Extracto
Regulador de cullins-1 (ROC1) es una subunidad clave en el complejo de proteínas Cullin-RING ligasa (LCR). La sobreexpresión de la proteína ROC1 se asocia con la progresión tumoral y mal pronóstico de no músculo invasivo de vejiga carcinoma de células transicionales (CVNMI). Este estudio fue diseñado para evaluar los efectos de la caída ROC1 en células de cáncer de vejiga y para determinar los posibles mecanismos implicados. Un total de 112 muestras de tejido de cáncer de vejiga fueron reclutados para el análisis inmunohistoquímico de ROC1 sobreexpresión. líneas celulares de cáncer de vejiga se utilizaron para derribar la expresión ROC1 usando ROC1 siRNA. Nuestros datos muestran que ROC1 desmontables crecimiento de las células del cáncer de vejiga notablemente inhibido, las células detenidas en la fase G2 del ciclo celular, y se indujo la senescencia celular dependiente de p53. detención molecularmente, G2 se asoció con la regulación positiva de p21, p27, ciclina B1, y las proteínas de Cdc2. ROC1 caída inducida por senescencia funcionó a través de la ruta de p53 /p21. Desmontables de expresión p21 parcialmente rescatado ROC1 inhibición del crecimiento inducida por la caída en las células cancerosas. Por otra parte, de xenoinjerto en ratones desnudos Los análisis confirmaron estos
in vitro
datos. En conclusión, los datos de este estudio indican que ROC1 juega un papel esencial en la progresión del cáncer de vejiga y podría servir como diana contra el cáncer novedoso para carcinoma transicional de vejiga (BTCC)
Visto:. Wang W, Z Liu, Qu P, Zhou Z, Zeng Y, Fan J, et al. (2013) Derribo de Regulador de cullins-1 (ROC1) Expresión induce cáncer de vejiga detención del ciclo celular en la fase G2 y senescencia. PLoS ONE 8 (5): e62734. doi: 10.1371 /journal.pone.0062734
Editor: Xiaolin Zi, Universidad de California Irvine, Estados Unidos de América
Recibido: Enero 16, 2013; Aceptado: March 25, 2013; Publicado: May 8, 2013
Derechos de Autor © 2013 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Shanghai Líderes académicos del Sistema de Salud (núm XBR2011038). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de vejiga es el cuarto cáncer más común y es la octava causa de muerte por cáncer entre los hombres en el mundo [1]. Histológicamente, el carcinoma de células transicionales de la vejiga (BTCC) es el subtipo más común y representa el ~ 90% de todos los cánceres de vejiga [2]. Clínicamente, 20% a 30% de los casos de cáncer de vejiga recién diagnosticados han invadido en la capa muscular (llamado carcinoma de células de transición músculo invasivo, MI-TCC), mientras que un adicional de 10% a 30% de los cánceres de vejiga no musculares invasiva con el tiempo se progreso a MI-TCC [3]. Hasta la fecha, el tratamiento de cáncer de vejiga depende de la profundidad de que el tumor invade en la pared de la vejiga; para los pacientes MI-TCC, la quimioterapia basada en cisplatino se recomienda generalmente después de la cirugía [2]. Sin embargo, la toxicidad grave de quimioterapias y eficiencia relativamente baja contra el cáncer limitan su aplicación ampliamente en la clínica y la mayoría de los MI-TCC con el tiempo el progreso y la recurrencia, lo que lleva a un mal pronóstico de los pacientes con MI-TCC [2], [4]. Por lo tanto, la identificación de nuevas dianas y agentes anticancerígenos eficaces es de gran importancia clínica y necesita con urgencia.
