Extracto
Fondo
S-propargil-cisteína (SPRC), un H
2S donante, es un análogo estructural de S-allycysteine (SAC). Fue investigado por su potencial efecto anti-cáncer en las células de cáncer gástrico SGC-7901 y los posibles mecanismos que pueden estar implicados.
métodos y las conclusiones
SPRC tratamiento disminuyó significativamente la viabilidad celular, suprimieron la proliferación y migración de células de cáncer gástrico SPRC-7901, era pro-apoptóticos así como causado la detención del ciclo celular en la fase G
1 /S. En un
in vivo
estudio, la inyección intra-peritoneal de 50 mg /kg y 100 mg /kg de SPRC redujo significativamente los pesos del tumor y los volúmenes tumorales de los implantes de cáncer gástrico en ratones desnudos, con una tasa de inhibición del crecimiento tumoral de 40 a 75%. SPRC también indujo un efecto pro-apoptótica en tejidos de cáncer y elevación de las expresiones de p53 y Bax en los tumores y las células. tratamiento SPRC también aumentó la expresión de proteínas de cistationina-γ-liasa (CSE) en las células y tumores, y elevó H
2S niveles en medios de cultivo celular, el plasma y la actividad CSE tumoral de ratones desnudos inducida por el cáncer gástrico por 2, 2.3 y 1,4 veces, respectivamente. La mayor parte de las funciones contra el cáncer de SPRC en las células y los tumores fueron suprimidos de manera significativa por PAG, un inhibidor de la actividad CSE.
Conclusiones
En su conjunto, los resultados de nuestro estudio proporciona una visión de una nuevo efecto anticancerígeno de H
2S, así como de SPRC sobre el cáncer gástrico a través de la inducción de la actividad de un nuevo objetivo, el CSE
Visto:. MA K, Liu y, Zhu Q, Liu Ch, Duan JL, Tan BK-H, et al. (2011) H
Donante 2S, S-propargil-cisteína, aumenta el CSE en SGC-7901 y ratones inducida-Cáncer: La evidencia de una novela de Lucha contra el Cáncer Efecto de Endógeno H
2S? PLoS ONE 6 (6): e20525. doi: 10.1371 /journal.pone.0020525
Editor: Zhang Lin, de la Universidad de Pennsylvania, Estados Unidos de América
Recibido: 15 Abril, 2011; Aceptado: 2 de mayo de 2011; Publicado: 27 Junio 2011
Derechos de Autor © 2011 MA et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Reconocemos la asistencia financiera proporcionada por una beca de la National Distinguido jóvenes científicos de Grant 385 (Nº 30888002) en china, el Proyecto Nacional 973 (2007CB512006 y 2010CB912600) y Shanghai-Unilever Investigación & amp; Fondo para el Desarrollo (08540750400).
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
S-propargil-cisteína (SPRC) es un análogo estructural de S-allycysteine (SAC ) con la misma estructura que contiene cisteína. SAC, uno de los principales compuestos en el extracto de ajo envejecido, se deriva de la degradación de
S
-alk (en) il sulfóxidos de cisteína (ACS). Este compuesto tiene propiedades anti-tumor [1], [2], anti-bacteriana [3], anti-hongos [4], anti-hepatotóxico [5], propiedades cardioprotectoras [6] y la apoptosis [7]. liposoma de paclitaxel, una formulación a base de lípidos de la droga contra el cáncer, paclitaxel, se ha convertido en un fármaco de primera línea para el tratamiento de cáncer de ovario refractario, mama, estómago y no pequeñas de cáncer de pulmón de células. Por ello, investigó el
in vitro
y
in vivo
efectos anticancerígenos de SPRC y los comparo con los de SAC y liposomas de paclitaxel.
