enfoques de gran alcance validados anteriormente, los niveles de daño de ADN intrínseca se evaluaron en líneas de células no tratadas. Tanto la tinción de inmunofluorescencia γH2AX y ensayo cometa alcalino mostraron diferencias significativas entre las dos líneas celulares, con el daño en el ADN intrínseca siendo mayor en A2780 A2780 que en células /C30. En particular, el uso de γH2AX la tinción de inmunofluorescencia, las células A2780 exhibieron 28,8 ± 3,4% de células positivas (es decir, células con más de 5 focos por célula) y A2780 /C30 17,4 ± 3,4% de células positivas (
P
= 0,01; Tabla 2 ). Por otra parte, mediante el uso de ensayo cometa, las células A2780 mostraron valores OTM de 33,9 ± 5,5 unidades arbitrarias, mientras que las células /C30 mostraron A2780 14,4 ± 2,9 unidades (
P Hotel & lt; 0,001; Tabla 2).
para mostrar la eficiencia de reparación del ADN en estas dos líneas celulares, las células fueron tratadas con carboplatino (0-300μg /ml) durante 24 horas, seguido de post-incubación en medio libre de drogas para 0-24h y el daño en el ADN inducido ( es decir, el daño del ADN total de normalizado por el daño en el ADN intrínseca) se analizó al final de tratamiento de drogas. Tanto la tinción de inmunofluorescencia γH2AX y ensayo cometa mostraron diferencias significativas entre las dos líneas celulares. Es decir, en ambas líneas celulares daño del ADN alcanzó niveles más altos al final del tratamiento de drogas, con daño en el DNA de ser significativamente mayor en A2780 que en A2780 /células C30 (datos no mostrados). A partir de entonces, los niveles de daño de ADN carboplatino inducida se redujeron y la extensión de la reparación fue significativamente menor en A2780 que en A2780 /células C30 (
P
& lt; 0,03). En particular, el uso de microscopía confocal de los focos γH2AX se retiraron con T
1/2 = 5,2 ± 0,7 H en las células A2780 /C30 y 11.7 ± 2.6h en las células A2780. Mediante el uso de ensayo cometa, el t
1/2 valores para la reparación de los daños inducidos por carboplatino en las células A2780 /A2780 y C30 eran 9,9 ± 1,3H y 16,7 ± 3.4h, respectivamente.
Por otra parte, el Área bajo la curva (AUC) para el daño del ADN carboplatino inducida, un parámetro que refleja la carga general de daño en el ADN resultante de la formación de daños y la reparación del ADN inicial se calculó (Tabla 2). Mediante el uso de γH2AX tinción de inmunofluorescencia, las células A2780 mostraron valores de AUC [expresados como (% de células de tinción positiva γH2AX) x (dosis de carboplatino)] de 17200 ± 3650 y A2780 células /C30 12400 ± 2140 (
P =
0,01). Por otra parte, ensayo cometa confirmó los resultados anteriores con células A2780 que muestra los valores de AUC [expresado como (OTM x dosis de carboplatino)] de 14900 ± 3280 mientras que las células A2780 /C30 mostraron valores de AUC de 9400 ± 1150 (
P = 0,01
).
Además, ambos tipos de células se trataron con diversas dosis de carboplatino (0-300μg /ml) durante 24 h y la inducción de apoptosis se midió 24 h post-tratamiento. Se encontró que las tasas de apoptosis fueron más altos en las células A2780 que en A2780 /células C30 (
P
= 0,001; Tabla 2). En particular, las células A2780 mostraron evidencia de apoptosis a dosis de carboplatino tan bajas como 43,8 ± 5.6μg /ml, mientras que las células /C30 A2780 requiere una dosis de 78,5 ± 9.2μg /ml, lo que indica que la sensibilidad a los fármacos de las células inversamente correlacionada con su ADN la capacidad de reparación (Tabla 2).
un hallazgo notable fue que después del tratamiento con carboplatino, una fracción de las células mostró difusa, brillante tinción γH2AX pan-nuclear. Estudios anteriores han demostrado que la tinción γH2AX pan-nuclear representa una señal de pre-apoptótica asociada con ATM- y la apoptosis dependiente de JNK durante la replicación [31]. En línea con los resultados de los experimentos de eficiencia de reparación del ADN, se observó un mayor nivel de tinción pan-nuclear γH2AX [expresado como AUC (% de tinción de las células pan-nucleares) x (dosis de carboplatino)] en las células A2780 (13400 ± 2850) que en las células A2780 /C30 (7500 ± 1760) (
P = 0,001
, Tabla 2).
