Extracto
El receptor de andrógenos (AR) se expresa en un subconjunto de las células del estroma de la próstata y células del estroma AR funcional se requiere para el desarrollo normal de la próstata e influye en el crecimiento de los tumores de próstata. Aunque somos conscientes en general de las características específicas de las acciones genómicas de AR en células de cáncer de próstata, se sabe relativamente poco acerca de los genes diana de AR funcional en las células del estroma de la próstata. Aquí, se describe un nuevo modelo de células del estroma de próstata humana que nos permitió estudiar los efectos de la AR sobre la expresión génica en estas células. El modelo consiste en una variante manipulada genéticamente de las células del estroma WPMY-1 de próstata humanas inmortalizadas que sobreexpresa AR de tipo salvaje (WPMY-AR) a un nivel comparable a las células LNCaP, y es sensible a dihidrotestosterona (DHT) estimulación. El uso de células WPMY-AR para perfiles de expresión génica mostró que la presencia de AR, incluso en ausencia de DHT, altera significativamente el patrón de expresión génica de las células en comparación con el control de células (WPMY-Vec). El tratamiento de células WPMY-AR, pero no las células de control WPMY-Vec, con DHT resultó en más cambios que afectan a la expresión de 141 genes por 2 veces o más en comparación con las células WPMY-AR tratados con vehículo. Sorprendentemente, la DHT downregulated significativamente más genes que se upregulated pero muchos de estos cambios invierte los efectos iniciales de la sobreexpresión AR solo en los genes individuales. Los genes más altamente realizadas por el tratamiento DHT se clasificaron en base a su papel en cáncer de las vías o en vías de señalización celular (factor de crecimiento transformante-β, Wnt, erizo y MAP quinasa) se cree que participan en la diafonía estromal-epitelial durante la próstata o el cáncer de próstata desarrollo. DHT tratamiento de las células WPMY-AR también era suficiente para alterar su potencial paracrina de las células de cáncer de próstata como medio condicionado de WPMY-AR aumentado significativamente el crecimiento DHT tratados de células LNCaP en comparación con WPMY-Vec medio condicionado de células tratadas con DHT.
Visto: Tanner MJ, Welliver RC Jr, Chen M, Shtutman M, Godoy A, Smith G, et al. (2011) Efectos del receptor de andrógenos y andrógenos sobre la expresión génica en la próstata estroma fibroblastos y paracrina de señalización de las células del cáncer de próstata. PLoS ONE 6 (1): e16027. doi: 10.1371 /journal.pone.0016027
Editor: Paraskevi Giannakakou, Weill Cornell Medical College de la Universidad de Cornell, Estados Unidos de América
Recibido: 12 Octubre, 2010; Aceptó 2 de diciembre de 2010; Publicado: 18 Enero 2011
Derechos de Autor © 2011 Tanner et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por la Fundación Equinox y la Fundación de Investigación médica de Albany, Nueva York. MT era un americano Urological Association (URA) Research Foundation Fellow. MC AG y son receptores de Departamento de Defensa (DoD) Programa de Investigación de Cáncer de Próstata (PCRP) becas de investigación postdoctorales (W81XWH-10-100125 [MC] y W81XWH-09-1-0330 [a AG]). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La glándula de la próstata requiere esteroides androgénicos para el desarrollo, el mantenimiento de adultos y la función. Los machos con inactivación de las mutaciones en los genes clave necesarios para el metabolismo de andrógenos se desarrollan sólo una glándula de próstata rudimentaria [1] y los machos con inactivación de las mutaciones en el gen (AR) del receptor de andrógenos, que media los efectos de los andrógenos, no desarrollan próstatas [2]. Los andrógenos y la acción AR también juegan un papel importante en la carcinogénesis de la próstata. Los fármacos que inhiben la biosíntesis de andrógenos tienen efectos quimiopreventivos que reducen significativamente el riesgo de desarrollar cáncer de próstata en los hombres [3] y las terapias de ablación de andrógenos constituyen el medio más útil clínicamente para el control de enfermedades paliativa cuando se detecta el cáncer de próstata en la etapa avanzada [4]. Estos hechos clínicos identificar la relevancia de señalización para la biología de la próstata y los esfuerzos de la carcinogénesis y de investigación de accionamiento para caracterizar las consecuencias de la señalización de andrógenos en células de próstata andrógeno.
