Extracto
Antecedentes
La apoptosis juega un papel central en la patogénesis de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), y este proceso pueden ser reguladas por factor de transcripción mitocondrial A (mtTFA). La epigenética está implicado en la regulación y la modificación de los genes implicados en el cáncer de pulmón y la EPOC. En este estudio, se determinó la expresión de mtTFA y sus niveles de metilación en los pacientes con EPOC con cáncer de pulmón.
Métodos
Veintiún pacientes con cáncer de pulmón de células escamosas, 11 con EPOC y 10 sin EPOC, se inscribieron neumonectomía sometido. El índice apoptótico (AI) de las células endoteliales vasculares pulmonares se analizó por transferasa mediada desoxiuridina trifosfato-biotina ensayo de fin de etiquetado nick. La expresión de mtTFA ARNm y proteínas se midió utilizando PCR, inmunohistoquímica y Western-blot. La metilación del
mtTFA
promotor se detectó mediante la secuenciación de bisulfito PCR.
Resultados
En comparación con el grupo sin EPOC, la IA fue mayor, y la expresión de ARNm y mtTFA la proteína fue menor en el grupo con EPOC (
P Hotel & lt; 0,001). La expresión de la proteína mtTFA se correlacionó positivamente con el FEV
1 /Pre (
r = 0,892
,
P Hotel & lt; 0,001), y una correlación negativa con la IA (
r
= -0,749,
P Hotel & lt; 0,001) y el índice de humo (
r = -0,763
,
P Hotel & lt; 0,001). Porcentaje de
mtTFA
promotor de la metilación en los pacientes con EPOC fue significativamente mayor en comparación con los pacientes sin la enfermedad (
P Hotel & lt; 0,05).
Conclusión
Estos resultados sugieren que la expresión de mtTFA mRNA y proteína es regulada hacia abajo en el tejido pulmonar de los pacientes con EPOC con cáncer de pulmón de células escamosas, y el nivel de proteína mtTFA está relacionada con la apoptosis de las células endoteliales vasculares pulmonares. Aberrante
mtTFA
metilación puede también desempeñar un papel importante en la patogénesis de la EPOC
Visto:. Peng H, Yang H, Chen Z-Y, Chen P, Guan C-x, Xiang X-d, et al. (2013) Expresión y metilación del factor de transcripción mitocondrial A en pulmonar obstructiva pacientes con enfermedades crónicas con cáncer de pulmón. PLoS ONE 8 (12): e82739. doi: 10.1371 /journal.pone.0082739
Editor: Jorg Tost, CEA - Institut de génomique, Francia |
Recibido: 28 Marzo, 2013; Aceptado: 28 Octubre 2013; Publicado: 18 de diciembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Peng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 30800503, Nº 30770931 y Nº 81070039) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de la provincia de Hunan (núm 09JJ3036). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es una de las enfermedades crónicas más comunes. La prevalencia global en adultos mayores de 40 años de edad se estima en un 10% [1]. Muchos mecanismos tales como la inflamación crónica, proteinasa /desequilibrio anti-proteinasa, y el estrés oxidativo están involucrados en la patogénesis de la EPOC [2], y que interactúan entre sí durante el desarrollo de la enfermedad. Datos recientes de ambos modelos animales y estudios en humanos [3] - [6] sugiere un papel importante para la apoptosis endotelial en los procesos patológicos de la EPOC
factor de transcripción mitocondrial A (mtTFA, TFAM) es un núcleo codificada. proteína que se une aguas arriba del promotor de cadena ligera (LSP) y el promotor de cadena pesada (HSP) del ADN mitocondrial (ADNmt). mtTFA promueve la transcripción del ADN mitocondrial y regula la replicación del ADN mitocondrial [7]. La interrupción de la
mtTFA
anticuerpo en ratones en el agotamiento de ADNmt, pérdida de transcritos mitocondriales, deterioro de la respiración de la cadena, la apoptosis celular, y la reducción de polipéptidos codificadas por el ADNmt [8], [9]. Por otra parte, la sobreexpresión de mtTFA puede mejorar la disminución en el número de copias de ADNmt y la apoptosis en transgénicos (Tg) ratones [10]. Remels et al [11] encontró que la cantidad de proteína mtTFA fue significativamente menor en el músculo cuádriceps de pacientes con EPOC de moderada a muy grave que en los controles. También informaron que mtTFA cantidad de ARNm y proteínas fueron significativamente inferiores en los pacientes con EPOC en comparación con caquécticos que en ambos pacientes no caquécticos y sujetos control [11]. Estas observaciones sugieren que la interrupción de mtTFA está asociado con anormalidades del músculo esquelético en pacientes con EPOC. Sin embargo, la expresión de mtTFA en el pulmón de pacientes con EPOC no se ha estudiado y no se han elucidado los mecanismos subyacentes.