cistationina-γ-liasa (CSE) es un miembro de la familia de enzimas trans-sulfuración y es responsable de catalizar la reacción de β-disulfuro dependiente de fosfato de piridoxal eliminación resulta en amonio, piruvato y thiocysteine. Thiocysteine puede entonces reaccionar con otros tioles para generar H
2S. La proteína supresora de tumores p53 desempeña un papel importante en la respuesta celular al daño del ADN y otras aberraciones genómicas. La activación de p53 puede conducir tanto a la detención del ciclo celular y la reparación del ADN o apoptosis. Bax es un componente clave en la apoptosis celular a través de estrés mitocondrial, mientras que Bcl-2 ejerce una función de supervivencia en respuesta a una amplia gama de estímulos de apoptosis a través de la inhibición de la liberación mitocondrial de citocromo c. Aquí, por primera vez, se encontró que los efectos anticancerígenos de la SPRC involucrados un sulfuro de hidrógeno (H
2S) vía mediada. SPRC puede someterse a β-eliminación por CSE para producir endógeno H
2S, que puede regular por incremento la expresión génica de p53 y Bax, lo que resulta en la supresión de la proliferación celular y la apoptosis. Así, nuestro estudio mostró una novela efecto anticancerígeno de la endógena H
donante 2S, SPRC, el cáncer gástrico a través de la inducción de la actividad de un nuevo objetivo, el CSE. Hemos demostrado por primera vez que SPRC fue capaz de suprimir la proliferación celular y la migración, y también el crecimiento del tumor en el modelo inducida por el cáncer gástrico de ratones desnudos, lo que indica que puede ser un agente potencial para el tratamiento del cáncer gástrico en humanos. Nuestros resultados muestran que los efectos anti-cáncer de SPRC se atribuyeron a la supresión de ciclo celular y la inducción de apoptosis. Además, nuestros resultados también mostraron que SPRC podría regular la expresión de genes de CSE, Bax y p53. Se encontró que el PAG, un inhibidor de la actividad de CSE, podría suprimir significativamente los efectos contra el cáncer de SPRC.
Resultados
dependiente de la dosis, inhibidor del crecimiento y la detección de los efectos citostáticos de SPRC en SGC- 7901 células
Efectos de SPRC en células de cáncer gástrico SGC-7901 se muestra en la Figura 1A, 1 uM y 10 uM SPRC producido inhibición 18-25% de viabilidad de las células SGC-7901. 20 mM a 30 mM SPRC causaron la inhibición de la viabilidad celular de 50%. También se encontró que SPRC a bajas concentraciones de 1 uM y 10 uM podría suprimir significativamente la formación de colonias y la capacidad de migración de SGC-7901; estos efectos fueron más significativos en comparación con el saco (figuras 1B, 1C y 1D). PAG, un inhibidor de CSE, bloqueó el efecto inhibidor de SPCR sobre el crecimiento celular (Figuras 1B y 1C). Estos resultados indicaron que la vía de CSE estuvo implicado en la supresión inducida por SPRC del crecimiento celular.
A. estudio de dosis-respuesta de los efectos de SPRC en la inhibición del crecimiento de las células SGC-7901. B. Efectos de la SPRC, SAC, Pag, Pag + SPRC y liposoma de paclitaxel sobre la viabilidad de las células SGC-7901. C. Efectos de SPRC, SAC, Pag, Pag + SPRC y liposoma de paclitaxel sobre la formación de colonias de células SGC-7901. D. Efectos de SPRC, SAC y liposoma de paclitaxel sobre la capacidad migración de las células SGC-7901. capacidad de migración celular diferencial se examinó por el ensayo de la herida cierre. E. Efectos de SPRC, SAC y de liposomas de paclitaxel de la velocidad de cierre de la herida. Los valores se expresan como% del control. * Representar una diferencia significativa entre el control vs. SPRC, SAC y los grupos de liposomas de paclitaxel (p & lt; 0,01).
#representa una diferencia significativa (p & lt; 0,01) entre SPRC vs grupo SPRC + PAG (p & lt; 0,01).
Los cambios morfológicos, la apoptosis y el ciclo celular análisis
La apoptosis [ ,,,0],21] se programa la muerte celular que se caracteriza por cambios estructurales específicas que incluyen encogimiento celular, la condensación nuclear y la fragmentación del ADN. Hoechst tinción se utilizó para observar los cambios morfológicos de las células tratadas con paclitaxel en liposomas, SPRC y SAC. Como se muestra en la Figura 2A, la microscopía electrónica reveló que los cambios morfológicos característicos de la apoptosis se produjeron en células SGC-7901 después del tratamiento con SPRC ed durante 24 horas. Las células mostraron un patrón de tinción densa con la fragmentación del ADN y la ausencia de membranas nucleares distintos. Las células de control no mostraron cambios morfológicos similares. Inductor de apoptosis efectos de SPRC se evaluaron por citometría de flujo (Figura 2B); tratamiento de 24 horas de las células SGC-7901 con 10 uM SPRC resultó en un aumento significativo de alrededor de 26% de los cuerpos apoptóticos, en comparación con el grupo control. En comparación, el porcentaje de células apoptóticas en liposomas de paclitaxel y grupos tratados con SAC eran menos en aproximadamente un 8% y 4%, respectivamente.
A. tratamiento con SPRC, SAC, PAG, PAG + SPRC y liposoma de paclitaxel (10 uM) en 24 h para la determinación de cambios apoptóticos analizadas en un microscopio de fluorescencia. B. Análisis de células apoptóticas mediante ensayo de citometría de flujo. la distribución del ciclo celular C. Marcadores en las imágenes indican: 1, de control. 2, SPRC 10 uM. 3. SAC 10 uM. 4. PAG 10 uM. 5. SPRC + PAG, cada 10 uM. 6. liposomas de paclitaxel de 10 uM.