Dado que la proteína de AR es un miembro extendido del factor de transcripción nuclear que condicionalmente regula la expresión de genes [5], es razonable esperar que la disponibilidad de un catálogo completo de los genes regulados por andrógenos en células de la próstata podría contribuir significativamente a nuestro conocimiento de la acción de los andrógenos en la próstata. Con este fin, el uso de la expresión génica de masas contemporánea de perfiles de la tecnología, especialmente la participación de microarrays de genes en Chips, ya ha ampliado en gran medida la lista de genes regulados de andrógenos conocidos en las células de cáncer de próstata [6] - [9]. Los estudios que utilizan este enfoque han apoyado la eventual identificación de nuevas anomalías genéticas (reordenamientos del gen ETS) [10] - [12] y han ayudado a identificar vías de señalización anormal activos en células de cáncer de próstata [13], [14] que tiene el potencial de traslación de mejorar las estrategias de diagnóstico o tratamiento de cáncer de próstata. Este tipo de tecnología, sin embargo, aún no se ha utilizado para caracterizar andrógenos efectos /AR sobre la expresión génica en las células del estroma de próstata, a pesar de la amplia evidencia de que las células del estroma de próstata participan activamente en los procesos mediante los cuales los andrógenos regular el desarrollo normal o maligna de próstata [15] - [19]. La razón principal de este déficit es la falta de modelos humanos cultivados adecuadas del estroma de próstata de células que expresan la proteína de forma robusta y AR son demostrablemente sensible a la presencia de andrógenos como se indica por los cambios en la expresión génica cuando se cultivan en un medio que contiene andrógenos. A continuación, describimos nuestra experiencia en la prueba de algunos modelos de células del estroma disponibles (benignos) de próstata humanos por su capacidad de respuesta a los andrógenos
in vitro Opiniones y en el desarrollo de un modelo de células estromales de próstata humano sensible a los andrógenos específicas (células WPMY-AR) que fue perfilado para AR y cambios inducidos por andrógenos en la expresión génica mediante microarrays chip genético humano. Por otra parte, hemos utilizado este sistema de células de modelo para probar la idea de que los andrógenos alterar el entorno de señalización paracrina de un tumor de próstata que afecta la producción de factores secretados por los fibroblastos del estroma de la próstata.
Resultados
Receptor de andrógenos expresión y actividad en las células del estroma de próstata humana cultivadas
Dos líneas de células del estroma disponibles inmortalizadas de próstata humano, miofibroblastos de células del estroma no inmortalizado próstata humana primaria PS-30 y WPMY-1, y se evaluaron para la expresión AR y capacidad de respuesta a andrógenos. Ninguna de estas células requieren andrógeno para
in vitro
crecimiento, sin embargo, se informó anteriormente células WPMY-1 a crecer ligeramente más rápido en presencia de andrógeno sintético, R1881 [20]. expresión AR se evaluó en estas células por RT-PCR cuantitativa (qPCR) y los procedimientos de transferencia de Western y se comparó con cultivos de fibroblastos primarios humanos del estroma de la próstata (PRSC) y a células de cáncer de próstata LNCaP que son modelos para la acción AR en el cáncer de próstata (Figura 1A ). De los encuestados células, las células LNCaP expresan los más altos niveles de ARNm de AR. AR ARNm se expresó en sólo el 3,4% de este nivel en las células PS30, un 1,1% en PRSC y en poco más de 0,1% de este nivel en las células WPMY-1. Este patrón fue consistente con nuestros datos de Western blot, donde no hemos podido detectar una banda correspondiente a AR en extractos de cualquiera de las células inmortalizadas o en PRSC pesar de que fue fácilmente detectado en el extracto de células LNCaP (Fig. 1B). Del mismo modo, cuando las células WPMY-1 parentales fueron transfectadas con un vector reportero sensibles a los andrógenos, que no mostraron evidencia de aumento de la expresión del reportero (luciferasa) en respuesta a cantidades crecientes de DHT (Fig. 1C). Sin embargo, cuando las células WPMY-1 fueron co-transfectadas con el reportero de andrógenos junto con un vector de expresión AR, la expresión del reportero se incrementó significativamente por la presencia de DHT (Fig. 1C). En resumen, la expresión AR endógeno bajo en estas líneas de células del estroma de próstata humana y su falta de respuesta a la estimulación de andrógenos sugiere que son pobres modelos para el estudio de la acción de andrógenos en las células estromales, pero la expresión exógena de AR, al menos en el WPMY-1 células, que le confiere un fenotipo de estas células andrógeno-sensibles que podrían ser más propicio para el estudio de la acción de los andrógenos.