Con este fin, nos hemos centrado en las ligasas Cullin-RING (CRL) (también conocido como Skp1, Cullin, o F proteína -box [SCF]), que son la mayor familia de ubiquitina ligasas E3. Debido a la capacidad para mediar en ~ 20% sustratos de proteína para la degradación ubiquitinadas proteasoma orientada [5], CRL jugar un papel importante en la ubiquitinación de las proteínas relacionadas con el ciclo celular u otras proteínas (por ejemplo, la proteína de replicación del ADN, proteínas de transducción de señales, Gene factor de transcripción) [6]. Sus asociados con la disfunción desarrollo y progresión tumoral, lo que sugiere que el CRL podría ser un objetivo potencial contra el cáncer. MLN4924, un inhibidor de molécula pequeña para inactivada CRL mediante la inhibición de la actividad cullins, podría inhibir eficazmente el crecimiento de diversas células de cáncer [7], lo que sugiere además la importancia de CRL en el mantenimiento del crecimiento del tumor [8], [9]. Sin embargo, el regulador de Cullins-1 (ROC1), otra subunidad clave de CRL que heterodimeriza con cullins distintas para constituir los núcleos catalíticos, cuya función asociada con el cáncer es poco entender [5]. ROC1, también conocido como caja del anillo proteína-1 (RBX1), contiene un pequeño dominio de unión a zinc-llama el dedo RING, es una proteína evolutivamente conservados desde la levadura al ser humano y juega un papel esencial en el desarrollo embrionario [5]. La expresión aberrante de ROC1 conduce a la disfunción CRL y causa letalidad embrionaria [10]. Recientemente, algunos estudios han hecho hincapié en su papel en cánceres humanos desde ROC1 puede ser esencial para el mantenimiento de la integridad del genoma [11]. En razón, la sobreexpresión de ROC1 causó aberración del metabolismo de las proteínas debido a la desregulación de la proteína ubiquitylation después de la traducción, y, finalmente, impacta en el desarrollo y progresión del cáncer. De hecho, la expresión ROC1 influyen en el desarrollo del melanoma de la piel mediante la regulación de la degradación cyclinD1 [12]. Constantemente, nuestros datos preliminares mostraron que la proteína ROC1 se sobreexpresa en el cáncer vesical no músculo invasivo, lo que sugiere su posible papel en el desarrollo del cáncer de vejiga y la progresión. En el presente estudio, se determinó el efecto de ROC1 caída en el cáncer de vejiga y los mecanismos subyacentes potenciales para proporcionar una nueva diana para el tratamiento de cáncer de vejiga en el futuro.
Materiales y Métodos
muestras de tejido
en este estudio, primero reclutó a 112 casos de muestras de tejido de BTCC de pacientes que se sometieron a cirugía en la Universidad de Shanghai Jiao Tong primer hospital Afiliado entre enero de 2004 y mayo de 2006. Estos pacientes incluidos 83 hombres y 29 mujeres fueron diagnosticadas y patológicamente con BTCC primaria y la edad de estos pacientes era de entre 30 y 86 años (edad media de 64 años). Setenta y un pacientes fueron sometidos a resección transuretral, 24 pacientes fueron sometidos a cistectomía parcial, y 17 pacientes fueron sometidos a cistectomía radical. El grado y el estadio de los tumores fueron evaluados de acuerdo con la Organización Mundial de la Salud (OMS) de 1973 y los criterios Comité Conjunto sobre el Cáncer sistema TNM (AJCC) 2002. Además, se recogieron también los tejidos normales de la vejiga distantes que eran más de 5 cm de distancia de la margen del tumor para este estudio. Un protocolo para el uso de muestras quirúrgicas humanos fue aprobado por el Comité de Ética Médica del Hospital de la Universidad de Shanghai Jiao Tong de Shanghai primeras personas (número de permiso: 2011K047) y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de cada paciente
La inmunohistoquímica
Histórico de bloques de tejido fijado en formol e incluidos en parafina de estos pacientes fueron seccionadas para 4 micras de grosor y utilizados para inmunohistoquímica, y el protocolo utilizado fue de acuerdo a la descripción de Pan [13]. Un anticuerpo policlonal contra ROC1 (Abcam, Cambridge, MA) o Ki67 (Epitomics, China) se diluyó en 1:300 y se utiliza para teñir inmunohistoquímicamente estas secciones de tejido utilizando un protocolo estándar con el kit de polímero Envision doble etiquetado (BioGenex, San Ramon, CA) según las instrucciones del fabricante. Las secciones fueron counterstained con hematoxilina y evaluados de forma independiente por dos patólogos.
Líneas celulares y Cultura y
cáncer de vejiga humana RT4, 5637, BIU87, 253J, T24, y las líneas celulares se adquirieron de EJ la Academia de Ciencias de china (Shanghai, china) y se cultivaron en medio RPMI 1640 (Gibco, CA, EE.UU.) con suero bovino fetal al 10% (FBS) (Gibco). Las células se cultivaron en una atmósfera humidificada 5% de CO
2 medio ambiente a 37 ° C. Además, se obtuvieron células uroteliales normales (NUC) y tejido de la vejiga frescas de 2 donantes jóvenes (30 y 32 años de edad), y se cultivaron a 37 ° C con 5% de CO
2 en un medio libre de suero de queratinocitos (KSFM; Gibco) suplementado con 1% de FBS, 100 IU ml
-1 penicilina, y 100 IU ml
-1 estreptomicina.
