Resistencia Resumen
a la terapia basada en cisplatino es una de las principales causas de fracaso del tratamiento en el cáncer de ovario humano. Una mejor comprensión de los mecanismos de resistencia a cisplatino ofrecerá nuevas ideas para nuevas estrategias terapéuticas para esta enfermedad mortal. Akt y p53 son determinantes de la sensibilidad a cisplatino. Rictor es un componente del complejo de la proteína mTOR quinasa 2, que se requiere para la fosforilación de Akt (Ser473) y la activación completa. Sin embargo, el papel preciso de Rictor y la relación entre Rictor y p53 en la resistencia a cisplatino sigue siendo poco conocida. Aquí, el uso de p53 sensible a la de tipo salvaje (OV2008 y A2780s), p53 de tipo salvaje resistente (C13 * y OVCAR433), y p53 comprometida (A2780cp, OCC1, y SKOV-3) células de cáncer de ovario, hemos demostrado que (i) Rictor es un determinante de resistencia a cisplatino en células de cáncer de ovario humano sensibles a la quimioterapia; (Ii) cisplatino regula a la baja el contenido Rictor por la caspasa-3 división y la degradación proteasomal; (Iii) Rictor baja regulación sensibiliza a las células de cáncer de ovario quimio-resistentes a la apoptosis inducida por cisplatino en una manera dependiente de p53; (Iv) Rictor suprime la apoptosis inducida por cisplatino y confiere resistencia mediante la activación de Akt y la estabilización. Estos hallazgos amplían el conocimiento actual sobre las bases moleculares y celulares de la resistencia al cisplatino y proporcionan una base lógica para Rictor como una posible diana terapéutica para el cáncer de ovario quimioresistente
Visto:. Im-aram A, L Farrand, Bae SM, G canción, canción YS, Han JY, et al. (2013) El Componente mTORC2 Rictor contribuye a la resistencia cisplatino en células de cáncer de ovario humano. PLoS ONE 8 (9): e75455. doi: 10.1371 /journal.pone.0075455
Editor: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 24 de mayo de 2013; Aceptado: 15 de agosto de 2013; Publicado: 23 Septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Im-aram et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el programa de la Universidad de Clase Mundial (WCU) a través del Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología y financiado por la Fundación Nacional de Investigación de Corea (R31-10056) y por los Institutos canadienses de Investigación en Salud (m0p-126144). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer de ovario
epitelial es la neoplasia ginecológica más letal entre las mujeres en todo el mundo [1]. A pesar de los avances en nuestra comprensión de la biología del tumor, la mortalidad global por cáncer de ovario (OVCA) sigue siendo alta. Actualmente, la quimioterapia en combinación con citorreducción quirúrgica es la opción de tratamiento preferida y derivados de cisplatino (CDDP: cis-diaminodicloroplatino) son agentes terapéuticos quimioterapéuticos de primera línea. CDDP induce la muerte celular citotóxica a través de la formación de aductos de ADN-platino, lo que resulta en daños en el ADN y la activación de las vías de apoptosis [2].
El tratamiento eficaz de OVCA a menudo se ve obstaculizada por el diagnóstico tardío y la aparición de resistencia a quimioterapia después de sucesivas rondas de tratamiento. La resistencia a agentes quimioterapéuticos implica mecanismos complejos que pueden resultar de señalización desregulada, la reparación del ADN mejorada, alteración del metabolismo de las células del cáncer [3,4], el transporte del fármaco y el metabolismo de [5], y la desregulación de los factores de supervivencia, incluyendo FLIP, XIAP y Akt [6 -9]. Estos eventos moleculares y celulares alteran la respuesta general de la célula a agentes genotóxicos como CDDP y la influencia de la célula hacia las decisiones a favor de la supervivencia.