El efecto de SPRC en la actividad del ciclo celular de las células SGC-7901 se analizó mediante la realización de tinción con yoduro de propidio seguido de la detección con citometría de flujo. De acuerdo con su efecto sobre la inhibición del crecimiento celular, SPRC inducida por la detención del ciclo celular en las células SGC-7901 en G fase
1 /S (Figura 2C). 10 uM SPRC también resultó en un aumento de la acumulación de 24% de las células en el G
1 fase y redujo 20% de las células en la fase S del ciclo celular, en comparación con el grupo control. Esto sugiere que hay un bloqueo en el G
S transición 1 /fase, que puede causar la supresión del crecimiento celular o apoptosis. El efecto pro-apoptótica de SPRC, así como su efecto de la detención del ciclo celular en G
1 fase /S fue también inhibió en gran medida por PAG.
Efectos de SPRC sobre la expresión de la proteína y la actividad CSE y H
niveles 2S
Las expresiones de proteína en las células CSE SGC-7901 (Figuras 3A, B y C) y tumores en ratones desnudos (Figuras 3 D, e y F) se incrementaron significativamente por el tratamiento SPRC. SPRC a dosis de 50 mg /kg y 100 mg /kg aumentó significativamente la actividad de CSE en alrededor de 1,4 veces (Figura 3G). actividad CSE en los tumores de los ratones desnudos tratados-SPRC fue mayor que en los tejidos del grupo SAC-tratada. H
niveles 2S en medios de cultivo celular (Figura 3H), se midieron en plasma de ratones desnudos (Figura 3I). El H
ratones desnudos nivel 2S en el medio de cultivo celular de 10 células tratadas con SPRC uM y el plasma H
2S de 50 mg /kg y 100 mg /Teñidos SPRC kg fueron también aumentó significativamente en comparación con el grupo control (P & lt; 0,05). En comparación con el grupo tratado con SAC de los ratones, el grupo tratado con SPRC tenía significativamente más alta H
2S nivel (P & lt; 0,05). Los niveles elevados de expresión de la proteína CSE, la actividad CSE y H
2S en el grupo tratado con SPRC se redujeron todos en gran medida por tratamiento PAG. Los resultados de estos experimentos por lo tanto sugieren que el efecto contra el cáncer de SPRC estaba mediada por la activación del /H
2S vía CSE
Para A, carril 1, el grupo de control.; Carril 2, liposoma de paclitaxel 10 uM; Carril 3, SPRC 1 uM; Carril 4, SPRC 10 uM; Carril 5, SAC 10 uM; Carril 6, el grupo de control; Carril 7, SPRC 10 uM; Carril 8, PAG 10 uM; Carril 9, PAG + SPRC 10 uM. Por D: carril 1, el control; Carril 2, liposoma de paclitaxel 10 mg /kg; Carril 3, SPRC 50 mg /kg; Carril 4, SPRC 100 mg /kg; Carril 5, SAC 100 mg /kg; Carril 6, control; Carril 7, SPRC 100 mg /kg; Carril 8, PAG 100 mg /kg; Carril 9, PAG + SPRC 100 mg /kg. La intensidad relativa se calcula mediante la comparación con la intensidad de la GAPDH utilizando densitometría (se muestra en los gráficos de la derecha). * Representan una diferencia significativa entre el control vs. SPRC, SAC y de liposomas de paclitaxel grupos tratados (p & lt; 0,05).
#representa una diferencia significativa entre SPRC 10 uM frente a grupo SPRC + PAG. La figura muestra la actividad de G CSE (mmol /g) en el cáncer gástrico de todos los grupos. La figura muestra H H
niveles 2S (M) en medios de cultivo celular. Figura muestro plasma H
2S niveles en los tumores gástricos de ratones desnudos de los diferentes grupos.
Efectos de SPRC y el SAC sobre las expresiones de genes de Bax, p53 y Bcl-2
El efecto de supresión del crecimiento de células en SPRC SGC-7901 se evaluó para analizar los efectos sobre la actividad del ciclo celular y la expresión de los genes reguladores de la apoptosis - Bax, p53 y Bcl-2. Como se muestra en la figura 4A y 4B, se encontró que el tratamiento de 24 horas SPRC aumentó significativamente el nivel de mRNA (aproximadamente 1,5 veces) y el nivel de proteína de p53 y Bax de células SGC-7901.