(a) los niveles de ARNm de AR en PS30, estroma de próstata primario (PRSC), WPMY-1 (W ), WPMY-Vec (W-Vec), las células WPMY-AR (W-AR) o LNCaP detectado por qPCR en tiempo real de los ARN extraídos de las células. Los niveles de expresión están indexados a la expresión de GAPDH en cada línea celular. (B) proteína de AR (carriles superior) en PS30, CALP, W, W-Vec, las células W-Ar o LNCaP detectados por Western blot. La transferencia se volvieron a sondar para la proteína GAPDH (carriles inferiores) como control. la expresión del indicador (C) de la luciferasa en células WPMY-1 co-transfectadas con el vector ARE-luc reportero y un control (vacío) vector (vector) o el vector pLenti6.2-hAR (AR). los niveles de luciferasa se normalizan para la fluorescencia de GFP en el mismo extracto como el marcador de control de transfección. (D) La tinción inmunofluorescente para AR en células W-AR crecido durante 72 horas en ausencia (izquierda) o presencia (derecha) de 10 nM DHT. Las células se co-teñidas con DAPI para identificar los núcleos. La actividad de luciferasa (E) en las células W-AR transfectadas con ARE-Luc y GFP en ausencia o presencia de 10 nM de DHT. La actividad de luciferasa se normalizó mediante comparación con los niveles de GFP en el mismo extracto. (F). El crecimiento de las células W-Vec o W-AR en la ausencia o presencia de 10 nM de DHT, medido por el ensayo de WST-1.
Con el fin de hacer que las células WPMY-1 más favorable para el estudio de los efectos de andrógenos en la expresión génica, transduced las células con tipo salvaje humana lentivirus expresión AR y luego se usa la selección de antibióticos para obtener una población estable de células que sobreexpresan AR WPMY-1 (WPMY-AR). Otras células WPMY-1 fueron transducidas con lentivirus vacío y seleccionados en las mismas condiciones para obtener una población de células control (WPMY-Vec). WPMY células expresan AR-AR ARNm y proteínas a un nivel comparable con células de cáncer de próstata LNCaP sensibles a los andrógenos (Figs. 1A, B). La tinción de inmunofluorescencia usando anticuerpo anti-AR mostró que AR era principalmente en el citoplasma cuando se cultivaron estas células en ausencia de DHT, aunque no había luz tinción de inmunofluorescencia nuclear en la mayoría de las células (Fig. 1D). En contraste, cuando las células fueron cultivadas WPMY-AR en medio que contiene DHT-, AR inmunotinción fue exclusivamente nuclear. El AR expresa en las células WPMY-AR estables era funcional para la activación genómica de la expresión génica. Cuando estas células se transfectaron con el andrógeno-reportero, la actividad de luciferasa se incrementó significativamente por tratamiento con DHT mientras que DHT no afectó la expresión de luciferasa en células de control WPMY-Vec reportero transfectadas (Fig. 1E). De lo contrario, las células WPMY-AR no mostraron otras diferencias fenotípicas evidentes cuando se compara con células de control WPMY-Vec; que eran indistinguibles por la morfología bajo observación microscópica (no mostrado) y tienen tasas de crecimiento similares, tanto libre de andrógenos y medio que contiene andrógenos (Fig. 1F).