epigenética se refiere a cambios heredables en la función de los genes que se producen a través de los cambios en la estructura de la cromatina sin ningún cambio en la secuencia de ADN. Uno de los mecanismos epigenéticos clave es la metilación del ADN, que reprime la transcripción de genes, y modifica las histonas centrales de ADN alterada en el cromosoma. la metilación del ADN puede resultar en la activación o represión de genes [12]. Hasta la fecha, la mayor parte de la investigación en esta área se centra en el cáncer, el desarrollo y la diferenciación celular. Sin embargo, existe una creciente evidencia de que la epigenética también pueden desempeñar un papel importante en la regulación de genes implicados en el asma y la EPOC [13]. Demeo et al encontró que la metilación del ADN variable está asociada con EPOC y la función pulmonar [14]. También encontraron que los
Alu
y LINE-1 hipometilación se asocian con una menor función pulmonar y /o rápida disminución de la función pulmonar en los pacientes de edad avanzada [15]. Por lo tanto, la etiología epigenética presenta una nueva diana para el tratamiento del asma y la EPOC [16].
El humo del cigarrillo es un factor de riesgo para la EPOC. Numerosos estudios han demostrado que el tabaquismo puede alterar la metilación del ADN. Un informe anterior mostró que había al menos un gen de metilación aberrante en un 32 por ciento de la muestra cepillo bronquiales de las personas con un historial de fumar [17]. Kikuchi et al [18] también encontró TSLC1 /IGSF4 metilación se correlaciona con el índice de fumar. El consumo de cigarrillos y el intervalo de tiempo de abstinencia están asociadas con la metilación del ADN diferencial a través del genoma humano [19]. El análisis de secuencia reveló que hay 67 posibles loci metilación CpG entre -2246 pb y 132 pb de la humana
mtTFA
promotor, lo que sugiere que la metilación de citosina pueden desempeñar un papel en la regulación de la expresión mtTFA. Choi et al [20] encontró las actividades de luciferasa de pGL2-hTfam en células HepG2 transfectadas de forma transitoria se suprime por metilación específica de sitio. Este
in vitro
estudio demostró que la metilación del factor nuclear respiratorio 1 (NRF-1) región de unión inhibe fuertemente la actividad de la
mtTFA
promotor en las células HepG2 transfectadas de forma transitoria.
en el presente estudio, hemos probado la hipótesis de que los cambios en la expresión de mtTFA y aberrante
mtTFA
metilación podría desempeñar un papel importante en la patogénesis de la EPOC.
Materiales y Métodos
Declaración de ética
Este estudio fue aprobado por el comité de ética institucional de la Segunda Xiangya hospital de la Universidad Centro-Sur y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los sujetos antes de su inscripción en el estudio.
Los pacientes y sus datos generales
La población del estudio consistió en 11 pacientes con cáncer de pulmón de células escamosas (fase II) con EPOC y 10 pacientes con cáncer de pulmón de células escamosas (fase II) sin EPOC que fueron sometidos a neumonectomía. El tejido pulmonar 5 cm de distancia de margen del tumor fue utilizada en nuestros estudios. Todos los pacientes con EPOC sufren de limitación crónica del flujo aéreo, que se define como un post-broncodilatador volumen espiratorio forzado en un segundo sobre la capacidad vital forzada (FEV
1 /FVC) es & lt; 70%, en ausencia de otras causas. Todos los pacientes no habían recibido trasplante de pulmón, la radioterapia, la quimioterapia o la terapia con corticosteroides inhalados. Los sujetos inscritos no tenían otras condiciones médicas tales como confoundable gastrointestinal, renal, endocrino, metabólico y enfermedades inflamatorias. FEV
1 y FVC se evaluó a partir de la curva flujo-volumen obtenido con un espirómetro (Sensormedics AUTOBOX-6200D, EE.UU.). parámetros de la función pulmonar se expresaron como un porcentaje de valores de referencia. Características generales de los pacientes se muestran en la tabla 1. No hubo diferencias en la edad o el sexo entre los dos grupos (
P Hotel & gt; 0,05). En comparación con el grupo sin EPOC, el índice de tabaquismo de los pacientes con EPOC fue significativamente mayor (
P Hotel & lt; 0,001), mientras que tanto el FEV
1 /Pre (%) (porcentaje de FEV
1 real de FEV
1 predica) y el FEV
1 /FVC (%) fueron menores en el grupo con EPOC (P
. & lt; 0,001) guía empresas
Métodos
secciones
Los estudios histológicos.