El objetivo de mamíferos de la vía de la rapamicina (mTOR) ha surgido como un regulador crítico de la celular metabolismo, el crecimiento, la proliferación y la supervivencia. Su aberración, que está presente en hasta el 50% [10] de los pacientes Ovča, se ha demostrado que confiere resistencia al tratamiento basado en CDDP y está asociada con un pronóstico adverso [11-14]. La vía mTOR implica dos complejos de señalización: mTORC1 y mTORC2. mTORC1 es sensible a la síntesis de rapamicina y proteína controles y el metabolismo celular, mientras que mTORC2 es esencial para la viabilidad celular [15]. mTORC2 también es conocida por su papel en la fosforilación de Akt en Ser473 lo que permite la activación completa y la degradación proteasomal [16-18]. la activación de Akt y /o sobre-expresión son un factor determinante de la sensibilidad CDDP en OVCA humano. resultados de la activación de Akt en la estabilización de un número de inhibidores de caspasas [19,20] inhibe la acumulación de p53 mitocondrial y liberación de proteínas de muerte [21,22], y atenúa la fosforilación de p53 y la función nuclear [8]. Por el contrario, la inhibición de Akt aumenta la fosforilación de p53 (Ser
15) y la sensibilidad CDDP [8,23].
El compañero de rapamicina y minúsculas de mTOR (Rictor) es un componente esencial del complejo mTORC2, y que se requiere para su plena función [24]. La sobreexpresión de la Rictor aumenta la actividad mTORC2 y promueve el crecimiento celular y la motilidad [25]. Por el contrario, Rictor baja regulación suprime la proliferación celular y la formación de tumores en ciertos tipos de cáncer [26-28]. Rictor también interactúa con la integrina-quinasa vinculada (CIC) para promover la supervivencia de células de cáncer a través de la fosforilación de Akt Ser473, y con PKCζ para la invasión de células de cáncer y la metástasis [29,30]. Se requiere Rictor para el desarrollo del cáncer de próstata inducida por la pérdida de PTEN [31]. Orientación Rictor induce la detención del ciclo celular en la fase G1 y disminuye la expresión de ciclina D1 en mama, colon y próstata células del cáncer [27,32]. Por otra parte, la baja regulación de mTORC2 facilita la apoptosis inducida por el fármaco quimioterapéutico en células de cáncer de mama [33]. Sin embargo, el papel de Rictor en la resistencia a CDDP en OVCA sigue siendo desconocido.
p53 es una proteína supresora de tumor que influye en los efectores de la apoptosis a través tanto dependiente de la transcripción y los mecanismos -independiente [8,21]. Normalmente se activa mediante CDDP a través de la fosforilación en Ser15 y Ser20, que son esenciales para sus propiedades pro-apoptóticas, y la supresión de la doble murino minutos a 2 (MDM2) y su ubiquitinación y la degradación proteasomal [34-36]. Recientemente hemos demostrado que la pérdida de la función de p53 por la inactivación o mutación influye negativamente la apoptosis y la quimiosensibilidad [7,37]. Las células que carecen de p53 funcional no inhiben mTORC1 en respuesta al daño de ADN [38]. Sin embargo, la coordinación y la comunicación entre el estado de p53 y Rictor en la regulación de la quimio-resistencia es poco conocido.
En el presente estudio, la hipótesis de que Rictor juega un papel importante en la regulación de la quimiosensibilidad de las células y que su Ovča abajo regulación sensibiliza a las células Ovča quimiorresistentes a tratamiento CDDP facilitando la degradación proteasomal Akt-dependiente, de una manera dependiente de p53. Los resultados de este estudio plantean la posibilidad de que Rictor puede ser una diana terapéutica para OVCA, aunque es probable que sea dependiente de p53 la eficacia de tal aplicación.