reparación del ADN deficiente de los daños inducidos por platino en PBMCs de pacientes OC se correlaciona con un mejor resultado clínico
en cuanto a las PBMC, de acuerdo con estudios anteriores [32], se encontró que se observaron después del tratamiento de las PBMC que no se dividen con fármacos de platino, precios muy bajos o nulos de inducción de las moléculas clave en estudio. Por lo tanto, se trataron primero PBMCs a partir de nueve voluntarios sanos con varias dosis de PHA para un máximo de 72 horas para inducir la proliferación de las células. Los resultados óptimos se obtuvieron después de la incubación de 48 horas de PBMCs con PHA 10μg /ml (datos no presentados). Entonces, PBMCs se trataron con cisplatino (0-300μg /ml para un máximo de 3 h), seguido de incubación en medio libre de drogas para 0-24h o con carboplatino (0-1800μg /ml para un máximo de 24 horas), seguido de post-incubación en medio libre de drogas para 0-24 h. De acuerdo a los resultados de los experimentos de líneas celulares, por cualquiera de los fármacos de platino, una inducción dependiente de la dosis de todas las moléculas clave se observó (Fig. 3A, C), con la γH2AX que muestra de nuevo las tasas de inducción más altos (Fig. 3B A, C). Por otra parte, los niveles de daño en el ADN de platino-inducida en PBMCs de los mismos nueve voluntarios sanos se midieron usando el ensayo de cometa alcalino. También se encontró que la
ex vivo
tratamiento de las PBMC con cisplatino (Fig. 3E) o carboplatino (Fig. 3F) mostró un aumento dependiente de la dosis de los niveles de daño del ADN. Tomados en conjunto, los resultados de las dos líneas celulares y experimentos PBMCs indican que inmunofluorescencia cuantificación de γH2AX focos y ensayo cometa alcalino son dos enfoques de gran alcance para la cuantificación del daño del ADN inducido por platino en muestras clínicas.
PBMCs de nueve saludable voluntarios eran
ex vivo
tratado (a) con cisplatino (0-300μg /ml) durante 3 h o (B) con cisplatino 150μg /ml, posteriormente se incubaron en medio libre de fármaco para varios períodos de tiempo (0- 24h), y se analizaron posteriormente mediante microscopía confocal. También, PBMCs de los mismos voluntarios sanos fueron tratados (C) con carboplatino (0-1800μg /ml) durante 24 horas o (D) con 1400μg carboplatino /ml durante diversos tiempos (0-24h) y se analizaron al final del tratamiento usando microscopia confocal. Las barras de error representan la desviación estándar. Finalmente, PBMCs se trataron con (E) cisplatino (0-150μg /ml) durante 3 h o (F) carboplatino (0-1800μg /ml) durante 24 horas y se analizaron posteriormente usando un ensayo de cometa. Los diagramas de caja muestran la distribución estadística de los niveles de daño en el ADN. Las líneas horizontales dentro de las cajas representan los valores de la mediana y las líneas verticales que se extienden por encima y por debajo de la caja indican los valores máximo y mínimo, respectivamente. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.