comparativo de perfiles de expresión génica de próstata células estromales cultivadas en Variantes la presencia o ausencia de DHT
WPMY-Vec y células WPMY1-AR se sembraron en igual número en medio libre de andrógenos para la fijación después se transfiere a un medio fresco con o sin suplemento de 10 nM de DHT durante 72 hrs. ARN extraídos de los duplicados biológicos de estos cultivos se marcaron a continuación perfilan en Affymetrix Human Gene ST 1.0 conjunto de genes chips. Se analizó la expresión de datos de microarrays para identificar los genes que son expresados diferencialmente entre una célula dada en condiciones diferentes (- /+ DHT) o entre los dos tipos de células (WPMY-Vec vs WPMY-AR) en condiciones equivalentes. Utilizando un punto de corte de los cambios de 1,5 veces en la expresión del ARN, las células de control WPMY-Vec tenían sólo 8 genes que son expresados diferencialmente en la presencia de DHT y el gráfico que muestra la gama de estos genes modificados fue generado por el programa GeneSpring y se muestra en la Figura 2A. Hemos tratado de confirmar la expresión diferencial de estos genes en las células 8 WPMY-Vec DHT-tratada /-untreated utilizando qPCR en tiempo real para evaluar la expresión de cada gen en un nuevo juego de los duplicados de las muestras biológicas, pero los resultados de este análisis no mostró diferencias significativas en la expresión de cualquiera de ellos el uso de este método (no mostrado). La comparación de los perfiles de expresión génica de los tratados DHT /-untreated células WPMY-AR, sin embargo, mostró mucho más llamativo y robustos cambios en la expresión de genes asociados con el tratamiento DHT. DHT afectó a la expresión de 172 genes individuales por 1,5 veces o más (Fig. 2B). Sin embargo, la mayoría de estos cambios (141 o 81,9%) estaban en el nivel de 2 veces o más. En esta última categoría, más genes se downregulated por la DHT (85 genes) que se upregulated (56 genes). Los genes que se han cambiado por 2 veces o más se identifican en la Tabla S2 y S3 cuadro. Luego, se cambió 10 genes diferentes de estas listas, incluyendo 6 regulada al alza y 4 genes regulados negativamente, para su posterior validación por qPCR en tiempo real sobre un nuevo juego de los ARN extraídos de muestras duplicadas biológicos. Cada uno de estos genes seleccionados se confirmó que era significativamente arriba o hacia abajo-regulada por la presencia de DHT en la misma manera que los resultados del análisis de microarrays de expresión (Fig. 3A). Por último, la lista de genes (arriba y hacia abajo regulado) que fueron cambiadas por 2 veces o más en presencia de DHT se evaluó funcionalmente utilizando el programa de software
Camino Express (http: //vórtice. cs.wayne.edu/projects.htm) [21] que asigna genes en vías funcionales específicos KEGG y luego los diferentes KEGG vías asociadas con estos genes fueron cuantitativamente priorizado por cualquiera de dos parámetros diferentes: 1) el número de genes de entrada que son asignado a una vía específica KEGG; o 2) el porcentaje de genes individuales de la vía KEGG que estaban presentes en el conjunto de genes de entrada (Tabla 1). Los 10 KEGG clasificaciones de la vía superior usando los dos parámetros diferentes comparten las categorías, Rutas en Cáncer, citoquinas-receptores de citocinas Interacción, TGF-β, vía Wnt y Hedgehog vía de señalización, pero otras vías de señalización celular prominente estuvieron representados en una clasificación o la otros en
(a) diagrama de puntos generada GeneSpring de significativa. (P & lt; 0,05) la expresión génica diferencias superiores a 1,5 veces en las células WPMY-Vec tratadas durante 72 horas con 10 nM de DHT. (B) diagrama de puntos generada GeneSpring de significativa (P & lt; 0,05) la expresión génica diferencias superiores a 1,5 veces en las células WPMY-AR tratados durante 72 horas con 10 nM de DHT. (C) diagrama de puntos generada GeneSpring de significativa (P & lt; 0,05) la expresión génica diferencias superiores a 1,5 veces entre las células WPMY-AR-Vec WPMY y crecido sin DHT. (D) diagrama de puntos generada GeneSpring-que muestra el efecto del tratamiento de DHT en los genes que son diferencialmente regulados al alza por 2 veces o más por la expresión AR solos (sin DHT). (E) GeneSpring generado gráfico de líneas que muestra el efecto del tratamiento DHT en genes que son diferencialmente las reguladas por 2 veces o más por la expresión AR solo (sin DHT) y fueron posteriormente hasta reguladas por 2 veces en la presencia de DHT. (F) GeneSpring generado gráfico de líneas que muestra el efecto del tratamiento de DHT en los genes que son diferencialmente las reguladas por 2 veces o más por la expresión AR solos (sin DHT) y fueron posteriormente más abajo reguladas por 2 veces o más en presencia de DHT.