incluidas en parafina
de tejido pulmonar humano se deparaffinized y rehidratada con xileno y etanol. Las secciones se lavaron brevemente, se tiñeron en una solución de hematoxilina de Harris durante 5 a 10 minutos, diferenciados en alcohol ácido al 1% durante 30 segundos, y después se lavaron. Las secciones fueron counterstained en solución de eosina-floxina durante 30 segundos a 1 minuto, se deshidrataron con alcohol al 95% y 2 cambios de alcohol absoluto durante 5 minutos cada uno, despejado en 2 cambios de xileno 5 minutos cada uno, y se montaron con medio de montaje basado en xileno . Histología fue evaluada por un patólogo de una manera ciega. Como el enfisema es un trastorno estructural caracterizada por la destrucción de las paredes alveolares y la ampliación de los espacios alveolares, la ampliación de los espacios alveolares se evaluó mediante la cuantificación de la intersección media lineal (MLI) y la destrucción de las paredes alveolares midiendo el índice de destrucción (DI). La MLI, una medida de la distancia entre la pared alveolar, se determinó por microscopía de luz con un aumento total de 100 ×. Los campos que incluyen las vías respiratorias grandes o los vasos fueron excluidos del análisis. La MLI se definió como la longitud total de la línea transversal dividido por el número de paredes alveolares que se cruzan las líneas de prueba, como se describe por Xu et al [21]. El DI se calculó como una medida de la destrucción del parénquima utilizando una técnica de conteo de puntos microscópica [22]. El análisis se realizó por duplicado contando al azar más de 3.000 alvéolos de 50 secciones HE de cada paciente con una ampliación de 200 aumentos.
Medición de la apoptosis.
Terminal deoxynucleotidyltransferase mediada por dUTP Nick End Etiquetado (TUNEL) ensayo se utilizó para medir la apoptosis de las células endoteliales en los pulmones de pacientes con EPOC. secciones de tejido de criostato de pulmón se fijaron en paraformaldehído al 1% en PBS durante 10 min a temperatura ambiente. tinción de TUNEL se realizó con el
In Situ Cell Death
Detección Kit-POD (Roche). TUNEL células positivas y negativas en toda la sección se contaron por un patólogo de una manera ciega, y el índice de apoptosis se calculó como el número de células TUNEL positivas endoteliales células /enteros endoteliales.
inversa de la cadena de la polimerasa-transcriptasa La reacción (RT-PCR).
El ARN total fue extraído utilizando el reactivo Trizol método de extracción de un solo paso (Invitrogen, EE.UU.). La concentración de ARN se determinó usando un espectrofotómetro y la calidad se verificó por electroforesis en gel de agarosa. RNA (2 mg por muestra) fue transcrito inverso para hacer el ADN complementario (ADNc) según las instrucciones del fabricante (kit de RT, Fermentas, EE.UU.). cDNA se amplificó por PCR usando ADN polimerasa Taq Platinum (Invitrogen, Breda, Países Bajos) en un aparato termociclador (Applied B PE4500, EE.UU.). condiciones de ciclación térmica fueron diseñados como sigue: desnaturalización inicial a 95 ° C durante 5 min, seguido de 35 ciclos a 94 ° C durante 30 seg y 55 ° C durante 45 seg, y una etapa de extensión de 5 min a 72 ° C. Los pares de cebadores utilizados para la PCR fueron las siguientes: 5'-TATCAAGATGCTTATAGGGC-3 'y 5'-ACTCCTCAGCACCATATTTT-3' para mtTFA (amplicón tamaño esperado: 441 bp); 5'-ACCCACACTGTGCCCATCTAC-3 'y 5'-TCGGTGAGGATCTTCATGAGGTA-3' para la β-actina (amplicón tamaño esperado: 103 bp). nivel de transcripción constitutiva de la limpieza de genes β-actina se midió cuantitativamente como control de carga de ARN. La expresión génica se cuantificó y se expresa en unidades arbitrarias (AU).
