Extracto
Antecedentes
survivina se expresa en el cáncer de próstata (CaP), y su regulación a la baja sensibiliza a las células de CaP a los agentes quimioterapéuticos
in vitro
y
in vivo
. Las pequeñas vesículas unidas a la membrana llamadas exosomas, secretadas desde el compartimiento de membrana endosomal, contienen ARN y proteínas que fácilmente transporte a través de la internalización exosoma en las células receptoras. El progreso reciente ha demostrado que los exosomas derivados del tumor juegan múltiples papeles en el crecimiento del tumor y la metástasis y pueden producir estas funciones a través de escape inmune, invasión tumoral y la angiogénesis. Además, el análisis de exosomas puede proporcionar nuevos biomarcadores para diagnosticar o controlar el tratamiento del CaP.
Métodos
Los exosomas se purificaron a partir del plasma y suero de 39 pacientes con CaP, 20 pacientes con HBP, el cáncer recurrente de próstata y 8 16 controles sanos mediante ultracentrifugación y sus cantidades y calidades se cuantificaron y se visualizan tanto del plasma y los exosomas purificados utilizando ELISA y Western Blot, respectivamente.
resultados
survivina se incrementó significativamente en el tumor muestras -derivado, en comparación con los de BPH y los controles con prácticamente ninguna diferencia en la cantidad de survivina detectado en exosomas recogidas de pacientes recién diagnosticados que exhibe (nueve) puntuaciones bajas (seis) o altas Gleason. niveles exosome Survivin también fueron superiores en los pacientes que habían recaído en la quimioterapia en comparación con los controles.
Conclusiones
Estos estudios demuestran que la survivina existe en exosomas de plasma de ambos sujetos normales, la HBP y CaP. Las cantidades relativas de exosomal survivina en plasma CaP fue significativamente mayor que en los pacientes con BPH y control de plasma pre-inflamatoria. Esta expresión diferencial de exosomal survivina fue visto con dos sujetos con CaP recién diagnosticados con cáncer avanzado y de alto o de bajo grado. Análisis de los niveles de Survivin exosomal plasma puede ofrecer una herramienta conveniente para diagnosticar o controlar el CP y puede, a medida que se elevan en baja, así como de Gleason alta marcados muestras, se utilizan para la detección temprana
Visto:. Khan S, Jutzy JMS, Valenzuela MMA, Turay D, Aspe JR, Ashok A, et al. (2012) derivados de plasma exosomal survivina, un marcador biológico plausible para la detección precoz del cáncer de próstata. PLoS ONE 7 (10): e46737. doi: 10.1371 /journal.pone.0046737
Editor: Jun Li, Escuela de Medicina de la Universidad Sun Yat-sen, China
Recibido: 3 Abril de 2012; Aceptado: 4 Septiembre 2012; Publicado: 16 de octubre 2012
Copyright: © Khan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo ha sido financiado, en parte, a partir de un generoso fondo de la puesta en marcha de la PI (NRW) por el Centro de Biología Molecular y Terapia génica que desde entonces se ha cambiado el nombre del Centro de disparidades de Salud y Medicina Molecular y de la Universidad de Loma Linda. La IP también ha contribuido con fondos de su cuenta personal. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
a nivel mundial, el cáncer de próstata (CaP) es el segundo cáncer más frecuentemente diagnosticado y la sexta causa principal de muerte por cáncer en los hombres [1], [2]. Aumento de la edad, el origen étnico y los antecedentes familiares son los únicos factores de riesgo establecidos y no se conocen factores de riesgo prevenibles establecido hasta la fecha [2]. Los cánceres de próstata (CaP) son generalmente tumores malignos que se caracterizan por un desequilibrio en las tasas de división celular y la muerte celular de crecimiento lento [3]. La cirugía y la radioterapia son eficaces para la enfermedad localizada pero no hay una estrategia de tratamiento eficaz para CaP recurrente o metastásico que ha fracasado la cirugía, radiación o terapia hormonal [4]. Un reto importante para desarrollar tratamientos que son más eficaces depende de nuestra comprensión del mecanismo molecular (s) de la progresión del CaP, que nos llevará a identificar muchos de los posibles genes y procesos que están involucrados en la apoptosis, la proliferación celular, la metástasis diana terapéutica, y factor de crecimiento de señalización. antígeno total específico de la próstata (PSA) ha revolucionado el cribado CaP y ha resultado en una disminución general en el CaP metástasis y la muerte [5]. Desafortunadamente, la aplicación de la prueba de PSA también ha dado lugar a un exceso de detección y tratamiento excesivo como PSA no es ni cáncer específico ni un sustituto para el comportamiento biológico del CaP [5], [6]. Las elevaciones en los niveles de PSA pueden reflejar una presencia de cáncer, pero también pueden estar presentes como resultado de la infección, la inflamación crónica o la hiperplasia benigna de próstata (BPH) [7], [8]. BPH se ha demostrado que existen en más de 70% de los hombres mayores de 70, pero no se considera que es un precursor del cáncer de próstata a pesar de que con frecuencia coexisten [9]. Por lo tanto, es necesario seguir para la detección de biomarcadores que son cáncer-específica y que son detectables temprano en el curso de la enfermedad.