(A). La evaluación de los cambios de expresión de genes individuales asociados con el tratamiento de las células DHT WPMY-AR por qPCR. Seis de los genes en este panel (SFRP-5, IGF-1, Wnt-16, AQP3, FKBP5 y RERG) fueron identificados como genes DHT-hasta reguladas en el análisis de microarrays de expresión génica y cuatro genes (BMP-4, FST , IL7R y FGF5) fueron identificados como genes regulados DHT-down-en el análisis de microarrays de expresión génica y estos cambios fueron confirmados en el ensayo qPCR. Todos los cambios detectados por qPCR cambios significativos (P & lt; 0,05). (B) La evaluación de los cambios de expresión de genes individuales asociados con el tratamiento DHT de las células transfectadas transitoriamente con PS30 pLenti6.2-hAR por qPCR. La medición de los cambios en SRBP5, IGF1, Wnt-16, AQP3, FKBP5, RERG y FGF5 fueron significativas (P & lt; 0,05), mientras que los cambios en BMP-4, FST y IL7R no fueron significativas (P & gt; 0,05).
para determinar mejor si estos cambios genéticos asociados con el tratamiento DHT eran específicos para las células WPMY-AR o si también pueden ocurrir en otras células del estroma de próstata humanos con AR expresión suficiente, las células transfectadas transitoriamente con el PS30 vector de expresión de AR o un vector de control vacío después se tratan estas células sin o con 10 nM de DHT durante 72 horas. ARN extraídos de estas células se ensayaron por análisis de qPCR en tiempo real para la expresión de AR y para la expresión de los mismos 10 genes que fueron analizados selectivamente en las células WPMY-AR. Los resultados mostraron que la AR se expresó 923 veces más en AR-transfectadas que en las células de control transfectadas con PS30. Como se muestra en la Figura 3B, la expresión de 6 de los otros 10 genes fueron cambiados en la misma manera que para las células WPMY-AR tratados con DHT, mientras que 4 de los 10 genes no se cambiaron de manera significativa entre las células untreated- o tratados DHT . Por último, los fibroblastos de células de próstata humanas primarias también fueron cultivadas en medio con o sin DHT durante 72 horas y se extrajeron los ARN para el análisis de qPCR a tiempo real. Los ADNc a partir de estas células se ensayaron con respecto a los efectos de DHT en la expresión de 5 genes diferentes de nuestro panel. Los resultados mostraron que SFRP5 y IGF1 se upregulated por 1.67- a 1.73- veces por DHT (p & lt; 0,05) y FGF5 se downregulated por 1,5 veces (p & lt; 0,05) en comparación con no-DHT controles mientras que la expresión de FST y Wnt16 no era cambiado significativamente por el tratamiento DHT de estas células.
cambios de expresión génica asociados con la sobreexpresión de la AR en WPMY-1 en las células
Para determinar si la expresión de AR (en ausencia de ligando) afectados en la expresión génica las células WPMY, también compararon los perfiles de expresión génica entre células WPMY-AR-Vec WPMY y cultivados sin tratamiento DHT. Se encontraron notablemente 443 genes que se expresa diferencialmente entre estas células a un nivel de 1,5 veces o más (Fig. 2C) y 374 de estos genes se expresan diferencialmente por 2 veces o más entre estas células. En este último subgrupo, 55 genes se upregulated selectiva y 319 genes fueron regulados a la baja de forma selectiva en las células que expresan AR. Fue de interés adicional para determinar cómo estas dos categorías de genes se vieron afectados seguida de tratamiento DHT. En primer lugar, se seleccionaron aquellos genes (55) que se upregulated por la sobreexpresión de AR (al menos 2 veces) en la ausencia de DHT. El sesenta por ciento de estos genes (33 genes) se downregulated posteriormente (por 2 veces o más) de nuevo en presencia de DHT (Fig. 2D), mientras que el otro 40% eran ya sea sin cambio o se cambia menos de 2 veces por DHT y, Por lo tanto, excluidos de nuestro análisis. Para los 319 genes que fueron regulados a la baja por 2 veces o más por la sobreexpresión AR solo, 21 genes (6,58%) se upregulated posteriormente por 2 veces o más por la adición de DHT (Figura 2E), mientras que 21 genes (6,58%) fueron más downregulated por 2 veces o más por la adición de DHT (Figura 2F). El resto de genes en esta categoría (277 o 86,8%) eran o sin cambios por adición de DHT o se cambiaron menos de 2 veces y excluidos de nuestro análisis. No hay genes se upregulated por AR expresión upregulated entonces aún más por la DHT, incluso en aquellos que se vieron afectados por la DHT & lt; 2 a 1,5 veces. En resumen, AR sobreexpresión solo en ausencia de ligando puede inducir pero principalmente reprimir genes de expresión en las células WPMY-1, pero estos efectos a veces se invirtieron en presencia de ligando. Sin embargo, algunos cambios en la expresión génica inducida por AR sobreexpresión de genes (downregulations) fueron aumentadas aún más por el tratamiento con el ligando de andrógenos en estas células.