Real-time RT-PCR (QRT-PCR).
Aislado ARN transcrito fue invertir en cDNA por RT-PCR. cDNA se amplificó por PCR usando Taq ADN polimerasa Platinum (Invitrogen, Breda, Países Bajos) en un aparato Bio-Rad iCycler (Bio-Rad, EE.UU.). condiciones de ciclación térmica fueron diseñados como sigue: desnaturalización inicial a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos a 95 ° C durante 10 seg y 57 ° C durante 20 seg, y una etapa de extensión de 5 min a 72 ° C. Los pares de cebadores utilizados para la PCR fueron las siguientes: 5'-GAACAACTACCCATATTTAAAGCTCA-3 'y 5'-GAATCAGGAAGTTCCCTCCA-3' para mtTFA; 5'-CCAACCGCGAGAAGATGA-3 'y 5'-CCAGAGGCGTACAGGGATAG-3' para la β-actina. tamaños de amplificación esperados fueron 95 pb y 97 pb. La especificidad de la amplificación se verificó por análisis de la curva de fusión y la evaluación de la eficiencia de la amplificación de PCR. Los niveles de transcripción del constitutiva de limpieza de genes β-actina de productos se midieron cuantitativamente para el control de carga. Los cambios relativos en la abundancia de transcripción se expresaron como? C
valores T (? C
T =? C
-ΔC referencia T
blanco T), donde higherΔC
valores de T indican una mayor transcripción abundancias.
análisis de transferencia de Western.
un total de 40 g de proteína de cada muestra se separó en 12% de gel de SDS poliacrilamida, y electrotransfirió a una membrana de fluoruro de polivinilideno. La membrana se bloqueó con leche en polvo desnatada al 5% en PBS que contenía 0,05% de Tween (PBST) durante 1 hora. Después de lavar con PBST, la membrana se incubó con un anticuerpo monoclonal de conejo anticuerpo mtTFA (1:100; Abcam, EE.UU.) durante la noche a 4 ° C. La membrana se lavó cuatro veces y se incubaron con peroxidasa de rábano conjugada con anticuerpo secundario (anti-conejo, 1:10,000; Santa Cruz, CA) durante 1 hora. La película fue desarrollado por un aumento de sistema de detección de quimioluminiscencia (ECL, BestBio Pharmacia Biotech). Los niveles del producto de limpieza de genes constitutiva β-actina también se midieron como control de carga. La expresión de la proteína se cuantificó y se expresa en unidades arbitrarias (AU).
La inmunohistoquímica.
Secciones de tejido pulmonar humano
incluido en parafina fueron desparafinados y rehidratados con xileno y etanol. La recuperación del antígeno se realizó mediante el método de microondas con tampón de citrato durante 20 minutos. Se realizó bloque de avidina y biotina, y la peroxidasa endógena se inactivó con peróxido de hidrógeno al 3%. Después de bloquear con suero de cabra normal al 5%, se aplicó un anticuerpo de conejo anti-humano mtTFA (1:100) (Abcam, EE.UU.) durante la noche a 4 ° C. Las secciones se lavaron con PBS con 0,05% de Tween y se incubaron con biotina de cabra anticonejo IgG (1:10,000; Santa Cruz, CA). Después del lavado, las secciones fueron teñidas con reactivos ABC Vectastatin (Wuhan Boster Biológica Technology Corporation, Ltd) y DAB (Beijing Zhong Shan-Puente Golden Biológica Technology Corporation). Las secciones fueron anotados por un patólogo de un modo ciego (número de células endoteliales mtTFA-positivas /100 células endoteliales por caja) para la tinción mtTFA en los capilares, arterias pequeñas /medianas.
bisulfito de secuenciación PCR (BSP).