Materiales y Métodos
Reactivos
RPMI 1640 y medio DMEM /F12 de cultivo, suero fetal bovino (FBS), aminoácidos no esenciales, penicilina, estreptomicina y anfotericina B fueron de Life Technologies (Carlsbad, CA, USA). CDDP, dimetilsulfóxido (DMSO), Hoechst 33248, aprotinina, ortovanadato de sodio (Na
3Vo
4), fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) fueron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.). Los anticuerpos policlonales de conejo anti-fosfo-Ser
473-Akt, anti-fosfo-Ser
450-Akt, anti-Akt, anti-fosfo-Ser
15-p53, anti-PARP y monoclonal de conejo anticuerpo anti-Rictor fueron adquiridos de Señalización celular Tecnología (Beverly, CA, EE.UU.). monoclonal de ratón anti-p53 y anticuerpos anti-GAPDH eran de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EE.UU.) y Abcam (Cambridge, MA, EE.UU.), respectivamente. Cabra anti-ratón y anticuerpos secundarios anti-conejo eran de Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA, EE.UU.). Rictor y p53 siRNA fueron adquiridos de Señalización Celular Tecnología (Beverly, CA, EE.UU.). Control de siRNA era de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA, EE.UU.). Lipofectamine 2000, la RNasa A, N, N, N ', N'-tetrametil-etano-1,2-diamina (TEMED), TRIzol y colorante ROX eran de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.). RNeasy Mini Kit de Qiagen era (Valencia, CA, EE.UU.). construcciones de adenovirus que contienen las transcripciones wt-p53 y eGFP eran de Vector Biolabs (Philadelphia, PA, USA). Epoxomycin y lactacistina eran de Merck Química (Gibbstown, NJ, EE.UU.). Z-DEVD-FMK y Z-VAD-FMK eran de Tocris Bioscience (Ellisville, MO, EE.UU.). Rictor y GAPDH ARN cebador eran de Bioneer (Daejeon, Corea del Sur) y la caspasa activa recombinante humana fue de 3 Biovision (Mountain View, CA, EE.UU.). TUBOS, DL-ditiotreitol (DDT), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y 3 [(3-cholamido-propil) dimethyallonio] -1-propanesulfonato hidrato (caps) fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, EE.UU.) .
líneas celulares y Cultura y
CDDP sensible (OV2008 y A2780s) y resistentes (C13 *, OVCAR-433, A2780cp, OCC-1, y SKOV3) fueron proporcionados generosamente líneas celulares humanas Ovča por los Dres. Rakesh Goel y Barbara Vanderhyden (Hospital de Ottawa Centro del Cáncer, Ottawa, ON, Canadá). Las células se mantuvieron en medio RPMI 1640 y DMEM /F-12 como se informó anteriormente [20,21,36]. La línea de células OV2008 y su contraparte resistentes C13 * se originó a partir de un adenocarcinoma endometrioide del ovario con diferenciación escamosa. células OCC-1, A2780s y A2780cp originó a partir de tumores de carcinoma de ovario no diferenciadas. células SKOV3 eran de origen carcinoma de células claras [39] y OVCAR433 células eran de cistoadenocarcinomas serosos del ovario [23]. Después de los tratamientos indicados, las células se recogieron para su análisis. Se realizaron
extracción de proteínas y análisis de transferencia de Western
Los procedimientos para la extracción de proteínas y análisis de transferencia de Western como se describe anteriormente [40]. Las membranas se incubaron a 4 ° C durante la noche con anti-Rictor (1: 100), fosfo-Ser
473-Akt (1: 1000), fosfo-Ser
450-Akt (1: 1000), p53 ( 1: 5000), fosfo-Ser
15-p53 (1: 1000) y PARP (1: 2000) de anticuerpos y 1 h a temperatura ambiente durante anti-GAPDH (1: 10.000) y de conejo conjugado con HRP o el ratón secundario anticuerpos (1: 5000-1: 10.000). GAPDH se eligió como control de carga desde su contenido celular en las células Ovča examinados en los estudios actuales no se ve afectada por el tratamiento CDDP. banda densidades se analizaron para la cuantificación usando un ChemiDoc
TM + XRS (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.)
Evaluación de la apoptosis
La apoptosis se evaluó basándose en la morfología celular utilizando el mancha nuclear Hoechst 33258. El procedimiento se realizó como se ha descrito anteriormente [20,36]. Un mínimo de 400 células por grupo de tratamiento fueron contados y el contador fue cegado para evitar el sesgo experimental
siRNA transfección
Ovča células fueron transfectadas con siRNA Rictor (0-100 nM; 48 h). , p53 siRNA (100 nM; 48 h), o controlar siRNA (0-100 nM; 48 h) y se trató después con CDDP (0-10 mM; 24 h), como se describe anteriormente [20], y se recogieron para su posterior análisis .
infección por adenovirus
células
A2780cp y SKOV3 se infectaron con adenovirus wt-p53 (MOI = 10; 24 h; GFP como control) como se describe anteriormente [9,20]
.
in vitro la actividad de caspasa-3
El ensayo de actividad in vitro de la caspasa-3 se realizó con lisados de células enteras de OV2008 como se describe anteriormente [23].