A. Carril 1, liposoma de paclitaxel 10 uM; Carril 2, control; Carril 3, SPRC 10 uM; Carril 4, SPRC 1 uM; Carril 5, SAC 10 uM; Carril 6, SAC 1 uM. La intensidad relativa se calcula mediante la comparación con la intensidad de la β-actina utilizando densitometría (se muestra en los gráficos de la derecha). B. Cuantificación de Bax, p53 y la expresión del ARNm de Bcl-2. * Representar importancia significativa entre el control vs SPRC, SAC y liposoma de paclitaxel en p & lt; 0,05
Supresión del crecimiento [22] y la inducción de la apoptosis de las células en los tumores por SPRC
El desarrollo. de cáncer gástrico evaluadas por el volumen del tumor se redujo significativamente por el tratamiento SPRC de 50 mg /kg y 100 mg /kg de peso cada dos días tres veces a la semana con un IR de 40 a 75% (Figura 5A y 5B). El peso del tumor también se redujo significativamente en los grupos tratados con SPRC (Figuras 5C) mientras que el tratamiento PAG disminuyó significativamente la función de supresión de crecimiento de SPRC. Los tumores representativos de diferentes grupos mostraron el cambio del tamaño del tumor evidente (Figuras 5D y 5E).
A. Cambio en el volumen medio del tumor (mm
3). B. Tasa de inhibición (IR) sobre el crecimiento tumoral en diferentes días. C. Cambio en el peso del tumor. D. Cambio en el tamaño del tumor. E.
En vivo
tumor de imágenes de ratones desnudos después del tratamiento durante 24 días. * Representar una diferencia significativa (p & lt; 0,05) entre el control vs. SPRC, SAC y de liposomas de paclitaxel grupos tratados.
#represents diferencia significativa (p & lt; 0,05) entre SPRC 100 mg /kg vs. SPRC + PAG y PAG grupos tratados. SE el señor F. tinción con amplificación de 4 × 10 y las grandes imágenes amplificado (100 × 10) en la esquina derecha. tinción G. túnel (100 × 10) de los cuerpos apoptóticos de tumores gástricos. marcadores de número de imágenes indican: 1, grupo de control; 2, de liposomas de paclitaxel 10 mg /kg de grupo; 3, SPRC 50 mg /kg de grupo; 4, SPRC 100 mg /kg de grupo; 5, SAC 100 mg /kg de grupo.
También examinaron si la inhibición del crecimiento tumoral por SPRC se reflejó en la apoptosis de las células tumorales. H & amp; E tinción reveló (Figura 5F) de las células tumorales más apoptótica en liposomas de paclitaxel y los grupos tratados con SPRC. TUNEL tinción mostró que los tumores de los ratones tratados con SPRC tenían un recuento notablemente mayor de cuerpos apoptóticos en comparación con los tumores de control (Figura 5G). El aumento de la incidencia de la apoptosis en los tumores fue de conformidad con el efecto de inhibición del crecimiento tumoral por SPRC, lo que sugiere que SPRC ejerció inhibición del crecimiento tumoral en parte por el aumento de la apoptosis en los tumores.
Efectos de SPRC y SAC en la proteínas y mRNA expresiones [23] de Bax, p53 y Bcl-2
El efecto de supresión de SPRC sobre el cáncer gástrico fue evaluado por Bax, p53 y Bcl-2. Este efecto de la SPRC también se confirmó en ratones desnudos inducida por el cáncer gástrico como se muestra en las figuras 6A y 6B. La proteína y los niveles de ARNm de Bax y p53 en los tumores tratados con SPRC aumentaron significativamente mientras que las de Bcl-2 se redujeron, en comparación con los tumores de control. La localización y la cantidad de estas tres proteínas en los tejidos tumorales también se identificaron mediante inmunotinción. Como se muestra en las Figuras 6C y 6D, no inmunotinción obvio de las proteínas pro-apoptóticas, Bax y p53, se observó en el grupo de control mientras que se observó una fuerte señal de inmunorreactividad en los grupos tratados con liposomas SPRC- y paclitaxel. Se detectó una tinción muy débilmente positiva para la proteína anti-apoptótica Bcl-2, en SPRC-, paclitaxel en liposomas y los grupos tratados con SAC en la figura 6E. Estos resultados demostraron que SPRC es capaz de regular la expresión de genes de Bax, p53 y Bcl-2 en dirección a la apoptosis celular.