ADN genómico se aisló de tejido pulmonar utilizando el kit de aislamiento de ADN DNeasy (Qiagen, Valencia, CA), seguido de digestión con EcoRI. modificación con bisulfito de ADN genómico se realizó utilizando el Kit DNA EZ metilación-Gold (Zymo Research Corporation, Orange, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, 1 g de ADN purificado (20 l) se incubó en 130 l de reactivo de conversión CT en 98 ° C durante 10 min y 64 ° C durante 2,5 h, lo que resulta en la conversión de citosinas no metiladas en uracilo. Después de la purificación del ADN, el ADN modificado con bisulfito se amplificó usando PCR. Los cebadores fueron diseñados utilizando el programa en línea MethPrimer (http://www.urogene.org/methprimer/): cebadores de PCR, 5'-TATTAGAATTTGTTAAATTTTGGGGAAT-3 'y 5'-3-ACAAACAATCCTACATCCAAAACC'. Las condiciones de PCR fueron las siguientes: 3 min a 94 ° C; 35 ciclos de 30 segundos a 94 ° C, 30 seg a 56 ° C y 40 seg a 72 ° C; y una etapa de extensión de 5 min a 7 ° C. Los productos de PCR se purificaron usando electroforesis en 1% de geles de agarosa (QIAquick kit de extracción de gel; Qiagen), recuperadas o mediante precipitación con etanol, y luego clonados utilizando la ligadura en pCR 2.1-TOPO vectores de clonación con un kit de clonación TA (Takara, EE.UU.), seguido mediante el uso de las bacterias competentes DH5a (clave de laboratorio humano del médico Epigenómica, el segundo hospital Xiangya, Universidad Centro-Sur). El ADN del plásmido aislado a partir de al menos cinco clones para cada producto de la reacción PCR fueron sometidos a análisis de la secuencia de ADN en el Shanghai Biotecnológica Company. En comparación con la secuencia genómica de ADN original de mtTFA, la metilación de CpG se determinó como aparece citosinas no convertidos en los sitios CpG en el ADN modificado con bisulfito.
Análisis estadístico.
El análisis estadístico se realizó con SPSS versión 13.0. Los datos se presentan como media ± desviación estándar. T prueba comparó la diferencia entre los grupos. análisis de correlación lineal se realizó utilizando correlaciones de Pearson producto momento. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas si
P Hotel & lt;.. 0.05
Resultados
El análisis histológico de los tejidos pulmonares
El cambio patológico del tejido pulmonar
no hubo diferencias significativas entre el grupo patológicos sin EPOC y el grupo EPOC. La morfología del tejido pulmonar fue normal en el grupo sin EPOC. septos alveolares estaban intactas y había poca infiltración de células inflamatorias (Figura 1A). Pero en el grupo EPOC, hubo infiltración inflamatoria grave tanto en las vías respiratorias y los alvéolos. Como se muestra en la Figura 1B, se observaron defluxion cilio y la proliferación de células caliciformes en las vías respiratorias, mientras tanto se detectaron destrucción y rarefacción en alvéolos de los pacientes con EPOC. En comparación con el grupo sin EPOC, la MLI y DI fueron significativamente mayores en el grupo EPOC (MLI:. 70 ± 23 micras
vs
43 ± 6 micras,
P Hotel & lt; 0,001; DI: 55 ± 4%
vs
16 ± 3%,
P Hotel & lt; 0,001)
las microfotografías de tejido pulmonar del grupo sin EPOC (panel.. A) y el grupo EPOC (grupo B) (magnificación: 100 ×). La intercepción lineal media (MLI) y el índice de destrucción (DI) en el grupo de EPOC fueron significativamente mayores en comparación con el grupo sin EPOC (
P & lt; 0,001
).
los cambios patológicos de la vasculatura pulmonar.
La morfología de los vasos pulmonares entre los grupos sin EPOC y la EPOC fue diferente. La vasculatura pulmonar era normal y había poca infiltración de células inflamatorias en el grupo sin EPOC (Figura 2A). Sin embargo, en el grupo de la EPOC, las paredes de los vasos eran mucho más gruesa, especialmente en la capa de músculo liso. El lumen se redujo como consecuencia de un aumento del grosor de la pared vascular en los pacientes con EPOC (Figura 2B).
Las microfotografías de los vasos pulmonares de la no-EPOC (grupo A) y el grupo EPOC (grupo B) (ampliación: 100 ×). La presentación histológica de la vasculatura pulmonar entre el grupo de pacientes con EPOC y sin EPOC era diferente.