A partir de entonces, el uso de estos ensayos se examinaron los niveles intrínsecos de daño en el ADN en PBMCs no tratados de los tres grupos de individuos (voluntarios sanos, pacientes sensibles y resistentes a los pacientes a la quimioterapia de platino ). Tanto la tinción de inmunofluorescencia γH2AX y ensayo cometa mostraron diferencias significativas entre los tres grupos de individuos (todos los
P Hotel & lt; 0,05; Tabla 3), con el daño en el ADN intrínseca siendo mayor en los pacientes OC que en los voluntarios sanos. Curiosamente, en línea con los resultados de las células de carcinoma de ovario líneas experimentos, los niveles más altos de daño en el ADN intrínseca se observaron en PBMCs de pacientes sensibles en comparación con aquellos que son resistentes a la quimioterapia de platino posterior (γH2AX,
P
= 0,05; cometa ensayo,
P
= 0,003; Tabla 3; Fig. 4A-D). En particular, el uso de γH2AX la tinción de inmunofluorescencia, los pacientes sensibles al platino exhiben 16,8 ± 2,3% de células positivas, los pacientes resistentes al platino 8,9 ± 2,4%, mientras que los voluntarios sanos mostraron 3,9 ± 1,2% de células positivas (Tabla 3; Fig. 4A). Mediante el uso de ensayo cometa, los pacientes sensibles a la quimioterapia de platino mostraron valores OTM de 20.1 ± 5.5 unidades arbitrarias, resistente al platino de 7,8 ± 2,5, mientras que los voluntarios sanos mostraron 2,4 ± 1,1 unidades (Tabla 3; Fig. 4C). Curiosamente, para confirmar que las diferencias en las señales de DDR son realmente un reflejo de la sensibilidad de platino en lugar de tipo de tumor, los pacientes que llevan el mismo histotype se dividieron en se compararon sensibles y resistentes a la terapia con platino y los intrínsecos niveles de daño del ADN. Aunque cada subgrupo contiene un pequeño número de muestras, los resultados mostraron que las diferencias en los niveles de daño del ADN intrínsecas son un reflejo de la sensibilidad de platino. Por ejemplo, sólo en los tumores serosos, utilizando tinción γH2AX, los pacientes sensibles (
n
= 6) mostraron mayores niveles de daño en el ADN intrínseco (valor medio, las células positivas del 16,6% y el rango de 13,1 a 23,2%) que resistentes paciente (
n
= 1; 7,5%). Además, en el cáncer de ovario de células claras solamente, paciente sensible (
n
= 1) mostraron 18,5% de células positivas, mientras que los pacientes resistentes (
n
= 3) solamente 9,4% (rango, 6,3 -13,7%). Se obtuvieron resultados similares usando el ensayo de cometa.
(A) Diagrama de cajas que muestran la distribución estadística de los niveles del daño en el ADN en PBMCs intrínseca no tratados utilizando la cuantificación de inmunofluorescencia γH2AX. HV, voluntarios sanos; Sens: pacientes OC sensibles a la terapia con platino posterior; Res: OC pacientes resistentes a la terapia con platino posteriores. (B) Las imágenes típicas de análisis de microscopio de escaneo láser confocal de PBMCs de los tres grupos; imágenes superiores, tinción γH2AX; imágenes de fondo, los núcleos de células marcadas con DAPI. parcelas (C) de la caja que muestran la distribución estadística de los niveles del daño en el ADN intrínseca en PBMCs tratadas utilizando ensayo cometa alcalino. (D) Imágenes de cometas típicos de PBMCs no tratados de los tres grupos de individuos. Los diagramas de caja que muestran la distribución estadística de los niveles de daño en el ADN en PBMCs estimuladas en la proliferación usando PHA y tratados con carboplatino (0-1800μg /ml) durante 24 horas, usando (S) inmunofluorescencia cuantificación de γH2AX y ensayo cometa (F) alcalina. Las líneas horizontales dentro de las cajas representan los valores de la mediana y las líneas verticales que se extienden por encima y por debajo de la caja indican los valores máximo y mínimo, respectivamente. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.
Para examinar la eficiencia de reparación del ADN en los tres grupos de individuos, después de la incubación de 48h PBMC con PHA 10μg /ml, las células fueron tratadas con carboplatino (0 se analizó -1800μg /ml) durante 24 horas, después de la incubadas en un medio libre de drogas para 0-24h y el daño en el ADN inducido. Tanto γH2AX tinción de inmunofluorescencia y ensayo cometa mostraron resultados similares. Es decir, en todos los individuos analizados daño del ADN alcanzó niveles más altos al final del tratamiento de drogas, con daño en el ADN es más alta en pacientes de OC que en voluntarios sanos; pacientes sensibles al platino mostraron mayores niveles de daño del ADN que los resistente al platino (datos no mostrados). A partir de entonces, los niveles de daño de ADN se eliminaron y la extensión de la reparación fue mayor en voluntarios sanos que en los pacientes. Curiosamente, en línea con los resultados de los experimentos de líneas celulares, los pacientes sensibles al platino mostraron significativamente menor eficiencia de reparación que los resistentes al platino (
P Hotel & lt; 0,03). En particular, el uso de microscopía confocal de los focos γH2AX se retiraron con T
1/2 = 2,7 ± 0,5 h en controles sanos, 8,8 ± 1.9h en resistente al platino y 15,4 ± 3,2H en pacientes sensibles al platino.