Reglamento directo o indirecto de los genes por la DHT
describió aquí alterado los patrones de expresión génica en las células del estroma de próstata inducidos por AR sobreexpresión, con o sin ligando, que se basan en las mediciones de los niveles de mRNA. Se buscó además de evaluar un pequeño subconjunto de estos genes regulados DHT para determinar si los efectos de la DHT requiere la síntesis de proteínas intermediario. Con este fin, se tripsinizaron células se les permitió WPMY-AR para unir durante la noche y a continuación se trató brevemente (30 min) con cicloheximida dosis alta (40 μgs /ml) para bloquear la síntesis de proteínas y posteriormente cambiaron a medio con o sin DHT (10 nM) en la presencia de cicloheximida inferior de la dosis (10 μgs /ml) durante 24 hrs. Las células de control se trataron de manera similar excepto que no se incluyó cyclohexmide en cualquier momento. ARN extraídos de estas células fueron entonces evaluados para la expresión de los genes seleccionados DHT-upregulated (RERG, Wnt16 y SFRP5) o DHT-abajo-regulada (FST, FGF5 y BMP4). Nuestros resultados (Figura 4) mostraron que el efecto DHT sobre la expresión cambia para cuatro de estos genes (RERG, WNT16, SFRP5, y FST) no se modificaron por el tratamiento con cicloheximida, mientras que los efectos de DHT en BMP4 y expresiones FGF5 fueron bloqueados por cicloheximida. células
WPMY-AR fueron pre-tratado después se trata con cicloheximida en ausencia o presencia de 10 nM de DHT durante 24 hrs. Los ARN se analizaron mediante qPCR para la expresión de RERG, FST o FGF5, como se indica y los niveles de expresión se normalizaron a los niveles de expresión GAPDH.
Efectos de DHT-estimulada WPMY1-AR medios acondicionados en LNCaP Crecimiento Celular
por último, hemos tratado de comprobar si la acción de DHT en las células modelo WPMY-AR puede afectar la producción de factores secretados por estas células que influyen en el crecimiento de células de cáncer de próstata. Tres días medio acondicionado a partir de 10 células de DHT tratados WPMY-Vec o WPMY-AR nM se diluyó 1:01 con medio fresco (con 10 nM DHT) y después se añadió a las monocapas frescas de células LNCaP y se siguieron las células durante 9 días con reemplazo de medio cada 3 días. El crecimiento durante este período se midió usando el ensayo de WST-1 y los resultados se muestran en la Figura 5. El tratamiento con el medio condicionado de las células WPMY-AR DHT-tratado se encontró que era significativamente mayor crecimiento-estimuladoras para LNCaP en comparación con el tratamiento con condicionado medio a partir de células WPMY-Vec DHT-tratada.
número de células relativo en diferentes días fueron estimados por WST-1 ensayo. El uso de medio condicionado de células WPMY-AR DHT tratados estimula significativamente el crecimiento (P & lt; 0,01, ANOVA de dos vías) de células LNCaP en comparación con medio condicionado de células WPMY-Vec DHT-tratada. Pendientes de las dos curvas de crecimiento también fueron significativamente diferentes (P = 0,0181, análisis de regresión lineal).