El análisis estadístico
los resultados se expresan como la media ± SEM de al menos tres experimentos independientes. El análisis estadístico se realizó mediante el test t emparejado, y de una vía o de dos vías ANOVA según sea apropiado, usando SigmaPlot® 12 (Systat Software Suite, IL, EE.UU.). Las diferencias entre los múltiples grupos experimentales se determinaron por la prueba post-hoc de Bonferroni. La significación estadística se infiere en P & lt; 0.05.
Resultados
CDDP regula a la baja el contenido Rictor e induce la apoptosis en las células sensibles a la quimioterapia, pero resistentes Ovča no
Para determinar si el contenido Rictor se altera durante el tratamiento con CDDP en OVCA, quimiosensible OVCA (OV2008 y A2780s) y quimiorresistente (C13 *, A2780cp *, OVCAR433, OCC1 y 3-SKOV) OVCA líneas celulares se trataron con CDDP (0-10 mM; 24 h) y el contenido Rictor se evaluó por inmunotransferencia [Figura 1 ]. CDDP significativamente las reguladas contenido intacto Rictor (200 kDa) y la apoptosis inducida en sensible a la quimioterapia (OV2008, *** P & lt; 0,001; y A2780s, ** P & lt; 0,01), pero no en quimiorresistente OVCA independientemente de la concentración de CDDP (C13 *, A2780cp, OVCAR433, OCC1 y SKOV-3; p & gt; 0,05). Estos resultados demuestran que Rictor no está sometido a regulación a la baja por CDDP en las células Ovča chemoresistant, un fenómeno que puede contribuir al fenotipo resistente.
Rictor expresión de la proteína es el regulado en sensible a la quimioterapia (OV2008 y A2780s), pero no quimiorresistente OVCA durante el tratamiento CDDP (C13 * y A2780cp *) (0 a 10 mM CDDP; 24 h). Disminución del contenido en Rictor OV2008 y A2780s después del tratamiento con CDDP se asoció con aumento de la apoptosis. contenido de proteína Rictor en quimiorresistente OVCA (OVCAR433, OCC1 y SKOV3) no fue afectada por CDDP. Rictor contenido se normalizó en contra GAPDH (control de carga). Se muestra una transferencia de Western representativo de tres experimentos independientes. Los resultados se presentan como media ± SEM de tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001,#p & lt; 0,05 (vs CTL en las células sensibles). Hoechst 33258 tinción se utilizó para la evaluación de la apoptosis como se menciona en los procedimientos experimentales.
CDDP induce procesamiento Rictor y quimiosensibilidad en una caspasa-3 y proteasoma dependiente de la forma
Para determinar si Rictor inducida por CDDP baja regulación podría ser debido al procesamiento posterior a la traducción, lo primero que investigó la posibilidad de escisión dependiente de caspasa de Rictor en OV2008 y A2780s cuando son tratados con el inhibidor pan-caspasa Z-VAD FMK (10 mM) antes ( 30 min) y durante desafío CDDP (0-10 mM; 24 h). células OV2008 tratados con CDDP solo exhibieron un Rictor intacta (200 kDa) y dos inmunorreactiva productos escindidos que migró a 160 kDa y 130 kDa [Figura 2]. CDDP la disminución del contenido Rictor intacto y la proteína de 160 kDa, y aumenta sensiblemente los niveles de 130 kDa banda. Aunque el tratamiento de A2780s con CDDP también dio como resultado la baja regulación de Rictor intacta (200 kDa), el nivel de la proteína de 160 kDa fue marcadamente elevada mientras que la de la 130 kDa no fue significativa afectado. Pre-tratamiento de las células con el inhibidor de caspasa significativamente atenuada los cambios inducidos por CDDP en el contenido Rictor intactas y escindidas tanto en células sensibles (P & lt; 0,05 y P & lt; 0,01 en OV2008 y A2780s, respectivamente, la Figura 2), lo que sugiere que CDDP abajo : regula Rictor en parte por el aumento de la actividad de caspasa y que la escisión en diferentes sitios de la caspasa de consenso puede estar implicado. Además, el tratamiento previo de las células con el Ovča específico de caspasa-3 inhibidor Z-DEVD-FMK produjo resultados similares, indicando que la caspasa-3 está implicada en el procesamiento de Rictor inducida por CDDP. Curiosamente, mientras CDDP indujo apoptosis en ambas líneas celulares sensibles a la quimioterapia, el tratamiento previo de las células con o bien el pan-caspasa o inhibidor específico de la caspasa-3 atenúa esta respuesta, lo que sugiere que CDDP induce procesamiento Rictor por la caspasa-3 y la desregulación de este proceso confiere quimiorresistencia en células Ovča