ROC1 siRNA y transfección
oligonucleótidos diferentes siRNA para diversos genes (como ROC1 o p21) se obtuvieron de Invitrogen (Carlsbad, CA) y se utilizaron para la transfección en células de cáncer de vejiga. Brevemente, las células se sembraron en placas de 6 pocillos durante la noche y el día siguiente, se transfectaron con ARNsi ROC1 usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Las secuencias de siRNA ROC1 fueron 5'-GACTTTCCCTGCTGTTACCTAA-3 '; para p21, 5'-GACCAUGUGGACCUGUCAC-3 '; y para el control mezclado, 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3 '. Las células se sometieron entonces a la extracción de proteínas u otros ensayos, como se indica a continuación.
extracción de proteínas y Western Blot
proteína celular se extrajo de las células con o sin la transfección de genes usando un tampón de lisis. Después de la cuantificación, los lisados de proteínas se resolvieron en un gel SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana de PVDF (Millipore, Billerica, MA), y a inmunotransferencia con un anticuerpo contra ROC1 (Abcam), GAPDH, Rb, ciclina B1 (Epitomics), p16 , p21, p27, p53, pRb, ciclina D1, y cdc2 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) y luego con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante. El anticuerpo unido se visualizó utilizando la metodología de luminiscencia química estándar.
Ensayos de proliferación celular y la formación de colonias
Para evaluar los fenotipos de células alteradas por desmontables de expresión ROC1, se transfectaron células con siROC1 o siCONT de 24 h y después se dividió y se sembró las células en placas de 96 pocillos con 2.000 células por pocillo por triplicado. A las 24, 48, 72, 96 y 120 h después de la transfección, la proliferación celular se evaluó utilizando el Kit-8 kit Cell Counting (Beyotime, China) según las instrucciones del fabricante.
Para la formación de colonias, el duplicado Las células se sembraron en placas de cultivo de 35 mm a 400 células (253J) o 1000 (5637 células por pocillo) por triplicado. Después de la incubación de 9 días a 37 ° C, las colonias se tiñeron con cristal violeta en metanol al 50% y el número de colonias de 20 o más células se contó.
Ensayo de citometría de flujo
Para detectar la distribución del ciclo celular alterada, que primero transfectó ARNsi en células de cáncer de vejiga y luego los fijó en 70% durante la noche etanol enfriado con hielo. El día siguiente, las células se lavaron dos veces con solución salina de fosfato enfriado con hielo tamponada (PBS) y luego se tiñeron con yoduro de propidio (PI; a 20 mg /ml, Sigma) solución durante 5 min. Las muestras de células se analizaron a continuación utilizando un flujo BD FACScan citómetro para las distribuciones del ciclo celular. Para la evaluación de la fase de la mitosis, las células se tiñeron con PH3 /PI utilizando el anticuerpo-H3 específico Alexa 647 conjugada con fosfo-histona (Cell Signaling Technology) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Cell senescencia asociada a la β-galactosidasa de ensayo expresión asociada a la senescencia
Cell de-β-galactosidasa (SA-β-Gal) la actividad se midió utilizando un kit de detección de la senescencia celular (Beyotime, china) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células con actividad β-galactosidasa positivo (color azul) a pH 6,0 se contaron bajo un microscopio óptico y se promediaron.
Evaluación de la Morfología celular e inmuno fluorescencia de tinción de fosfo-γH2AX
Después de la transfección con siROC1 o siCONT durante 24 h, las células de cáncer de vejiga se dividieron y se re-sembraron en placas de cultivo de 24 pocillos y se cultivaron durante 72 h. La morfología celular se observó bajo un microscopio invertido. Las células con alteraciones morfológicas agrandados y aplanados fueron considerados como positivos senescentes. Para γH2AX tinción focos, las células fueron transfectadas con siROC1 o siCONT durante 96 h, y después se fijaron con paraformaldehído al 4%, se permeabilizaron con 0,5% Triton X durante 10 min, y luego se bloquearon con albúmina de suero bovino 5% (BSA). Las células fueron incubadas con un anticuerpo primario anti-fosfo-γH2AX (Epitomics) a 4 ° C durante la noche. Las células se incubaron adicionalmente el día siguiente con un anticuerpo secundario Alexa 548 conjugado (Invitrogen, Carlsbad, CA) durante 1 h a temperatura ambiente, y de contraste con 4, 6-diamidino-2-fenilindol solución (DAPI) (1 mg /ml de Sigma) y revisado y anotado bajo un microscopio de fluorescencia.