A. expresión de la proteína, Lane 1 control; Carril 2 de liposomas de paclitaxel 10 mg /kg; Carril 3 SPRC 50 mg /kg; Carril 4, SPRC 100 mg /kg; Carril 5, SAC 100 mg /kg. La intensidad relativa se calculó comparando con la intensidad de la β-actina usando densitometría. B. expresión mRNA. * Representar significación estadística entre el control vs SPRC, SAC y liposomas paclitaxel grupos tratados (p & lt; 0,05). C. La tinción inmunohistoquímica de la proteína pro-apoptótica Bax. D. tinción inmunohistoquímica de la proteína pro-apoptótica, p53. E. tinción inmunohistoquímica de la proteína pro-apoptótica Bcl-2. marcadores de número en imágenes de la Figura 6 C, D y E indican: 1, grupo de control; 2, de liposomas de paclitaxel 10 mg /kg; 3, SPRC 50 mg /kg; 4, SPRC 100 mg /kg; 5, SAC 100 mg /kg.
H
2S demostraron pro-apoptosis y anti efecto de proliferación de células SGC-7901 y modelo de cáncer gástrico de los ratones desnudos
encontró que el aumento de la actividad SPRC CSE y que está provocando un elevado H
2S niveles, que a su vez modula la expresión de los genes de Bax, p53 y Bcl2. Bax se induce la apoptosis directamente mitocondrias impulsada mediante una mayor expresión de MT y la disminución de la expresión de Bcl-2. La proteína supresora de tumores p53 desempeña un papel importante en la respuesta celular al daño del ADN y otras aberraciones genómicas. La activación de p53 conduce a la inhibición ya sea de la proliferación celular y el daño del ADN o la apoptosis a través de la proteína Bax en la Figura 7. Estos resultados sugieren un nuevo mecanismo para los efectos contra el cáncer de SPRC través de CSE /H
2S inducida por la inhibición del crecimiento celular y la apoptosis a través de la p53 /Bax vía.
los aumentar los niveles de H2S se han convertido modula Bax, p53 y la proteína Bcl2 y la expresión del ARNm. Bax ha inducido la apoptosis a través de Mt y Bcl-2 expresión. p53 conduce a cualquiera de inhibición de la proliferación celular y la apoptosis o daño en el ADN a través de la proteína Bax.
Discusión
En este estudio, hemos demostrado un efecto novedoso contra el cáncer de SPRC sobre el cáncer gástrico y también proporcionó datos para sugerir su posible mecanismo. Varios de los nuevos puntos se generan a partir de nuestro estudio. En primer lugar, hemos demostrado que SPRC fue capaz de reducir la capacidad de crecimiento de las células de manera significativa y también suprimir la migración de las células SGC-7901. En segundo lugar, se encontró que SPRC fue capaz de aumentar los cambios morfológicos relacionados con la apoptosis inducida y un gran aumento en el porcentaje de células apoptóticas simultáneamente con una detención del ciclo celular en G obvia
fase 1 /S. En conjunto, estos hallazgos apoyan dos pruebas de un efecto inhibidor de SPRC en células SGC-7901. En tercer lugar, hemos demostrado, además, que la administración intra-peritoneal de SPRC a dosis de 50 y 100 mg /kg de peso corporal cada dos días, tres veces a la semana fue eficaz en la inhibición del crecimiento de tumores gástricos en ratones desnudos. En cuarto lugar, se encontró que SPRC podría aumentar la actividad CSE y también su expresión de la proteína resultante en elevada H
niveles 2S en medios de cultivo de células y el plasma de ratones desnudos. En quinto lugar, se encontró que PAG, un inhibidor de la CSE, podría suprimir en gran medida las funciones anteriores de SPRC. En sexto lugar, se encontró que el tratamiento SPRC causada elevación evidente de mRNA y las expresiones de proteínas de Bax y p53.