OV2008 y A2780s se pretrataron con Z-VAD FMK (10 M) y Z-DEVD FMK (50 M) durante 30 minutos antes y durante el desafío CDDP. (0-10 mM; 24 h) y se evaluó el contenido Rictor y la apoptosis. células OV2008 tratados con CDDP solo exhibieron un Rictor intacta (200 kDa) y dos productos escindidos (160 kDa y 130 kDa). CDDP la disminución del contenido Rictor intacta y la proteína 160 kDa, y aumenta sensiblemente los niveles de la banda de 130 kDa. El tratamiento de A2780s con CDDP dado lugar a baja regulación de Rictor intacta pero aumentó el nivel de la proteína de 160 kDa y no tuvo ningún efecto sobre la proteína de 130 kDa. Pre-tratamiento de las células con el inhibidor pan-caspasa (Z-VAD) o el inhibidor específico de la caspasa-3 (Z-DEVD) atenuó significativamente los cambios inducidos por CDDP en el contenido Rictor intactas y escindidas tanto en células sensibles, y CDDP- apoptosis inducida fue significativamente pero no completamente atenuada por la presencia de los inhibidores en ambas líneas celulares sensibles a la quimioterapia. Rictor contenido se normalizó en contra GAPDH (control de carga). Los resultados se presentan como media ± SEM (n = 3 y n = 5 en OV2008 y en A2780s, respectivamente). * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001 (vs controles respectivos). Hoechst 33258 tinción se utilizó para la evaluación de la apoptosis como se menciona en los procedimientos experimentales.
Para determinar si la degradación proteasomal juega un papel en Rictor inducida por CDDP baja regulación, las células se cultivaron OV2008 [pre- 30 min tratamiento; 24 h durante el tratamiento con CDDP (0-10 mM)] con los inhibidores del proteasoma epoxomycin (10 nM) y la lactacistina (4 M). Mientras que CDDP solo significativamente reducido regulado Rictor intacta y la apoptosis inducida, como era de esperar, la presencia de los inhibidores bloqueó completamente Rictor inducida por CDDP baja regulación y de manera significativa, pero no la apoptosis completamente atenuada, como se evidencia por la escisión de PARP y la morfología nuclear (P & lt; 0,001; Figura 3:. A)
A. células OV2008 se trataron previamente (30 min) con los inhibidores de proteasomal [epoxomycin (10 nM) y lacytasystin (4 M)] y se sometieron a desafío CDDP (0-10 mM; 24 h). contenido Rictor y la apoptosis se analizaron por transferencia Western y la evaluación de la morfología nuclear. Tanto epoxomicina y lactacistina bloquean eficazmente la degradación inducida por CDDP Rictor (P & lt; 0,001), pero sólo apoptosis parcialmente atenuada. células B. OV2008 se cultivaron en las mismas condiciones que en A, pero previamente con inhibidor del proteasoma y /o Z-DEVD (50 M). No se observó efecto sinérgico entre los dos inhibidores. C. Incubación de lisado de células enteras OV2008 (30 min, 30 ° C) con recombinante activa la caspasa-3 (5-20 mg /ml) dio como resultado la escisión Rictor como se evidencia por la disminución del contenido Rictor intacta (200 kDa) y el aumento en el escindido formas (130 kDa y 160 kDa). Los resultados se presentan como media ± SEM de tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001 (vs controles respectivos). Hoechst 33258 tinción se utilizó para la evaluación de la apoptosis como se menciona en los procedimientos experimentales.