Los procesos tanto de la supervivencia celular y la muerte celular han implicado vías de señalización altamente regulados que son actualmente objeto de intensa investigación. Se sabe que la regulación de la apoptosis tiene un papel central en el desarrollo del cáncer de próstata y su progresión a un estado independiente de andrógenos, lo que es debido, en parte, a un máximo de regulación de los genes antiapoptóticos después de privación de andrógenos [10] - [12]. Varias líneas de evidencia sugieren que uno de los principales eventos asociados con la progresión tras el fracaso terapéutico se incrementa la resistencia a la apoptosis [13], [14], debido principalmente a la regulación de los genes anti-apoptóticas, incluyendo Bcl-2, Bcl-X
L, MCL-1 [15], y survivina [16]. Survivina, un inhibidor de la apoptosis (IAP) miembro de la familia de proteínas, se asocia con el desarrollo del CaP, la progresión y la resistencia a fármacos [17] - [20]. Evidencias recientes indican que la sobreexpresión de survivina en los tumores de CaP se asocia con un mal pronóstico y el aumento de la recurrencia del tumor [21]. Por el contrario, también se ha demostrado que la caída de la expresión de survivina por siRNAs mejora la quimiosensibilidad de las células de cáncer de próstata, la reducción de la tumorigenicidad [22].
Tradicionalmente, la survivina se ha visto como una proteína citoplasmática o nuclear. Recientemente, la survivina ha demostrado también que existe extracelularmente, contenida en pequeñas vesículas unidas a la membrana conocidas como exosomas [23], [24]. Los exosomas están presentes en el suero y en la orina y contienen una amplia gama de proteínas y ARN y representan a su tejido de origen por lo que una posible fuente o conjunto de nuevos biomarcadores CaP [25]. De acuerdo con la asociación de survivina con clinicopathological parámetros desfavorables, el tráfico extracelular de survivina en todo el microambiente tumoral podría ser responsable de aumentar el estado agresiva de un tumor, mientras que prohíbe o minimizar los resultados terapéuticos. Recientemente hemos demostrado que la proteína survivina exosome unida puede ser secretada por las células cancerosas y ser absorbido por las células circundantes, produciendo un efecto de campo que confiere un fenotipo general de la supervivencia-estrés
.
Nuestro presente estudio fue diseñado para investigar la existencia de exosomal survivina en el plasma de pacientes con CaP con una variedad de presentaciones CaP y comparar sus niveles de expresión exosomal a los encontrados en voluntarios de control sin diagnóstico de cáncer y para los pacientes diagnosticados con hiperplasia prostática benigna o BPH. Durante los últimos 25 años el sistema de clasificación de Gleason se ha utilizado para ayudar a evaluar el pronóstico de los hombres con cáncer de próstata. Junto con otros parámetros, el cáncer de próstata ha sido puesta en escena como un medio para predecir el pronóstico y guiar la terapia [26]. Extracelular survivina se encuentra altamente expresado en los exosomas en plasma de pacientes con CaP que exhiben puntuación de Gleason de 6 (bajo) y 9 (alto), y en pacientes que habían recaído en la quimioterapia. Sin embargo, no hubo diferencias significativas en los niveles Survivin entre los sujetos con puntuaciones bajas o altas de Gleason. Además, aunque los exosomas contienen survivina se encontraron en el suero de pacientes con un diagnóstico de BPH, el nivel global fue significativamente menor que la encontrada en el plasma de pacientes con CaP. Creemos que, además de marcadores de diagnóstico, se necesitan marcadores de pronóstico, predicción y terapéuticos para actuar como puntos finales indirectos de la gravedad de la enfermedad de pronóstico, tratamientos de elección, y las respuestas a las terapias de seguimiento [27] - [30]. Nuestra demostración de exosomal survivina en el plasma de pacientes con bajo grado de diagnóstico reciente CP proporciona una base para estudios para investigar la utilidad de exosomal survivina como un biomarcador temprano, de fácil medición para el diagnóstico de CaP. Exosomal survivina también puede ser estudiado como un biomarcador para controlar el tratamiento de sujetos con CaP avanzado.