La apoptosis endotelial vascular pulmonar
La apoptosis de las células endoteliales vasculares pulmonares en el no-EPOC y grupos de EPOC se analizó mediante el ensayo de TUNEL. Las células apoptóticas positivas fueron teñidas de marrón amarillo en el ensayo de TUNEL. El índice de apoptosis de las células endoteliales vasculares pulmonares en el grupo EPOC era mucho más alta que en el grupo sin EPOC (
P Hotel & lt; 0,001). (Figura 3 y Tabla 2)
La Las células positivas se tiñeron de marrón amarillo por ensayo de TUNEL. Las microfotografías de TUNEL manchadas tejido pulmonar del grupo sin EPOC (grupo A) y el grupo EPOC (grupo B) (magnificación: 400 ×). El número de células TUNEL positivas pulmonares endoteliales vasculares en el grupo EPOC era mucho más alta que en el grupo sin EPOC.
Expresión de mtTFA ARNm y proteínas en el tejido pulmonar de los no-EPOC y los pacientes con EPOC
el tejido pulmonar
mtTFA
ARNm detectado por RT-PCR y QRT-PCR.
Se analizó la expresión de
mtTFA
mRNA en el pulmón tejidos de punto y RT-PCR cuantitativa. electroforesis en gel de agarosa mostró expresión de
mtTFA
ARNm en el tejido pulmonar de los pacientes con EPOC fue menor en comparación con la de los pacientes sin la enfermedad (Figura 4A). Además, la expresión de
mtTFA
ARNm en el tejido pulmonar también se determinó mediante qRT-PCR. La cantidad relativa de
mtTFA
la expresión de ARNm en los pacientes con EPOC era inferior a la de los pacientes sin la enfermedad (grupo EPOC: 0,59 ± 0,07
vs
grupo sin EPOC:. 0,78 ± 0,09,
P
. & lt; 0,001) (Figura 4B)
la expresión de la pulmonar
mtTFA
ARNm medido por RT-PCR (panel A). Línea 1, 2 y 3 fueron los pacientes sin EPOC y la línea 4, 5 y 6 fueron los pacientes con EPOC. El nivel de mtTFA mRNA en tejidos pulmonares del grupo EPOC fue menor en comparación con el grupo sin EPOC. La expresión de la pulmonar
mtTFA
ARNm medido por QRT-PCR (panel B). Los diagramas de caja muestran la variedad y la distribución de los datos con los cuartiles superior, inferior, y la mediana de la diferencia máxima de
mtTFA
ARNm en el grupo no-EPOC y el grupo EPOC. La mediana para cada conjunto de datos también está indicado por la línea central. La expresión de la proteína mtTFA (grupo C): Línea 1 y 2 fueron los pacientes sin la enfermedad y la línea 4 y 5 fueron los pacientes con EPOC. También se muestra el análisis cuantitativo de la densidad de proteínas (panel D).
La expresión de la proteína mtTFA del tejido pulmonar en pacientes sin la enfermedad y la EPOC.
expresión siguiente medido de la proteína mtTFA en el tejido pulmonar por Western blot. La expresión relativa de proteína mtTFA en el grupo EPOC fue menor que en el grupo sin EPOC (COPD: 0,32 ± 0,07
vs
sin EPOC:. 0,55 ± 0,09,
P Hotel & lt; 0,001) (Figura 4C & amp; 4D). Para caracterizar aún más la localización de la proteína mtTFA pulmonar, se realizó la tinción inmunohistoquímica de secciones de tejido pulmonar utilizando un anticuerpo específico para mtTFA. mtTFA proteína se localiza principalmente en las células endoteliales de los vasos sanguíneos, y en consonancia con el resultado de Western blot, su expresión fue menor en el grupo con EPOC en comparación con el grupo sin EPOC (Figura 5)
.
expresión de la proteína de mtTFA el grupo sin EPOC (grupo A) y el grupo EPOC (grupo B) (magnificación: 400 ×). mtTFA proteína era de color amarillo pardo en la tinción DAB. En comparación con el grupo sin EPOC, la expresión de la proteína mtTFA fue menor en el grupo con EPOC.
El estado de metilación de
mtTFA
promotor en el tejido pulmonar de los no-EPOC
vs
. los pacientes con EPOC
Se determinó además la situación de
mtTFA
promotor de la metilación en el tejido pulmonar de los no-EPOC y la EPOC paciente mediante análisis de secuencia de ADN y BSP. El
mtTFA
patrón de metilación del promotor de los tejidos pulmonares de los pacientes sin la enfermedad y la EPOC se muestran en la Figura 6A y 6B. El porcentaje de
mtTFA
metilación del promotor (%) en los pacientes con EPOC fue mayor en comparación con los pacientes sin EPOC (COPD:. 38.6 ± 14.7
vs
sin EPOC 27,8 ± 8,8;
P Hotel & lt;.. 0,05) (Figura 7)
el modelo de mtTFA metilación del grupo sin EPOC (grupo A) y el grupo EPOC (grupo B) guía empresas
los diagramas de caja muestran los extremos, los cuartiles superior e inferior, y la mediana de la diferencia máxima en los grupos sin EPOC y EPOC. La mediana para cada conjunto de datos se indica con la línea central,
P
valor de porcentaje de metilación de
mtTFA
promotor fue de 0,013 entre la no-EPOC y el grupo EPOC.