Discusión
Al igual que otros tejidos, la próstata se compone de una mezcla de dispares tipos de células que están ampliamente segregados en un epitelial o un compartimiento del estroma en base a su localización con respecto a la membrana basal. células de cáncer de próstata que se derivan de la epitelio prostático han proporcionado históricamente los modelos para estudiar cómo andrógenos acción afecta a la expresión génica de células de próstata. Sin embargo, también se conocen varios tipos de células en el estroma de la próstata para expresar AR
in vivo
[22] - [24] y de contribuir al proceso (s) a través del cual los andrógenos regular el desarrollo de la próstata y la enfermedad Sin embargo, sabemos muy poco sobre los efectos de los andrógenos sobre la expresión génica en estos tipos de células. En este sentido se ven obstaculizados por la falta de modelos de células estromales cultivadas adecuadas, especialmente los que expresan AR en niveles suficientes para permitir el uso de técnicas de perfiles de expresión génica de masas contemporánea. Aquí, hemos intentado caracterizar AR expresión y actividad de señalización de andrógenos en dos líneas disponibles inmortalizadas de células del estroma de la próstata, PS30 y WPMY-1, que se había informado anteriormente para expresar AR [20], [25] para evaluar si podrían proporcionar modelos para estudiar andrógenos regula la expresión génica. Estas células se clasifican ambas como miofibroblastos en base a su morfología en la cultura y su co-expresión de vimentina y actina de músculo liso. Se encontró que ambos tipos de células expresan niveles extremadamente bajos de AR ARNm y proteínas y ninguno de los tipos de células respondieron al tratamiento DHT después de la transfección con un vector indicador de luciferasa sensible a los andrógenos por lo que tampoco es probable que un buen modelo para el estudio de la expresión génica regulada por andrógenos. Sin embargo, cuando el vector reportero de andrógenos se co-transfectadas con un vector de expresión de tipo salvaje AR, las células WPMY-1 fueron capaces de responder al tratamiento DHT por la regulación positiva de la expresión del indicador de andrógenos sensible. Este resultado mostró que las células WPMY-1 podrían hacerse susceptible para el estudio de la expresión génica andrógeno regulado cuando se proporciona con AR exógeno. La transducción por un lentivirus AR-expresión de los antibióticos seleccionable nos permitió entonces para derivar una línea celular estable, WPMY-AR, que expresa AR ARNm y proteínas a un nivel comparable a las células LNCaP que a menudo se utilizan para modelar la respuesta de un cáncer de próstata células para andrógenos. Las células WPMY-AR reubicados proteína AR al núcleo en presencia de DHT y apropiadamente upregulate la expresión de luciferasa a partir de un vector reportero regulada por andrógenos después del tratamiento DHT identificación que tienen un sistema de señalización de andrógenos funcional que es consistente con su uso en perfiles de expresión génica experimentos. Fue notable que las células WPMY-AR eran morfológicamente indistinguibles de los padres o el control de las células transducidas (WPMY-Vec) y que su tasa de crecimiento relativo (en presencia o ausencia de andrógenos) no se vio afectada significativamente por la AR sobreexpresión, especialmente desde AR es sabe que afectan el crecimiento de células de cáncer de próstata, ya sea cuando se expresa endógena o exógena [26], [27].