RT-PCR cuantitativa
el ARN total fue aislado utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen) y luego se transcribe inversamente en ADNc utilizando una Transcripción inversa PrimeScript Sistema (Takara, china) según las instrucciones del fabricante. Las muestras de cDNA se amplificaron después usando el kit de mezcla maestra de SYBR Green (Takara). Las secuencias de los cebadores utilizados están disponibles bajo petición. Todas las mediciones se realizaron por triplicado. Amplicón se analizó mediante el método ΔΔCt [14].
En vivo
ratón xenoinjertos Ensayo
Para evaluar los efectos de la caída ROC1
in vivo
, se realizó un ratón desnudo (atímicos, BALB nu /nu /C) ensayo de xenoinjerto, es decir, 5 × 10
6 5637 células en 50 l de PBS mezclado con un volumen igual de Matrigel (BD Biosciences) se inyectaron subcutáneamente en ratones desnudos (con edades de 4-6 semanas de edad). Una semana después de la inoculación de células tumorales, 12 ratones se dividieron en 2 grupos (6 ratones en cada grupo, el diámetro del tumor es de aproximadamente 0,5 cm) y por vía intratumoral inyectado con 5 × 10
8 copias de Lenti-shROC1 en la LT -ROC1 grupo o 5 × 10
8 copias de Lenti-shCONT en el LT-CONT, respectivamente. secuencias ShROC1 o control shRNA estaban de acuerdo con un estudio previo [15]. El tamaño del tumor se midió cada dos días utilizando un calibrador, y el volumen del tumor se calculó utilizando la ecuación (L x W
2) /2 (donde L y W representan el diámetro longitudinal y transversal más largo, respectivamente). Después de la observación de 7 semanas, se sacrificaron los ratones y se retiraron xenoinjertos de tumores, se pesaron y se fotografiaron. Este estudio siguió a la manipulación de animales y los procedimientos experimentales y aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Hospital de la Universidad de Shanghai Jiao Tong de Shanghai primeras personas.
Análisis estadísticos
Los datos se expresaron como media ± error estándar de la media (SEM). Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el método de la prueba t de Bonferroni después de un análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) para la comparación de grupos múltiples. Dos comparaciones de grupos se analizaron mediante la prueba t de Student.
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Todas las evaluaciones estadísticas se realizaron con SPSS 13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL).
Resultados
sobreexpresión de la proteína ROC1 en BTCC muestras de tejido y líneas celulares
este estudio, se detectó por primera vez la expresión de la proteína ROC1 mediante inmunohistoquímica en 112 casos de muestras normales y de tejidos BTCC, y seis líneas celulares. Nuestros datos muestran que la proteína ROC1 se expresó débilmente en 18 de 24 (75%) urotelio normal de la vejiga, mientras que la proteína ROC1 fue altamente expresado en tejidos de cáncer de vejiga (Fig. 1), es decir, entre estos 112 muestras de tejido BTCC, proteína ROC1 fue moderadamente o expresa fuertemente en 29 (25,9%), y 66 (58,9%) muestras, respectivamente. Por otra parte, la proteína ROC1 se expresó en todas las líneas celulares humanas BTCC (RT4, 5637, BIU87, 253J, T24, y EJ) en comparación con las células uroteliales humanos primarios (Fig. 1).
A y B, inmunohistoquímica (aumento x 400). microarrays secciones de tejido teñido se anotó para cuatro grupos de acuerdo a la intensidad de la tinción. C, análisis de transferencia Western de la expresión ROC1 en diversas líneas celulares de BTCC y células uroteliales normales (NUC).
La inhibición de la BTCC crecimiento celular después de Derribo de ROC1 Expresión
Para evaluar el papel de ROC1 en el cáncer de vejiga, derribaron la expresión en líneas celulares ROC1 BTCC usando ROC1 siRNA y un siRNA revueltos como control. Nuestros datos muestran que ROC1 siRNA golpeó con éxito por la expresión de la proteína en ROC1 253J y 5637 células (Figura 2A y B).