A continuación, investigó si el procesamiento Rictor por la actividad de la caspasa-3 y la degradación proteasomal se produce en vías separadas. células OV2008 se cultivaron 30 min pre-tratamiento [; 24 h durante el tratamiento con CDDP (0-10 mM)] con inhibidores del proteasoma y /o inhibidor específico de la caspasa-3. Los mismos resultados se observaron cuando cualquiera inhibidor estaba presente. Sin embargo, no se observó efecto adicional cuando se utilizaron ambos inhibidores juntos [Figura 3: B]
Además, para proporcionar más pruebas de que el procesamiento de Rictor inducida por el tratamiento CDDP es lisados-3 caspasa dependiente, conjunto de células de. se utilizaron células OV2008 para realizar un
in vitro
ensayo de actividad de caspasa-3. El
in vitro
de datos estaba de acuerdo con la obtenida a partir del experimento línea celular [Figura 3: C]. Tomados en conjunto, estos resultados indican que CDDP regula a la baja Rictor intacta a nivel de proteínas a través de la caspasa-3 división y la degradación proteasomal.
Rictor caída sensibiliza OVCA quimio-resistentes a la apoptosis inducida por CDDP
para establecer el papel de Rictor en la quimio-resistencia OVCA, la expresión Rictor en una línea de wt-p53 quimioresistente celular OVCA (C13 *) fue silenciada por siRNA (0, 50 y 100 nM; 48 h) antes del tratamiento con CDDP (10 M; 24 h), y la apoptosis se evaluó. Rictor intacto y sus formas escindidas fueron significativamente las reguladas por siRNA de una manera dependiente de la concentración. Una disminución significativa en Rictor intacto y Rictor escindido se observaron a 50 nM (p & lt; 0,05) y a una reducción aproximada del 30% a 100 nM, con independencia de la presencia de CDDP. Estos resultados no sólo confirman que el 160kDa y 130 bandas inmunorreactivas kDa fueron productos de Rictor hecho troceados, pero también demostraron que desmontables Rictor indujo apoptosis (p & lt; 0,05), así como aumento de la apoptosis inducida por CDDP de una manera dependiente de la concentración (p & lt; 0,001) [Figura 4]. Estos resultados sugieren que Rictor es un determinante importante de la resistencia a CDDP en OVCA
C13 * células fueron transfectadas con siRNA Rictor. (0-100 nM; 48 h) y se cultivaron con o sin CDDP (10 M; 24 h ). desmontables Rictor mejora de forma significativa la apoptosis inducida por CDDP en las células C13 * de una manera dependiente de la concentración. Los resultados se expresan como la media ± SEM de tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05, *** p & lt; 0,001 (vs respectivo CTL siRNA). Hoechst 33258 tinción se utilizó para la evaluación de la apoptosis como se menciona en los procedimientos experimentales.