Se ha informado de que H
2S [24], [25], [26] puede ser generada en células de cáncer gástrico por la enzima piridoxal-5-fosfato dependiente de CSE, para el que la L-cisteína es el sustrato. CSE [27] podría catalizar piridoxal fosfato dependiente de la β-disulfuro y reacción de eliminación, lo que resulta en la formación de amonio, piruvato y thiocysteine. Thiocysteine entonces reacciona con otros tioles para formar H
2S. PAG se ha utilizado en varios estudios para evaluar el efecto biológico de la inhibición endógena H
2S producción [28] SPRC, un análogo de la SAC tiene la estructura que contiene cisteína, que puede someterse a β-eliminación y servir como un sustrato de CSE. El grupo propargilo clave en SPRC puede contribuir, junto con los sitios de actividad de CSE para aumentar la actividad CSE. En nuestro estudio, se observó evidente aumento de la expresión de la proteína CSE en células de cáncer gástrico y tumores de ratones desnudos en el grupo tratado con SPRC; esto podría explicarse como un "efecto compensatorio" para producir H
2S hacer frente a la apoptosis de las células cancerosas. fibroblastos de pulmón humano tratado por el H
2S donante, NaHS, muestran un aumento en el daño del ADN, la detención del ciclo celular y la estabilización de p53, junto con la inducción de proteínas aguas abajo tales como p21, Bax y citocromo c [29]. Se ha informado de que el tratamiento de las células acinares pancreáticas por H
2S se ha demostrado que induce la apoptosis, que resulta de la activación de la caspasa 3, la disminución de nivel de proteína de Bcl-2 y la activación de la expresión de Bax. H
2S también podría inducir la apoptosis de las células beta secretoras de insulina mediante la mejora de estrés ER a través de la activación de p38 MAPK [30]. Se informó de que p53 induce la apoptosis, ya sea aumentando la actividad transcripcional de genes pro-apoptóticos, tales como Bax o la supresión de la actividad del gen anti-apoptótica de Bcl-2 familia [31], [32]. Bax también se sabe que inducen apoptosis mitocondrias impulsada. Aquí también encontramos que la activación de la ESC e incrementamos H
2S niveles de tratamiento SPRC se acoplaron con p53 elevada y expresiones Bax en las células gástricas y tumores. Estos resultados sugieren un nuevo mecanismo para los efectos anticancerígenos de la SPRC vía CSE /H
2S-inducida por la inhibición del crecimiento celular y la apoptosis a través de la p53 /vía Bax.
En conclusión, nuestro
in vitro
y
in vivo
resultados experimentales demuestran que el donante sulfuro de hidrógeno, SPRC, tuvo efectos inhibitorios y pro-apoptóticos obvias sobre el cáncer gástrico. SPRC podría aumentar la actividad CSE, lo que resulta en un mayor nivel de H
2S, que a su vez modula la expresión de los genes de Bax, p53 y Bcl2.
Métodos
Todos los protocolos experimentales con animales cumplen las Normas de Gestión de animales de las autoridades locales y 'Cuidado y uso de los Animales de laboratorio "del Centro de Experimentación Animal de la Universidad de Fudan, Shanghai, República Popular China.
Detalles de la aprobación del estudio por el comité de ética
Animal Calificación Certificado No .: SCXK hu (Shanghai) 2009 a 0019
aprobación de Estudio No .: Departamento de Investigación de la Universidad de Fudan Experimental Animal, aprobación nº SYXK hu (Shanghai) 2.009-0.082
Named junta de revisión: Presidente: Prof. Yi-zhun ZHU Decano de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Fudan. Vicepresidente: Prof. Weiyue Lu, profesor Wei Wu, profesor Sun Xun, el profesor Zhou Wenjiang
Miembros: Prof. Zhang Yun Yi, profesor Li Cong, prof. Jiang Chen, profesor Yin Li Geng, el Prof. Hong Mei Ji, profesor Li Xu Yang
Secretario:. Tao Lin lin
Químicos
SPRC se sintetizó por reacción de L-cisteína con bromuro de propargilo. El producto se purificó por recristalización a partir de etanol-agua. El producto final se verificó mediante espectroscopia de resonancia magnética nuclear 1H. SAC se adquirió de Tokyo Kasei (Tokyo, Japón). liposoma de paclitaxel fue un regalo de Luye Pharma Group Ltd., de Singapur. Propargilglicina (PAG) se adquirió de Yinzheng química CO., LTD (Shanghai, China). MTT (bromuro de dimetil tiazolilo tetrazolio) se adquirió de AMRESCO Inc. EE.UU.. tinción de Hoechst, ciclo celular y la apoptosis kits de análisis fueron adquiridos de Beyotime, China. RPMI 1640 se adquirieron de GIBCO ™ Invitrogen, EE.UU.. Anticuerpos policlonales de conejo a Bax, p53 y Bcl2 se adquirieron de Cell Signaling, EE.UU. y el anticuerpo policlonal de cabra a CSE de Santa Cruz, EE.UU.. Superíndice II kit de RT y SYBR Green PCR Master Mix se adquirieron de Takara, Japón. kit de tinción túnel se adquirió de Calbiochem, Alemania.
Línea celular y la cultura
carcinoma gástrico humano células (SGC-7901) se obtuvieron a partir de la célula Banco de Shanghai Instituto de Ciencias Biológicas, China y cultivada en medio RPMI 1640 con 10% de suero bovino fetal (FBS), penicilina 100 U /ml y 100 mg /ml de estreptomicina en matraces de cultivo a 37 ° C en 5% humidificado de CO
2 incubadora. Las células se alimentaron hasta confluencia y se expandieron por tripsinización y se subcultivaron en proporción más reducida en nuevos frascos de cultivo.