A, las células C, E, 253J. B, D, F, 5637 células. Estas dos líneas celulares se transfectaron de forma transitoria con siROC1 o siCONT de 24 a 120 h y después se sometieron a transferencia de Western (A y B) análisis de expresión ROC1 a 72 h después de la transfección, la viabilidad celular CCK8 (C y D), o la formación de colonias (e y F) de ensayo. Los resultados representativos de tres experimentos independientes se muestran como media ± SEM. **
P
. & Lt; 0,01
A continuación, se evaluaron los efectos de la caída siROC1 en estas células de cáncer de vejiga y encontramos que las células siROC1 crecieron notablemente más lento que los de las células siCONT (
P Hotel & lt; 0,01 a 72 h, 96 h, y 120 h; Fig. 2C y D). ensayo de formación de colonias mostró además que el número de colonias se redujo a 5 a 10 veces en las células siROC1 en comparación con la de las células siCONT (
P
& lt; 0.01; Fig. 2E y F).
ROC1 derribo células detenidas en la fase G2 del ciclo celular
Se determinó la distribución del ciclo celular después de ROC1 caída en células de cáncer de vejiga y encontró que tanto 253J y 5637 células después de la caída ROC1 detenidos en el G2-M fase del ciclo celular. Específicamente, las células 253J siguientes transfectadas con ROC1 siRNA para 48, 72, 96, 120 h aumentó la fase G2-M a 11,88 ± 0,27%, 15,68 ± 0,56%, 16,8 ± 0,42%, y 10,8 ± 0,78%, respectivamente, en comparación con 6 a 8% en las células de control (figura 3A), mientras que 5637 células fueron 18 ± 1,41%, 35,5 ± 0,73%, 54,5 ± 2,12% y 46,27 ± 4,62%, respectivamente, comparado con el 11 al 14% en las células de control ( Fig 3B). Estos datos demuestran que G2-M detención en ambas células alcanzaron pico a 96 horas después de la transfección.
A y la detención del ciclo celular en G2-M inducida B, ROC1 caída en 253J (A) y 5637 células (B). Las células fueron transfectadas con siROC1 o siCONT para 48-120h, y se detectó el perfil del ciclo celular mediante FACS análisis siguiente yoduro de propidio (PI) tinción. C y D, ROC1 knockdown la detención del ciclo celular en G2 inducida. 253J (C) y 5637 células (D) se transfectaron con siROC1 o siCONT durante 96 h, y se sometió a análisis de FACS después de fosfo-histona 3 (PH3) /PI doble tinción. E y F, la expresión de proteína asociada a la del ciclo celular en 253J (E) y células 5637 (F) se examinaron usando Western blot después de la transfección en el intervalo de tiempo indicado. se muestran los resultados representativos de tres experimentos independientes. Columnas, con una media de tres experimentos independientes; bares, SEM. **
P
. & Lt; 0,01
A continuación, investigaron la expresión de los reguladores G2-M de transición relacionada, es decir, la transición G2-M del ciclo celular está regulado por un complejo de cdc2 y una de tipo B ciclina. De hecho, nuestros datos muestran que Cdc2 y ciclina B1 expresiones fueron sustancialmente hasta reguladas siguiente ROC1 caída en tanto 253J (fig. 3E) y 5637 células (Fig. 3F). También se determinó la expresión de inhibidores de CDK, tales como p21 y p27 y se encontró que p21 y p27 se acumularon de manera significativa en ROC1 caída en ambas líneas celulares (Fig 3E y F). Ciclina D1, un conocido regulador del ciclo celular de la fase G1, también fue inducida notablemente por el ROC1 caída en ambas líneas celulares (Figura 3E & amp;. F).
A fin de examinar las células cancerosas detenidos desmontables ROC1 en el G2 o M fases, se realizó un análisis FACS después de fosfo-histona H3 (PH3) /yoduro de propidio (PI) doble tinción de estas líneas celulares. Histona H3 es un indicador de la mitosis cuando está fosforilada en Ser10 durante la fase M, pero no en la fase G2 [16]. En comparación con las células siCONT, siROC1 mostró menos tinción positiva H3-fósforo-histona en tanto 253J y 5637 células (Figura 3C y D), lo que indica que siROC1 detenido células en la fase G2 en lugar de la fase M. De acuerdo con estos resultados, los datos de transferencia Western mostraron que ROC1 desmontables expresión reducida PH3 (Fig 3E & amp;. F). Disminución de la expresión de la proteína PH3 y la reducción de las células mitóticas indican que ROC1 desmontables células detenido en la fase G2, pero las células impidió entrar en la fase M.