Las células WPMY-Vec y WPMY-AR a continuación, se perfilan para los patrones globales de expresión génica y de los cambios en estos patrones asociados con el tratamiento DHT utilizando un enfoque de microarray chip genético. Nuestro esfuerzo preliminar implicado un tratamiento más prolongado con DHT (72 horas) que se utiliza comúnmente en estudios de células de cáncer de próstata, pero que espera que este largo periodo de tratamiento también permitiría la detección de posibles cambios de expresión génica secundaria que podrían ser relevantes para los aspectos de diafonía entre estroma de la próstata y las células epiteliales que afectan al desarrollo de la próstata o el crecimiento de células de cáncer de próstata. Para las células de control WPMY-Vec, el tratamiento DHT alteró significativamente la expresión de los genes sólo 8 (de un total de 28,712 conjuntos de sondas de genes en el chip) y estos cambios fueron relativamente bajas, que van desde un cambio 1.62- a 1,74 veces en comparación con WPMY sin tratar -Vec células. Ninguno de estos cambios en los genes se confirmaron posteriormente mediante un enfoque qPCR en tiempo real. Nos parece entonces, que estos pequeños cambios en nuestras células de control (+/- DHT) detectados utilizando el enfoque de chip microarrays de genes representan el "ruido" del sistema y que este ruido es extremadamente baja y fácilmente filtrada utilizando el enfoque de qPCR secundaria. En notable contraste, el tratamiento de las células WPMY-AR con DHT alterada la expresión de 141 genes diferentes por 2 veces o más. La gran mayoría de estos cambios (60,2%) que participan la expresión de genes down-reglamentos asociados con el tratamiento DHT. Teniendo en cuenta que transcripcionalmente activo (liganded) AR es el más a menudo considerado como un inductor de la expresión génica, esto es una notable alto número de genes potencialmente reprimidos por andrógenos. Sin embargo, AR /andrógenos reprimido genes se han descrito anteriormente en células de cáncer de próstata [8] y un informe que describe los efectos de los andrógenos sobre la expresión génica en las células LNCaP mostró que el tratamiento con andrógenos suprimió casi tantos genes como fueron inducidos en estas células [9 ] por lo que nuestra observación es apoyada por las observaciones de otros sistemas de células de la próstata. También es interesante que una comparación de nuestras listas de genes de células estromales de DHT-modificado con genes de andrógenos reguladas ya conocidas se reunieron en un recurso sitio web (http://argdb.fudan.edu.cn/index_info.php, [28] mostró que aproximadamente el 21% de los genes presentes en nuestras listas (Cuadros S1 y S2) se describieron anteriormente se consideraban "de andrógenos reguladas", basada en fuentes bibliográficas encuestados que involucran principalmente los estudios de células de cáncer de próstata. La presencia de este porcentaje significativo de lo anteriormente descrito "andrógenos regulado "genes en nuestras listas apoya la idea de que estamos identificando muchos genes que pueden estar comúnmente regulados por AR liganded en muchos tipos de células de la próstata, así como genes que pueden verse afectados de forma selectiva por AR /andrógenos en las células del estroma de la próstata.
en cuanto a la naturaleza de estos genes de las células del estroma de DHT-regulada, había pocos o ningún genes que se clasifican funcionalmente como reguladores de los procesos de proliferación celular o apoptosis y esto es consistente con nuestras observaciones de que el tratamiento con andrógenos no afectó significativamente WPMY crecimiento-AR. La evaluación de la función génica para los genes regulados /reguladas por sobre nuestras listas basadas en la designación KEGG vía fue notable ya que identifica un predominio de los genes que están involucrados en genéricos "cáncer de las vías" que podrían ser de interés para nuestros hallazgos que condicionaron medio a partir de células WPMY-AR DHT estimulada afectado el crecimiento de células LNCaP. Del mismo modo, la presencia de múltiples genes en nuestra lista clasificada como efectores de la señalización del receptor de citoquina-citoquina, TGF-β, WNT, erizo o MAP quinasa vías de señalización apoyaría estudios publicados previos que sugieren que estas vías de señalización particulares están implicados en la cruzada charla que se produce entre estroma de próstata y células epiteliales /cáncer de próstata en el desarrollo o la enfermedad [29] - [31]. Categorización de los genes en la lista sobre la base de ontología de genes (GO) asignaciones también se realizaron utilizando el programa de David y los resultados mostraron categorías similares a las asignadas en virtud de la KEGG Pathway (no se muestra). Por último, nuestro estudio limitado por un efecto de la cicloheximida sobre cambios en los genes inducida por DHT es compatible con la idea de que muchos de los cambios genéticos que observamos están asociados principalmente con la actividad funcional de AR. Sin embargo, nuestra capacidad de identificar algunos genes de DHT afectadas en las células WPMY-AR que no se cambió cuando la cicloheximida se incluyó con el tratamiento DHT también muestra que hay genes en nuestras listas que se secundariamente reguladas por alguna otra proteína afectada por la DHT como sospechábamos. El uso de células WPMY-AR con un período de tratamiento más corto DHT puede ayudarnos a resolver el principal afectado vs los genes afectados secundarias y vamos a intentar esto en el futuro.
Para fines de validación, que se había seleccionado un panel