Resultados
Los niveles plasmáticos de survivina en controles sanos y pacientes con CaP
survivina fue detectable en el plasma de todos los sujetos de control sanos y los pacientes con CaP. Los resultados de la medición de plasma survivina en los controles sanos y pacientes con CaP normales se muestran en la Figura 1A. Los niveles Survivin medias en plasma fueron significativamente diferentes entre los sujetos de control sanos (61,5 pg /ml en los controles [n = 10]) y los grupos de pacientes de cáncer diferentes (Gleason 6 = 401,7 pg /ml [n = 10], Gleason 9 = 375,2 pg /ml [n = 10], y los sujetos resistentes al agente de la quimioterapia Taxotere = 410 pg /ml [n = 8]; P & lt; 0,05 para cada comparación frente a control). Cuando los niveles Survivin se compararon entre los tres grupos de pacientes con CaP en las comparaciones de dos vías, no fueron significativamente diferentes de los demás.
A. los niveles de survivina se midieron en plasma derivado de Gleason 6 (n = 10), Gleason 9 (n = 10) y sujetos Taxotere-resistentes (n = 8). niveles B. Survivin se midieron en suero derivado de BPH (n = 20), y PCA (n = 19). Las comparaciones se realizaron utilizando MANOVA con los controles sanos normales (n = 10 y 6, respectivamente). (**, P & lt; 0,05, ***, p & lt; 0,001; estadísticamente significativo).
survivina se pueden recoger a partir de suero tomado de controles sanos, pacientes con HBP y CaP
al igual que lo que se ha medido anteriormente en el plasma, la survivina también era detectable en el suero de pacientes que no tienen diagnóstico previo de cáncer, así como en pacientes con el diagnóstico de la hiperplasia prostática benigna (BPH) y los diagnosticados con cáncer de próstata (CaP) (Figura 1B). Los niveles medios en suero Survivin fueron significativamente (P & lt; 0,001) mayor en los sujetos con CaP (150 pg /ml [n = 19]) que en el suero de procesado de los controles normales (59,7 pg /ml [n = 6]) y de BPH pacientes (55 pg /ml [n = 21]).
plasma y suero survivina en pacientes con CaP existe en una piscina exosomal
previamente hemos demostrado que las células cultivadas con CaP liberan survivina en el extracelular medio en el exosomas [23]. También se sabe que estas pequeñas, vesículas de membrana que se producen en el plasma, así como el suero de pacientes con cáncer [31], [32]. por lo tanto exosomas se recogieron por centrifugación diferencial, y se cuantificaron usando los ensayos enzimáticos de la acetilcolinesterasa como nosotros y otros han descrito anteriormente [24], [33]. Los niveles medios de exosoma en plasma fueron significativamente diferentes entre los sujetos sanos de control y los diferentes grupos de pacientes con cáncer (P & lt; 0,001) mientras que las diferencias significativas en la cantidad exosome no se encontraron entre los grupos de muestras de pacientes con CaP (Figura 2A). Este fue también el caso cuando se comparan las cantidades de exosoma se encuentran en BPH y muestras de CaP a la de los sujetos de control sanos (Figura 2B). Curiosamente, parece que hay una diferencia medible en survivina y en exosomas, dependiendo de la fuente tanto como survivina y cantidades de exosoma fueron mayores cuando se purifica a partir de plasma a continuación, cuando se purifica a partir de suero.