ROC1 Derribo inducida por cáncer de vejiga 253J La senescencia celular a través de la p53 /p21
Morfológicamente, ROC1 derribado células 253J se convirtió ampliada y aplanada, morfología comúnmente observada en las células senescentes (Fig. 4A, paneles superiores), pero no apareció en 5637 células. Nos actividad determinó además asociada a la senescencia β-galactosidasa (SA-β-gal) (Fig. 4A, los paneles intermedios), un marcador específico de células senescentes. Como se muestra en la Fig. 4B, aproximadamente el 25% de las células se tiñeron positivamente 253J siguiente 96 horas de la transfección ROC1 siRNA, en comparación con la tinción positiva de menos de 4% en las células de control (
P
& lt; 0,01). Además, se evaluó la expresión de fosfo-γH2AX mediante la tinción de fluorescencia inmuno fl, que es un marcador de la senescencia celular. Nuestros datos muestran que las células transfectadas con 253J siROC1 tenían más focos γH2AX en comparación con la de las células siCONT (Fig. 4A, paneles inferiores), lo que indica, además, que ROC1 caída inducida por células 253J senescencia.
A y B, 253J las células fueron transfectadas con siROC1 o siCONT durante 96 h, seguido por observación morfológica (a, paneles superiores, aumento x 400), la tinción SA-β-gal (a, paneles de media, aumento x 400) y cuantificado con células teñidas positivamente (B) e inmuno fluorescencia de tinción de fosfo-γH2AX (A, paneles inferiores, aumento x 400). C, La expresión de proteína de la ruta asociada a la senescencia en células 253J se examinó utilizando el oeste después de la transfección blot en los intervalos de tiempo indicados. D, ROC1, p53, p21 mRNA en las células 253J en 72h después de la transfección se examinó utilizando cuantitativa en tiempo real PCR. se muestran los resultados representativos de tres experimentos independientes. Columnas, con una media de tres experimentos independientes; bares, SEM. **
P
. & Lt; 0,01
El p16 /RB y p53 /p21 ejes son dos vías principales asociados con la senescencia en respuesta a diversos factores de estrés. Desde gen p16 se elimina homozygousely en las células 253J [17], la proteína p16 era indetectable en las células 253J antes y después de ROC1 siRNA transfección (Fig. 4C). Sin embargo, tanto los niveles totales y fosforilados proteína Rb no se acumularon en ROC1 desmontables (Fig. 4C), lo que indica que ROC1 inducida knockdown-senescencia celular 253J es independiente de la vía de gen p16 /RB. Nuestros datos muestran la regulación al alza significativa de las proteínas p53 y p21 en células siROC1 a 96h y 120h siguiente ROC1 siRNA transfección (Fig. 4C), y
p53
junto con
p21
ARNm regulación al alza fueron también observadas utilizando PCR cuantitativa (Fig. 4D) en tiempo real. Nuestros datos actuales indican que la vía de gen p53 /p21 mediada los efectos de ROC1 caída en la senescencia celular de cáncer de vejiga, ya que las células 253J no expresan p16, pero tienen un tipo salvaje de p53, mientras que 5637 células expresaban mutado p53.
efectos de ROC1 derribo de inhibición de tumor de células de crecimiento mediante la expresión de p21
Para considerar si p21 se acumula tanto en G2 detención y la senescencia inducida por ROC1 caída, hemos determinado aún más el papel de p21 en la mediación de los efectos de ROC1 siRNA en la regulación del crecimiento celular del cáncer de vejiga. Nuestros datos muestran que la derogación simultánea de p21 y ROC1 utilizando siRNAs marcadamente atenuada expresión de la proteína p21 (Figura 5A & amp;. B) y la inhibición del crecimiento celular atenuada causada por ROC1 caída en tanto 253J y 5637 células (Figura 5C & Amp;. D). En las células 253J, SA-β-Gal tinción mostró que desmontables de expresión de p21 se redujo la tasa de senescencia celular inducida por ARNsi ROC1 (Fig. 5E), mientras que en 5637 células, ROC1 silenciamiento inducido detención G2-M fue marcadamente disminuido en caída p21 (Fig. 5F).