respuesta apoptótica a CDDP siguiente Rictor baja regulación depende de la condición de p53
El supresor tumoral p53 es una importante mediador de la apoptosis inducida por CDDP [9,22]. Dado que aproximadamente el 50% de los pacientes Ovča llevar
TP53
mutación del gen (s) [41], es de interés para determinar si la apoptosis inducida por CDDP en células quimiorresistentes siguientes knockdown Rictor depende de la presencia de una p53 funcional . Para investigar esta posibilidad, la expresión Rictor en líneas celulares Ovča chemoresistant con diferente estado de p53 (wt-p53, C13 * y OVCAR433; p53 mutante, OCC1 y A2780cp; p53 nulo, SKOV3) fueron silenciados con siRNA Rictor (100 nM siRNA, 48 h) antes del tratamiento con CDDP (0-10 mu M, 24 h). Rictor knock-down sensibilizado significativamente células quimiorresistentes WT-p53 (C13 * y OVCAR433, Figura 5: Un; p & lt; 0,001) pero no células deficientes en p53 (OCC1, Figura 6: A; A2780cp y SKOV3, la Figura 5: B) a la apoptosis inducida por CDDP, lo que sugiere que podría ser necesaria una p53 funcional para la apoptosis inducida por CDDP en las células Ovča chemoresistant, con la eliminación Rictor. Para investigar más a esta hipótesis, las líneas celulares Ovča CDDP-resistentes que albergan una mutación p53 (A2780cp) y una línea de p53-null (SKOV-3) fueron tratados con siRNA Rictor (0-100 nM; 48 h), seguido de la reconstitución de peso -p53 través de la infección adenoviral (0-10 MOI; 24 h) y el tratamiento CDDP (0-10 mM CDDP; 24 h). Como se muestra en la Figura 5: B, mientras knockdown Rictor solo no aumentó significativamente la sensibilidad CDDP en ausencia de wt-p53, la reconstitución de wt-p53 mejora de forma significativa los efectos de Rictor-caída sobre el contenido Ser15 fosfo-p53 inducida por CDDP y la apoptosis en ambas líneas celulares deficientes en p53 (P & lt; 0,001).
líneas celulares quimiorresistente Ovča con diferentes status de p53 (wt-p53, C13 * y OVCAR433; p53 mutante, OCC1 y A2780cp; p53 null, SKOV3) fueron transfectadas con siRNA Rictor (100 nM siRNA, 48 h) con o sin infección adenoviral wT-p53 (0-10 MOI; 24 h; células deficientes en p53) y el tratamiento CDDP (0-10 mM CDDP; 24 h). Rictor, Ser15 p-p53, p53, se evaluaron PARP y el contenido de GAPDH, así como apoptosis. Rictor knock-down células wt-p53 quimiorresistentes sensibilizados significativamente (A, C13 * y OVCAR433; P & lt; 0,001), pero las células no p53-difficient (A, OCC1; B, A2780cp y SKOV3) a CDDP (10 M) inducida por apoptosis. Reconstitución en A2780cp y SKOV-3 de WT-p53 mejora de forma significativa la apoptosis inducida por CDDP (P & lt; 0,001). Los resultados se presentan como media ± SEM de tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001 (vs respectivo CTL siRNA),###p & lt; 0,05 (vs controles de infección adenoviral). Hoechst 33258 tinción se utilizó para la evaluación de la apoptosis como se menciona en los procedimientos experimentales.
células chemoresistant Ovča (C13 *) fueron transfectadas con siRNA Rictor (100 nM siRNA, 48 h) y pretratadas con epoxomycin (0 -12.5 nM) 30 minutos antes del tratamiento CDDP (0-10 mM CDDP; 24 h). Rictor, se evaluaron Akt, fosfo Akt (Ser473 y Thr450), y el contenido de GAPDH, así como apoptosis. Rictor knock-down apoptosis significativamente mejorada inducida por CDDP en células Ovča quimiorresistentes (P & lt; 0,01 y P & lt; 0,001, respectivamente) y este efecto fue rescatado por epoxomycin (P & lt; 0,05 y p & lt; 0,001, respectivamente) Total-Akt se redujo significativamente durante Rictor silenciar con el tratamiento con CDDP (P & lt; 0,05) y un aumento masivo de la relación entre la fosfo-Akt (Ser473) y el total de Akt también se observó, que disminuyó significativamente cuando epoxomycin se añadió (P & lt; 0,001 y P & lt; 0,05, respectivamente) Los resultados se presentan como media ± SEM de tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001 (vs respectivo CTL siRNA),## p & lt; 0,01,###p & lt; 0,05 (vs sin epoxomycin). Hoechst 33258 tinción se utilizó para la evaluación de la apoptosis como se menciona en los procedimientos experimentales.