A. los niveles de exosoma se midieron en plasma derivado de Gleason 6 (n = 10), Gleason 9 (n = 10) y sujetos Taxotere-resistentes (n = 8). niveles B. exosoma se midieron en suero derivado de BPH (n = 20), y PCA (n = 19). Las comparaciones se realizaron utilizando MANOVA con los controles sanos normales (n = 10 y 6, respectivamente). (**, P & lt; 0,05, ***, p & lt; 0,001; estadísticamente significativo).
exosomas derivados de plasma contienen survivina
Los exosomas se caracterizaron por inmunotransferencia para la cantidad de proteína survivina y asociada a la membrana lisosomal proteína 1 (LÁMPARA1). LÁMPARA1 es una proteína exosome conocido que se utiliza comúnmente para garantizar la adecuada Western blot de carga [24], [34], [35]. Los exosomas aisladas de plasma del paciente CaP exhibieron mejorada cargas Survivin comparación con exosomas aislados de los controles (Figura 3). El análisis de transferencia Western mostró que poco exosomal survivina era detectable en muestras de plasma recogidas de seis controles que no tienen diagnóstico previo de cáncer en comparación con la proteína de exosoma específica Lamp1 (Figura 3A). En contraste, los exosomas aisladas a partir de los veinte pre-tratamiento de sujetos con CaP contenían altas cantidades de proteína survivina en comparación con los niveles de proteína LAMP1 (Figura 3B). Curiosamente, no hubo diferencias significativas en el contenido exosomal survivina entre los pacientes con Gleason 6 CaP y aquellos con Gleason 9 PCA (Figura 3C) cuando se normalizaron contra Lámpara1 (p & lt; 0,05).
A. Los anticuerpos para survivina y Lámpara1 se utilizaron para el Western Blot de la proteína purificada exosomal paciente-control. Se detectaron anticuerpos B. Ambos Survivin y Lamp1 en el Western Blot de exosomas-derivan de Gleason 6 y 9. C. Gleason análisis Proporción de densidad de survivina a la densidad Lámpara1 fueron mostrados en tanto Gleason 6, 9 y Gleason con los controles sanos normales (* *, p & lt; 0,05, estadísticamente significativa) sin significación registrado entre Gleason 6 y Gleason 9 exosomas derivados de plasma
existe expresión diferencial de survivina en la BPH y derivados de PCa exosomas
Como el anterior, exosomas recogidos de HBP y CaP sueros de pacientes se caracterizaron por inmunotransferencia para la survivina y la proteína LAMP1 (Figura 4A). Los exosomas aisladas de CaP y HPB sueros de pacientes exhibieron mejorada cargas Survivin comparación con exosomas aislados de los controles (Figura 4A, Figura 4B y la Figura S1). Curiosamente, sin embargo survivina se ha detectado en la mayoría y elevada en ciertos pacientes con HBP, su nivel global fue significativamente menor que la que se encuentra en el CaP y no había diferencia significativa mide entre BPH y el control de los sueros de pacientes (Figura 4B).
A. Los anticuerpos para survivina y Lámpara1 se utilizaron para el Western Blot de la proteína purificada por exosomal paciente. B. Análisis Proporción de densidad de survivina a la densidad Lamp1 se muestra en ambos BPH y PCa con los controles sanos normales (**, p & lt; 0,05, ***, p & lt; 0,001; estadísticamente significativo) sin significación registrado entre los controles normales y BPH.
pacientes con CaP con progresión de la enfermedad expresan altos niveles de survivina exosomal
Finalmente, se valoró exosomas recogidas de pacientes con CaP que experimentaron progresión de la enfermedad durante el tratamiento con quimioterapia. Al igual que en nuestros pacientes exosomas Gleason, Western Blot mostró niveles de proteína survivina (Figura 5A) fueron marcadamente superiores en comparación con los sujetos control sin cáncer, lo cual fue confirmado para ser significativa tras el análisis densitométrico (Figura 5B).