253J y 5637 células fueron transfectadas con el ARNsi se indica durante 96 h, y se sometieron a análisis de Western blot (a y B), ensayo CCK8 (C y D), la senescencia analiza con SA- tinción β-gal (e), y el análisis FACS con tinción PI (F). se muestran los resultados representativos de tres experimentos independientes. Columnas, con una media de tres experimentos independientes; bares, SEM. **
P Hotel & lt; 0,01 y ***
P
. & Lt; 0,001
Efectos de ROC1 siRNA en el Reglamento de 5637 celulares xenoinjertos Formación y crecimiento
Hemos mostrado
in vitro
efectos de ROC1 caída en líneas celulares de cáncer de vejiga. Hemos tratado de confirmar estos datos en xenoinjertos de ratones desnudos. Como se muestra en la Fig. 6A & amp; C, la inyección intratumoral de LT-ROC1 resultó en una disminución significativa en la tasa de crecimiento de tumores en comparación con el grupo de control tratado con LT-CONT (
p
& lt; 0,01). Tinción inmunohistoquímica de Ki67 se indica que la inyección de LT-ROC1 reduce xenoinjertos de ratones desnudos proliferación (Fig. 6B). El peso del tumor en los xenoinjertos LT-ROC1 fue significativamente menor que la del grupo de LT-CONT (
p
& lt; 0,05). Western blot datos mostraron que la proteína p21 se reguló en el grupo de inyección LT-ROC1 (Fig. 6E).
A, fotografías representativas de tumores aislados de ratones desnudos en cada grupo de 7 semanas después de la inyección de LTR y LTC. B, tinción IHC de xenoinjertos de tejidos con el anticuerpo indicado en ambos grupos. C y D, la curva de crecimiento del tumor (C) y el peso del tumor (D) en ambos grupos. E, ROC1 y p21 proteína en proteína extraída de xenoinjertos en ambos grupos se determinaron usando análisis de Western blot. Al final de los experimentos, los tejidos tumorales fueron extirpados de cada ratón y se pesaron. Columnas, con una media de peso de 5 tumores de los ratones individuales en cada grupo; bares, SEM. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01 y ***
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. & Lt; 0,001
Discusión
en el presente estudio, se informó de que la proteína ROC1 se sobreexpresa en 112 muestras de tejido de cáncer de vejiga y 6 líneas celulares en comparación con los tejidos y las células normales. Desmontables expresión ROC1 inhibe el crecimiento de células de la vejiga y la detención del ciclo celular inducida G2 y la senescencia celular dependiente de p53. Molecularmente, desmontables de expresión ROC1 regula positivamente la expresión de p21, p27, ciclina B1 y proteínas Cdc2. ROC1 inducida desmontables 253J células senescencia fue mediado a través de la vía de p53 /p21 y p21 desmontables expresión de la inhibición del crecimiento inducida por el cáncer de derribo ROC1 parcialmente rescatado en las células BTCC. Nuestros análisis de xenoinjerto de ratón desnudo confirmó aún más nuestras
in vitro
datos. Los datos actuales sugieren que ROC1 juega un papel importante en la progresión del cáncer de vejiga, y proteína de direccionamiento ROC1 es una estrategia anticáncer potencial para el cáncer de vejiga.
Estudios anteriores mostraron ROC1 sobreexpresión en varios tipos de cáncer y se asocian con la progresión del tumor [15], [18]. En el presente estudio, hemos confirmado estos datos en tejidos de cáncer de vejiga y líneas celulares. Se evaluó además el papel de la proteína en el cáncer de vejiga ROC1 por desmontables de expresión de la proteína ROC1 en dos líneas celulares de cáncer de vejiga diferentes. Demostramos que ROC1 caída inhibió el crecimiento de células de cáncer de vejiga
in vitro
y
in vivo
. detención Mecánica, ROC1 caída inducida ciclo celular en fase G2 y la senescencia celular en líneas celulares de cáncer de vejiga.