MTT ensayo
MTT (3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il ) -2, bromuro) de ensayo 5-difeniltetrazolio se realizó utilizando el método de Arumugam et al. [8], con ligeras modificaciones. En resumen, se añadieron células en suspensión que contiene aproximadamente 8.000 a 10.000 células a cada pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos y se incubaron durante 24 horas a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 95% de aire y 5% de CO
2. SPRC, SAC y de liposomas de paclitaxel se disolvieron en medio de cultivo y se añadieron a las células en placas de 96 pocillos. 10 concentraciones finales de SPRC (1 uM, 10 uM, 100 uM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM y 30 mM), SAC (1 uM y 10 uM) y de liposomas de paclitaxel (10 uM) se añadieron a las células para estudiar sus efectos sobre la viabilidad celular. También se estudió el efecto del tratamiento combinado de 10 uM y 10 uM SPRC PAG. Después de 24 horas, 100 l de 1 mg /ml solución de MTT se añadió a cada pocillo y re-incubación siguió durante 4 horas. entonces 100 l de DMSO se añadió después de la eliminación de la solución de MTT y las placas se agitaron durante 10 minutos. La densidad óptica de placas de cultivo de 96 pocillos se midió usando un lector de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Las densidades ópticas de los pocillos tratados se convierten en un porcentaje de células vivas ( "tasa de supervivencia de las células") contra el control utilizando la siguiente fórmula: experimento
Colonia-ensayo de formación de
formación de colonias era realizado de acuerdo con el método de Wang et al. (1998, 2003) [9], [10]. La suspensión de células individuales se produjo y se cultivaron en placas de 12 pocillos a una densidad de 150 células por pocillo. Después de 24 horas de la siembra, se añadieron 2 concentraciones de SPRC (10 uM, 1 M) y SAC (10 um, 1 uM). También se estudió un experimento con el tratamiento combinado de 10 uM y 10 uM SPRC PAG. Las células se incubaron durante 6 días. Las células fueron fijadas en etanol al 70% y se tiñeron con 1% Giemsa azul. Las colonias que consistían en & gt; 50 células se marcaron y se compararon con el grupo control normal. Cada experimento se repitió tres veces.
Hoechst ensayo de tinción
apoptosis [11], [12] se determinó utilizando un kit de tinción Hoechst (Beyotime). células SGC-7901 fueron tratados con SPRC (10 uM), SAC (10 Um), liposoma de paclitaxel (10 uM) y combinado SPRC y PAG (cada 10 uM) durante 24 horas. Las células se lavaron dos veces en PBS y después se fijaron durante 10 minutos a 4 ° C y luego se tiñeron mediante colorante karyophilic, Hoechst 33258, durante 5 minutos. Después de un aclarado final en PBS, las células se montaron en moiwol, un agente anti-fade, y se visualizaron bajo luz ultravioleta con un microscopio de fluorescencia. Debido a que este colorante manchas tanto de células apoptóticas y no apoptóticas, se identificaron células apoptóticas como los que presentan la condensación de cromatina y fragmentación nuclear.
análisis citométrico de flujo de la distribución de fase del ciclo celular y la detección de apoptosis
Todo células se sembraron primero a una densidad de 2,5 x 10
placas 5 células /pocillo en 6 pocillos. Después de incubar con SPRC, SAC, liposoma de paclitaxel y el tratamiento combinado SPRC y PAG durante 24 horas, se separaron las células y se recogieron en tubos de citometría de flujo y se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 min para obtener un sedimento celular.
Apoptosis ensayo
las células se tiñeron usando el kit de detección de apoptosis de las células (Beyotime) según las instrucciones del fabricante. El sedimento celular se lavó dos veces con PBS. 1 × tampón de unión se añadió a 1 × 10
6 células /ml, y después se añadió PI en la oscuridad. Después de incubación durante 30 min en la oscuridad, las células se analizaron inmediatamente usando flujo Cyan citómetro (BD FACSCalibur) y el software ModFit.
análisis del ciclo celular
análisis del ciclo celular se realizó por el método de Herman-Antosiewicz et al [13]. Brevemente, las células se incubaron en medio de cultivo solo y medio de cultivo que contiene SPRC, SAC y liposoma de paclitaxel (10 uM) a 37 ° C durante 24 h. Las células se lavaron por PBS frío, se fijaron en 70% de etanol, y se almacenaron a 4 ° C para el análisis del ciclo celular subsiguiente. Las células fijadas se lavaron con PBS una vez, luego se resuspendieron en 1 ml de reactivo de tinción PI (50 mg /ml de yoduro de propidio y 1 mg /ml de ARNasa en 1 ml de tampón de citrato de sodio, pH 7,4). Las muestras se incubaron en la oscuridad durante 30 min antes del análisis del ciclo celular. La distribución de las células en el ciclo celular se midió por el flujo de Cyan citómetro de sistema (BD FACSCalibur) el análisis y la cuantificación de la distribución del ciclo celular se realizó usando Multi-ciclo Software (software ModFit). El porcentaje de células en G1, S y G2 fases se calcularon.