. anticuerpos survivina y Lamp1 se muestran positivos. B. Análisis densitométrico de expresión /Lámpara1 survivina en un control sano (normal) y casos quimio-resistencia (CR) (**, p & lt; 0,05, estadísticamente significativa) guía empresas
Características clínicas y patológicas
.
los datos de tratamiento previo con respecto a Survivin y los niveles plasmáticos de PSA inicial y las puntuaciones de Gleason fueron adquiridas por los pacientes estudiados. Estas características patológicas se detallan en las tablas 1, 2, 3, 4. En total, ocho casos de recurrencia del cáncer de próstata después del tratamiento convencional, diez casos de Gleason 6, diez casos de Gleason 9, (Tabla 1); y se recogieron diez casos de control (Tabla 2) con plasmas analizados. PSA a partir del plasma (informe clínico) y de los exosomas de ultracentrífuga purificado mostró que aunque las concentraciones de proteína no eran idénticos, hay una similitud en la tendencia de plasma a los valores de PSA de exosoma derivados de plasma. Es importante destacar que, a pesar de survivina asciende significativamente menor en los exosomas eran más consistentes a través de los pacientes evaluados, y teniendo en cuenta la sensibilidad de la prueba ELISA, picogramos de survivina en comparación con nanogramos de PSA, es más preciso.
se realizaron otros estudios que utilizaron sueros en lugar de plasma en seis controles, veinte casos de BPH (Tabla 3) y 19 casos de CaP adicionales (Tabla 4). Al igual que antes, los resultados de ELISA de survivina proporcionan una cuantificación más sensible y estable que lo hizo el ELISA para PSA. La cuantificación de los sueros de pacientes con HBP mostró un promedio de 52,9 pg /ml y 1,3 survivina PSA ng /ml. En comparación, cuando se evaluó a partir de pacientes con CaP, survivina un promedio de 149 pg /ml y PSA promedio de 0,3 ng /ml (Tablas 3 y 4). números de BPH por tanto survivina y PSA son casi 3 veces menor que en el suero de los pacientes CaP. Por desgracia, compraron muestras de HPB no vienen con las cantidades de PSA ELISA clínicos que tenemos de los casos de CaP (Tabla 3).
Las correlaciones de survivina con PSA
De las muestras de plasma /suero del paciente evaluado para survivina, todas las muestras (Gleason 6, Gleason 9, la recurrencia, o muestras PCA) exhibieron mayor que 100 pg /ml de survivina (Tabla 5). En contraste, sólo el 60% de Gleason 6, 80% de Gleason 9 plasmas y 84% de CaP sueros tenía un PSA mayor de 4 ng /ml. plasmas de pacientes recurrentes todos tenían mayor que 4 ng /ml. En plasmas de control y los sueros de BPH, no muestra tenía una concentración de survivina mayor que 100 pg /ml y no la concentración de PSA mayor de 4 ng /ml (Tabla 5).
Discusión
carcinoma de próstata resistente a la apoptosis con la expresión alterada de ambas proteínas pro- y antiapoptóticas, evitando así los puntos de control de vigilancia internos, prosperando en microambientes desfavorables, y la adquisición de un fenotipo invasivo [20]. Estudios recientes sugieren que la inhibición de la apoptosis, en lugar de la proliferación celular mejorada, es un rasgo crítico que contribuye a la carcinogénesis de próstata. Entre los reguladores de la apoptosis CaP, recientemente el interés se ha centrado en la survivina, un miembro multifuncional del inhibidor de la apoptosis familia (IAP) de genes que contrarresta la muerte celular y controla la progresión mitótico. la sobreexpresión selectiva de survivina se ha asociado con un mayor grado del tumor, estadio de la enfermedad avanzada, la progresión tumoral rápida, la supervivencia a corto paciente, y la resistencia a la terapia en pacientes con diversos tumores malignos [17] - [19].
survivina existe en un número de localizaciones subcelulares, tales como las mitocondrias, citoplasma, y el núcleo. Recientemente también se ha encontrado en el espacio extracelular [23], [24]. Hemos demostrado que extracelular survivina existe en complejos multimoleculares, que incluyen las proteínas de choque de calor [24]. Por otra parte, también hemos demostrado que estos complejos residen en o sobre los exosomas, y que el tratamiento contra el cáncer pueden aumentar la liberación de dichos exosomas de células de cáncer [24]. Extracelular survivina es capaz de mediar en un efecto de campo pro-supervivencia a través de su secreción por las células de cáncer y absorción por las células normales y transformadas circundantes [23]. La vinculación de la capacidad extracelular de survivina para mejorar la proliferación celular, la supervivencia y la invasión de células tumorales con una modalidad de tráfico de membrana de protección proporciona soporte adicional para la hipótesis de que la survivina desempeña un papel fundamental en la patobiología de crecimiento de células cancerosas y la protección de las intervenciones terapéuticas.