ciclo celular de fase G2-M es un mecanismo de punto de control común en respuesta a las tensiones externas y la inducción de G2-M detención es una estrategia útil en el tratamiento de varios cánceres humanos [19]. Molecularmente, Cdc2 quinasa y ciclina B1 constituyen M-fase factor promotor (MPF) que controlan la transición G2-M y progresión de la fase M [20], la actividad quinasa de los cuales está regulada negativamente por CDK-inhibidores (CDKIs, tales como p21, p27) y Cdc2 quinasas inhibidoras (tales como WEE1) [21]. En nuestro estudio, encontramos que ROC1 desmontables notablemente inducida detención en G2-M mediante la regulación positiva de la expresión de la ciclina B1 /Cdc2 proteínas en las células 5637 y 253J. Además, nuestros datos adicionales indicaron que ROC1 knockdown detenido las células de cáncer de vejiga en fase G2, aunque los mecanismos definidos no están claros. La explicación concebible puede ser que ROC1 caída inducida inactivación CRL que causó la acumulación de algunos sustratos CRL especiales (tales como p21, p27 y WEE1). Nuestros datos actuales muestran que ROC1 desmontables expresión de p21 y p27 inducida. Además, la ciclina D1, otro sustrato CRL bien conocido [22], fue también inducida notablemente por ROC1 caída en ambas líneas celulares. Sin embargo, no se observaron cambios significativos en la fase de detención G1-S-D1 asociada ciclina, que pueden ser ya que las células ROC1 caída detenidos en células en fase G2 se les impide entrar en la fase G0-G1.
Además , que también reveló que ROC1 caída inducida células 253J cáncer de vejiga de tipo salvaje de p53 en la senescencia través de una forma dependiente de p53. La inducción de la senescencia celular fue considerado como un importante mecanismo supresor tumoral [23], [24]. Diversas tensiones (por ejemplo, la disfunción de los telómeros, activación de oncogenes, el daño del ADN, y otros estímulos), todos pueden iniciar la senescencia celular [23]. La senescencia es mediada principalmente por vías supresoras tumorales dos: p53 /p21 y p16 /PRB [23], [24]. El presente estudio demostró que ROC1 caída indujo la senescencia celular p53 significativa en las células 253J de tipo salvaje, pero no indujo p53 mutado 5637 células. Por otra parte, el bloqueo de la vía de p53 /p21 por desmontables expresión de p21 aliviado significativamente ROC1 inducida por senescencia desmontables. Estos hallazgos sugieren que la senescencia inducida por la caída ROC1-se asocia con una ruta de p53 /p21 funcional. Sin embargo, Jia et al. mostró que ROC1 senescencia de pulmón y líneas celulares de cáncer de cuello uterino en una p53 o pRB- de manera independiente [15] caída inducida. Otra pregunta similar es lo que determina las células a someterse a la detención del ciclo celular o senescencia u otros tipos de muerte celular. El mecanismo exacto se desconoce, y suponemos que esta elección puede estar asociada con la dependencia de la línea celular (por ejemplo,
p
53 estado del gen, la especificidad de los sustratos de CRL, la duración de la tensión, et.al) y la intensidad de externo estrés [25] (como respuesta al daño del ADN, el estrés oxidativo, et.al). Por lo tanto, se necesitan más estudios para aclarar los mecanismos definidos responsables de ROC1 la muerte celular inducida por el cáncer de vejiga desmontables.
Además, también se observó que ROC1 caída inhibe el crecimiento tumoral de células 5637 en
in vivo
xenoinjerto de ratón desnudo con mecanismos similares. Diferentes etapas de cáncer de vejiga mostraron la capacidad de respuesta terapéutica diferencial a la radioterapia y la quimioterapia [26]. Un factor determinante de la susceptibilidad terapéuticos es
TP53
estado del gen [27]. Las células con la proteína p53 disfuncional mostraron una mayor resistencia a la radioterapia o la quimioterapia debido a la reducida respuesta al daño del ADN [3], [26]. El presente estudio demostró que ROC1 knockdown inhibió el crecimiento celular del cáncer de vejiga independientemente del estado de p53. Este resultado podría tener un impacto importante en el tratamiento de cáncer de vejiga. ROC1 desmontables utilizando interferencia gen o la inhibición farmacológica podría ser un nuevo enfoque para reforzar la capacidad de respuesta de la radioterapia y la quimioterapia de los pacientes de cáncer de vejiga. Por lo tanto, un mayor estudio investigará estos enfoques en controlar con eficacia el cáncer de vejiga.
En conclusión, el presente estudio mostró que ROC1 juega un papel importante en la progresión del BTCC, y ROC1 podría ser una nueva diana anticancerígena en BTCC. Se necesitan más estudios que aclaren los mecanismos detallados de la participación en ROC1 BTCC para validar nuestros resultados primarios.