cicatrización de heridas ensayo
Las células se sembraron en placas de cultivo de 6 pocillos y se dejaron crecer hasta 90% de confluencia. Se introdujeron las heridas de tamaño similar a la monocapa de células utilizando puntas de pipeta estériles. monocapa de células heridos se lavaron 3 veces por PBS para eliminar los restos celulares; SPRC y SAC se añadieron a continuación a dos concentraciones (1 uM, 10 uM) y de liposomas de paclitaxel (10 uM). La velocidad de cierre de la herida se controló y se fotografió después de 12 y 24 horas. La velocidad comparativo de cierre de la herida de las células tratadas contra el control se calculó usando la siguiente fórmula: (el ancho de la herida de las células tratadas en 0 horas - la anchura de la herida a las 24 horas) /(el ancho de la herida de las células de control en 0 horas - la anchura de la herida a las 24 horas) x 100.
cuantitativa en tiempo real PCR
el ARN total se transcribió de forma inversa utilizando un kit Superscript II RT (Takara, Japón) cebado con oligo (dT). Expresiones de Bcl2, Bax y ARNm de p53 fueron examinados por PCR en tiempo real con el primer paso del sistema de PCR (Applied Biosystems). Se añadió 2 ul de producto de ADNc transcrito inverso en una mezcla de reacción que contiene 20 ul 10 ul SYBR Premix EX Taq (2 ×), 0,4 ul ROX referencia Tinte (50 ×), 0,4 uM de cebador directo y cebador 0,4 uM recompensa. Las condiciones de los ciclos eran las siguientes: pre-incubación a 95 ° C durante 30 s, seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 5 s, recocido y extensión a 60 ° C durante 31 s. A la terminación del ciclo, se realizó análisis de la curva de fusión para establecer la especificidad del producto de PCR. El valor cuantitativo con respecto fue expresada por el
método ΔΔC T. Control se utilizó como la muestra de referencia y se utilizó ß-actina como control endógeno. Cada experimento se realizó por duplicado y se repitió tres veces. Las secuencias de los cebadores y el tamaño del producto esperado fueron los siguientes: β-actina humana: adelante, 5'-CGTGGACATCCGCAAAG-3 'y revertir, 5'-TGGAAGGTGGACAGCGA-3' (201 pb); Bax humana: adelante, 5'-ATGCGTCCACCAAGAAGC-3 'y revertir, 5'-GTCCACGGCGGCAATCA-3' (95 pb); BCL2 humano: adelante, 5'-AACTGGGGGAGGATTGTG-3 'y revertir, 5'-AGGTGCCGGTTCAGGTAC-3' (128 pb); p53 humana:. adelante, 5'-ACCACCATCCACTACAACTA-3 'y revertir, 5'-AAACACGCACCTCAAAGC-3' (136 pb)
Western blot
Las células se sembraron a los platos y tratados con SPRC (1 uM, 10 uM), SAC (1 uM, 10 uM) y de liposomas de paclitaxel (10 uM) durante 24 horas. Después de 24 horas de tratamiento, las células se lavaron dos veces con PBS frío. Las células de cada muestra se solubilizaron en tampón RIPA (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), NaCl 150 mM, 1% de NP40, 0,1% de SDS, desoxicolato de sodio 10 mM, 1 mM fenilmetil-sulfonilfluoruro) y se mantuvieron en hielo durante 30 minutos. Células lisados se centrifugaron a 10.000 g a 4 ° C durante 10 min y los sobrenadantes se almacenaron a -70 ° C hasta el ensayo. La concentración de proteína se midió por el método de Bradford. 25
l
proteína para cada grupo de mezclado con 5
l
tampón de carga fueron separados por 10% de gel de SDS-polyacrylamine y transferidos a membranas de fluoruro de polivinilideno [14]. Las membranas fueron bloqueadas durante 2 horas en 5% de leche en polvo desnatada en solución salina Tris-tampón que contiene 0,05% de Tween 20 (TBST) a temperatura ambiente. Las transferencias resultantes se probaron con policlonal CHT (γ-liasa cistationina) /CSE Ab (1:500, Santa Cruz, EE.UU.), Bcl-2 policlonal Ab (1: 1000, la señalización celular, EE.UU.), Bax policlonal Ab (1