Varios estudios anteriores han examinado los niveles plasmáticos de survivina en pacientes con cáncer [36], [37]. En adultos leucemia de células T y los sobrenadantes de cultivos in vitro de células de tumores sólidos, los niveles de proteína survivina fue baja en comparación con la proteína celular survivina y los niveles de ARNm [37]. Este descubrimiento dio lugar a la conclusión de que los niveles de proteína survivina en el plasma no reflejan survivin niveles celulares. Además, se evaluaron los niveles plasmáticos Survivin en comparación con alfa fetoproteína (AFP) en pacientes con hepatitis C crónica infección viral (VHC) con y sin carcinoma hepatocelular (HCC) [36]. Aunque no se llegó a la conclusión de ser lo más fiable en estos estudios como AFP, survivin niveles se determinaron para ser medible y significativa en los pacientes que sufren de VHC y medible pero no significativa en los pacientes con HCC. Aunque no es del todo claro, estos resultados podrían explicarse por el hallazgo de que las células de HCC infectadas con el VHC se hicieron más resistentes a la muerte celular y por lo tanto survivina liberan comparación con el control o las células infectadas con el VHC por sí solas [36].
La próstata antígeno (PSA) ensayo específico ha sido polémico utilizado en la detección del cáncer de próstata, aunque inicialmente fue concebido como una herramienta para evaluar la respuesta al tratamiento [38]. Su uso como una herramienta de detección fue impulsado por tanto la carga del cáncer de próstata de Estados Unidos y una necesidad de detectar su presencia a la vez que permita el tratamiento curativo para comenzar. Por desgracia, su uso se cree que ha llevado a ambos sobre el diagnóstico y el tratamiento excesivo y por lo tanto la necesidad urgente de nuevos biomarcadores que se pueden encontrar para complementar PSA para la gestión y el tratamiento [39]. mediciones exosomal Survivin pueden proporcionar otro ensayo basado en plasma para la presencia de PCa. En el presente estudio, hemos identificado por primera vez que los exosomas contienen survivina se pueden purificar a partir de plasma recogidas de pacientes con un diagnóstico de CaP. Aunque hubo poca diferencia en la cantidad exosome, los niveles de Survivin exosomal fueron mayores en exosomas purificados a partir de pacientes con CaP que de los sueros de controles normales. Además, en este estudio y que lleva a cabo por otros [36], [37], los niveles de Survivin plasma se cuantificó survivina en muestras tomadas de pacientes sin diagnóstico de cáncer confirmado, también se había reducido en comparación con sueros de pacientes CaP. La fuente de esta exosomal piscina survivina, aunque no está claro, puede originarse en células del sistema inmune [40] tales como los linfocitos [41], monocitos [42] y las células dendríticas [34], todas las células que contienen Survivin [43] que se han demostrado que la liberación exosomas. survivin expresión se asocia con las características establecidas de carcinoma de próstata biológicamente agresivos, tales como mayor puntuación de Gleason final y la metástasis a los ganglios linfáticos regionales [20]. En nuestro estudio encontramos que los pacientes que habían respondido al tratamiento con Taxotere tenían niveles elevados de exosomal survivina. Además, y de especial interés, se encontró que los pacientes que presentan cualquiera de mediados de Gleason (6) o alta (Gleason 9) puntuaciones de Gleason exhibidos survivin niveles más altos exosomal sin diferencias significativas en el contenido de survivina entre ellos. Nuestros resultados, aunque más robustos en el plasma se estudió aparecen de acuerdo con lo que se ha encontrado con la orina, exosomas tumorales y PSA [31]. En estos estudios, PSA exosome orina se describe como presente en 20 de 24 muestras de CaP mientras que en nuestras manos, exosome tumor survivina se encuentra en 47 de 47 muestras. Sea o no el tratamiento del cáncer afectará survivin niveles exosome tumor aún no se ha evaluado.