análisis de correlación
El análisis de correlación de la apoptosis de las células endoteliales con la función pulmonar y el índice de fumar.
El índice de apoptosis de las células endoteliales se correlacionó negativamente con el FEV
1 /FVC (
r = -0,796
,
P & lt; 0,001
) y el FEV
1 /Pre (
r = -0,827
,
P & lt; 0,001
) (Figura 8A & amp; 8B) y se correlacionó positivamente con el índice de tabaquismo (
r = 0,703
,
P & lt; 0,001
) (Figura 8C)
El diagrama de dispersión de análisis de correlación de endotelial. celular apoptótica y el FEV
1 /FVC (
r = -0,796
,
P Hotel & lt; 0,001) (panel A). El diagrama de dispersión de análisis de correlación de las células endoteliales índice apoptótico y el FEV
1 /Pre (
r = -0,827
,
P Hotel & lt; 0,001) (panel B). El diagrama de dispersión de análisis de correlación de las células endoteliales índice apoptótico y el índice de tabaquismo (
r = 0,703
,
P Hotel & lt; 0,001). (Panel C)
La análisis de correlación de proteínas mtTFA tejido pulmonar y el FEV
1 /Pre, el índice de tabaquismo, índice de células endoteliales apoptóticas.
la expresión de la proteína mtTFA del tejido pulmonar se correlacionó positivamente con el FEV
1 /Pre (
r = 0,892
,
P & lt; 0,001
) (Figura 9A), una correlación negativa con el índice de apoptosis de células endoteliales vasculares (
r = -0,749
,
P & lt;
0,001) y el índice de tabaquismo (
r = -0,763
,
P & lt; 0,001
) (Figura 9B & amp;. 9C)
El diagrama de dispersión de análisis de correlación de pulmón mtTFA proteínas del tejido y el FEV
1 /Pre (
r = 0,892
,
P Hotel & lt; 0,001) (panel A). El diagrama de dispersión de análisis de correlación de proteínas mtTFA tejido pulmonar y endoteliales índice apoptótico (
r = -0,749
,
P Hotel & lt; 0,001) (panel B). El diagrama de dispersión de análisis de correlación de proteínas mtTFA tejido pulmonar y el índice de tabaquismo (
r = -0,763
,
P Hotel & lt; 0,001). (Panel C)
discusión
en este estudio se encontró que la célula endotelial vascular índice de apoptosis en pacientes con EPOC fue mucho mayor en comparación con los pacientes sin la enfermedad, y se correlacionó negativamente con el FEV
1 /Pre, pero una correlación positiva con índice de fumar. Hemos demostrado que 1) la expresión de ARNm y proteínas mtTFA fue menor en el tejido pulmonar de pacientes con EPOC con cáncer de pulmón escamoso, en comparación con los pacientes con cáncer de pulmón escamosas sin EPOC; 2) la expresión de MTFA se correlacionó positivamente con el índice de apoptosis de células endoteliales vasculares; 3) pero se correlacionó negativamente con el índice de consumo de cigarrillos. También se encontró que el porcentaje de
mtTFA
la metilación del promotor fue mayor en el grupo con EPOC en comparación con el grupo sin EPOC.
La EPOC es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad crónica en el mundo, y tiene causado una considerable carga económica y social [23]. Varios mecanismos están implicados en la patogénesis de la enfermedad. Incluyen 1 infiltración inflamatoria); 2) desequilibrio entre la actividad proteolítica y anti-proteolítica; 3) el estrés oxidativo; y 4) desequilibrio apoptosis /proliferación [3]. Una de las consecuencias siguientes estos procesos es la apoptosis celular, un proceso complejo y bien regulado que conduce a la muerte celular. La presencia de un mayor nivel de apoptosis en el pulmón humano enfisematosa ha informado [24], [25]. Se ha propuesto que epitelial y la muerte de las células endoteliales debido a una disminución en los factores de mantenimiento de células pueden ser responsables para el desarrollo de enfisema. Consistente con esta noción, la EPOC se puede volver a producirse mediante la inducción de apoptosis endotelial pulmonar en modelos animales [26], [27]. Similar a estas observaciones, hemos encontrado un aumento del número de las células endoteliales pulmonares apoptóticas en los pacientes con EPOC en comparación con los pacientes sin EPOC. El índice apoptótico se correlacionó positivamente con el FEV
1 /Pre, FEV
1 /FVC y el índice de tabaquismo [6], [28]. Estos resultados indican que la apoptosis endotelial pulmonar puede desempeñar un papel importante en la patogénesis de la EPOC.
mtTFA es un factor importante la regulación de la biogénesis mitocondrial. Se activa la transcripción y replicación del ADN mitocondrial [29]. Desempeña un papel muy importante en la regulación de la respiración mitocondrial, el estrés oxidativo y anti-apoptosis de las células. estudio previo de Remels et al [11] sugiere que mtTFA podría estar implicada en la patogénesis de la EPOC. Hemos encontrado que la expresión de mtTFA ARNm y proteínas se redujo en los tejidos pulmonares de los pacientes con EPOC en comparación con pacientes sin EPOC. La expresión de mtTFA se correlacionó positivamente con el FEV
1 /Pre y FEV
1 /FVC, y una correlación negativa con el índice de tabaquismo y el índice de apoptosis de células endoteliales vasculares. De acuerdo con observaciones anteriores, nuestros resultados también sugieren un papel de mtTFA en la apoptosis de las células endoteliales pulmonares y en la patogénesis de la EPOC. Sin embargo, los mecanismos subyacentes responsables de esta son poco conocidos. Hay pruebas de que la epigenética pueden desempeñar un papel importante en la patogénesis de algunas enfermedades respiratorias como el asma y la EPOC [13]. Curiosamente, encontramos que el porcentaje de
mtTFA
promotor de la metilación en el tejido pulmonar de los pacientes con cáncer de pulmón de células escamosas con EPOC es mucho más alta en comparación con los pacientes con cáncer de pulmón de células escamosas sin EPOC, lo que sugiere la regulación epigenética puede ser responsable de la expresión de mtTFA.
EPOC y cáncer de pulmón son las dos principales causas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. Comparten un riesgo ambiental común en la exposición al humo de cigarrillos y una predisposición genética. El riesgo de cáncer de pulmón en los pacientes con EPOC se ha sugerido más de 30 años [30], y aunque la exposición al tabaco se mantiene como una variable de confusión importante, es probable que exista una asociación independiente. Punturieri et al [31] sugiere que el cáncer de pulmón y la EPOC podrían ser las dos caras de la misma moneda. Debido a que la metilación del ADN, la desacetilación de histonas, y la fosforilación de proteínas están implicadas en la patogénesis del cáncer de pulmón [32] - [34], se sugiere que las modificaciones epigenéticas también pueden atribuir a la patogénesis de la EPOC, ya sea solo o cuando se asocia con el cáncer de pulmón [ ,,,0],35], [36]. Demeo et al [14] encontró que el estado de metilación de ADN en distintos loci CpG se asoció con la presencia y gravedad de la EPOC y la función pulmonar, lo que sugiere que la metilación del ADN puede ser un marcador biológico de la EPOC y puede poner de relieve nuevas vías de patogénesis de la EPOC.
metilación aberrante de la región promotora de los oncogenes y genes supresores de tumores juega un papel importante en la patogénesis de cáncer de pulmón y el estado de metilación está estrechamente relacionado con el tabaquismo [37], [38]. Hay muchos carcinógenos en el humo del tabaco. Además, el humo de tabaco es un irritante de la mucosa que induce la inflamación, lo que resulta en la generación de radicales libres de oxígeno. Además, el fumar aumenta la actividad de metiltransferasa de ADN [39] que acciona el
de novo
hipermetilación de loci susceptible [40]. Estas interacciones directas o indirectas podrían estar implicados en la metilación del ADN mejorado en los fumadores pesados. Dos estudios recientes informaron alteraciones moleculares en el esputo espontáneo de grandes fumadores sin cáncer [41], [42]. Athough hay diferentes opiniones sobre el efecto de humo en la metilación del ADN [43] - [45].