En este estudio, se proporcionan pruebas convincentes de que circula survivina puede ser un marcador diagnóstico y pronóstico útil para PCa humana. Nuestros resultados indican que la survivina, analizó directamente a partir de suero /plasma o del suero exosomas /derivado de plasma, fue menor en los pacientes con BPH y controles sanos que en los hombres con CaP. los niveles de survivina no cambiaron, siendo constantemente alta, con respecto a la puntuación de Gleason y los pacientes que tienen recidiva, lo que sugiere que los niveles de survivina podría ser utilizado para la detección temprana y podrían diferenciar tal vez un día más precisión BPH por CaP. Al comparar los pacientes con y sin tumores, pero ambos valores altos de PSA tienen también será un paso importante, ya que en nuestras manos todas las muestras de HPB que hemos adquirido tienen relativamente valores de PSA no tienen cáncer [44].
La papel de exosomal survivina es aún desconocido. Es posible que una, la terapia de liberación celular-tensado de los exosomas contienen survivina y otras proteínas, ARN anti-apoptóticas o miRNAs se realiza como un último intento de protegerse de la tensión que existe dentro del microambiente tumoral. Se requieren estudios más grandes con más eventos y un seguimiento más prolongado para desarrollar una declaración más definitiva con respecto a la asociación de la expresión de survivina en exosomas o en el microambiente del tumor con la progresión del carcinoma de próstata y de importante, la metástasis y la supervivencia. Estos resultados proporcionan un fundamento para una evaluación adicional de exosomal survivina y su papel en la resistencia a la terapia basada en androgénica en el carcinoma de próstata y plantear la posibilidad de una terapia de combinación específica para el cáncer de próstata avanzado.
Nuestro hallazgo de que la survivina, una único inhibidor humano de la apoptosis (IAP), tiene el transporte intercelular y las capacidades de señalización es significativa. De acuerdo con la asociación de survivina con clinicopathological parámetros desfavorables, el tráfico de survivina en todo el microambiente del tumor puede conducir el estado agresivo del tumor, prohibir o reducir al mínimo los resultados terapéuticos. En nuestro trabajo actual se muestra que aunque el número total de exosomas siendo derramada en el plasma del paciente no cambia significativamente durante el desarrollo del cáncer, el nivel de survivina en esos exosomas aumenta significativamente. Es importante destacar que la progresión desde mediados o finales de etapa no impulsa un aumento apreciable de survivina que indica que la survivina puede resultar útil como un biomarcador para la detección precoz del cáncer de próstata. De hecho, las pruebas basadas en la survivina, realizado en tumor-exosomas, permitirá el diagnóstico molecular basado en que con el tiempo también puede ayudar en las decisiones terapéuticas y vigilancia respuesta a las enfermedades que conducen a una mejor gestión de cáncer de próstata.
Materiales y Métodos
paciente plasma y suero
Las muestras de plasma se obtuvieron de diez voluntarios sanos de sexo masculino, y veinte y ocho pacientes con CaP. El plasma de veinte sujetos con CaP se obtuvo del banco de muestras del consorcio SPECS que es un ensayo clínico observacional que utiliza tejido de la próstata y los valores clínicos obtenidos por el consentimiento informado para derivar firmas de genes predictivos del resultado en el momento del diagnóstico. SPECS es dirigido por el Dr. Dan Mercola de la Universidad de California, Irvine. Las muestras eran de plasma previa a la prostatectomía seleccionados al azar de cada diez casos de bajo grado de Gleason PCA (6) y diez casos de CaP de alto grado (Gleason 9). Además, también se recogió el plasma de ocho infección avanzada pacientes con CaP que participan en un ensayo quimioterapia de segunda línea. Estos pacientes habían fracasado la quimioterapia con Taxotere. Diecinueve muestras de suero se obtuvieron de pacientes con CaP y seis controles a través de la San Manuel de laboratorio de muestras biológicas indios de la misión en Loma Linda Universidades Centro de Cáncer. Veinte muestras de HPB se adquirieron de Bioserve Biotecnologías, Beltsville, MD. BioServe Biotecnologías como proveedor de estas muestras está cubierta como se define en la Ley HIPPA de 1996, como les está proporcionando a nosotros con un conjunto limitado de datos de la información de salud protegida.
La sangre se recogió en tubos de vacío que contienen heparina sódica. Los tubos se centrifugaron a 2000 g x 7 minutos, y después se retiró el plasma y alícuotas para almacenamiento a -80 ° C. Todas las muestras se obtuvieron en el curso de estudios aprobado por el IRB, siguiendo la documentación del consentimiento informado, de conformidad con la política universitaria, tanto en la Universidad de Loma Linda y la Universidad de California en Irvine.
Humano survivina Inmunoensayo
muestras de plasma enteras fueron sometidas a un inmunoensayo survivina humana disponible comercialmente (R & amp; D Systems, Minneapolis, MN). utilizando las instrucciones del fabricante con el fin de cuantificar las concentraciones Survivin
exosome Aislamiento
plasma se aislaron microvesículas como se ha descrito anteriormente, con modificaciones menores [45]. Descongelada, plasma criopreservados (2 ml) se centrifugó durante 30 min a 500 x g, 45 min a 12.000 x g y 18 h a 110.000 x g. Los sedimentos se resuspendieron en un gran volumen de PBS, se filtró a través de un filtro de 0,22 mm (Millipore, Billerica, MA) y se centrifugó a 110.000 xg durante 1 h. pellets de microvesículas se lavaron una vez en un gran volumen de PBS, se centrifugaron a 110.000 xg durante 1 h y re-suspendió en 50 a 200 ml de PBS. La cantidad de proteínas g de pellets 110,000 × recuperados se midió usando el kit de ensayo de proteínas BCA (Pierce, Rockford, IL). Los exosomas se utilizaron como preparaciones frescas para inmunotransferencia o se conservaron a -80 ° C para su uso posterior. Para las muestras de suero, se empleó el ExoQuick disponible en el mercado (SBI, Mountain View, CA) como se describe por el proveedor. Brevemente, 100 l de suero se incubaron con 100 l de solución de ExoQuick seguido de una incubación de 2 horas a 4 ° C seguido de centrifugación a 1500 × g durante 30 minutos. Después de la centrifugación los exosomas aparecen como una pastilla de color beige o blanco en el fondo del recipiente que luego se reconstituyó con 500 l de dH
2O.
exosoma cuantificación
Para cuantificar la cantidad de exosomas liberados, se evaluó la actividad de la acetilcolinesterasa, una enzima que está asociada con estas vesículas. actividad de la acetilcolinesterasa se evaluó como se describe por Savina et al. [46]. Brevemente, 40 l de la fracción de exosoma se suspendió en 110 l de PBS. después se añadieron 37,5 ml de esta fracción diluida exosome-PBS a pocillos individuales en una microplaca de 96 pocillos de fondo plano. acetiltiocolina 1,25 mM y 0,1 mM 5,50-ditiobis (ácido 2-nitrobenzoico) se añadieron a continuación a las fracciones de exosoma en un volumen final de 300 l, y el cambio en la absorbancia a 412 nm se monitorizó cada 5 min durante 30 min.
inmunoensayo de PSA humano
exosomas aislados de plasma de los pacientes fueron sometidos a la próstata humana antígeno específico (PSA) usando un inmunoensayo de PSA (Research Products estadounidenses, Inc., Waltham, MA, EE.UU.) siguiendo el kit las instrucciones del fabricante con el fin de cuantificar las concentraciones de PSA en exosomas.
análisis de Western blot
Por Western blot, las células o preparados exosomal se lisaron usando tampón de lisis (50 mM Tris (pH 7,5), 1 % de NP40, 0,25% DOC, NaCl 150 mM
2, PMSF 1 mM, 10 mg /ml aprotinina /leupeptina /pepstatina, NaF 20 mM, EGTA 0,2 mM, EDTA 1 mM (pH 8,0), H2O). Para concentraciones de proteína se utilizó el ensayo de BCA (Pierce, Rockford, IL). Las proteínas de exosomas (20-40 g) se separaron usando 12% Bis-Tris geles de poliacrilamida, se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (Millipore, Billerica, MA) y se sondaron con los siguientes anticuerpos: anticuerpo monoclonal de ratón anti-LAMP1 (Abcam, Cambridge, MA ), y policlonal de conejo anti-survivina (Novus, Littleton, CO). Los anticuerpos secundarios (tinte IR conjugados) fueron de cabra anti-conejo y de cabra anti-inmunoglobulina de ratón (LICOR, Lincoln, Nebraska).