Rictor baja regulación sensibiliza a las células chemoresistant a la apoptosis inducida por CDDP, facilitando Akt degradación proteasomal
Rictor se conoce que se requiere para mTORC2 para fosforilar Akt en Ser473. Para examinar si y cómo Akt es relevante a este fenómeno, las células Ovča chemoresistant (C13 *) expresión Rictor fue silenciada por siRNA (100 nM; 48 h) antes de la pre-tratamiento con epoxomycin (12,5 nM; 30 min) y el tratamiento con CDDP (10 M; 24 h), y la apoptosis se evaluó. desmontables Rictor sí sola el aumento de fosfo-Akt contenido (Ser473), pero disminuyó los niveles de fosfo-Akt Ser450 [Figura 6], un sitio de fosforilación que se sabe están regulados en la estabilidad de Akt [18]. El aumento de la fosforilación de Akt en Ser473 siguiente silenciamiento Rictor sin el inhibidor proteasomal fue acompañado por Akt baja regulación (P & lt; 0,05 en el grupo de tratamiento) y fue rescatado por inhibidor proteasomal (p & lt; 0,05). Inducción de la apoptosis independientemente de la presencia de CDDP, dos respuestas atenuadas por la presencia de la epoxomycin inhibidor del proteasoma (Figura 6; p & lt; 0,05 y p & lt; 0,001 en los grupos de tratamiento de CDDP control y respectivamente). Además, la relación entre fosfo-Akt en Ser473 y Akt Total también se incrementó notablemente en caída Rictor con CDDP-tratamiento y disminuyó significativamente cuando se añadió epoxomicina (P & lt; 0,001 y p & lt; 0,05; con y sin epoxomycin, respectivamente). Estos resultados sugieren que Rictor juega un papel en la estabilización de Akt y resistencia CDDP en OVCA humana y su caída promueve la degradación proteasomal Akt y aumenta la sensibilidad CDDP.
Discusión
quimiorresistencia es un obstáculo importante en terapéutica de ovario cáncer y su mecanismo celular es compleja y poco conocida. Aunque la vía de señalización mTOR es conocido por promover la proliferación celular y la supervivencia, ya sea Rictor está implicado en el control de quimiosensibilidad es desconocido. En el presente estudio, hemos investigado el papel de Rictor en la resistencia a CDDP usando líneas CDDP-sensibles y resistentes de células Ovča con diferente estado de p53. Hemos demostrado por primera vez que Rictor es un determinante de la resistencia a CDDP en OVCA. CDDP regula a la baja el contenido Rictor en las células sensibles a la quimioterapia por la caspasa-3 y la degradación de proteasoma dependiente de, pero no se observó efecto similar en las células resistentes. Además, hemos demostrado que Rictor suprime la apoptosis inducida por CDDP y confiere resistencia mediante la activación de Akt y la estabilización. Silenciamiento de Rictor sensibiliza a las células Ovča quimiorresistentes a la apoptosis inducida por CDDP en células que albergan tipo salvaje-p53, pero no en células p53 comprometida a menos que reconstituirse con un p53 funcional. Tomados en conjunto, estos datos apoyan la hipótesis de que Rictor baja regulación sensibiliza las células Ovča chemoresistant al tratamiento con CDDP, facilitando la degradación proteasomal Akt-dependiente, de una manera dependiente de p53.
Nuestra investigación actual muestra que Rictor se ha reducido -regulated en proteínas, pero no el nivel de ARNm (datos no mostrados) y este proceso está asociado con la apoptosis inducida por CDDP en las células sensibles y que Ovča Rictor juega un papel en la determinación del destino celular. Esta observación se ve apoyado con resultados utilizando diversas líneas celulares Ovča chemoresistant con diferente estado de p53, en que el fracaso de CDDP para regular a la baja el contenido Rictor permite a las células para sobrevivir el tratamiento con CDDP. El papel de Rictor en la supervivencia celular ha demostrado anteriormente, y un estudio ha abordado la idea de que Rictor y proteínas en la vía mTOR son regulados hacia abajo a través de la vía del proteasoma-ubiquitina en células de cáncer de pulmón después de la exposición quimioterapéutico, la posible participación de Rictor procesamiento en el control de la quimiosensibilidad no se abordó [26]. Nuestros resultados muestran que induce CDDP Rictor baja regulación a través del proteasoma están de acuerdo con este hallazgo. Por otra parte, nuestros estudios actuales han extendido las conclusiones anteriores, mostrando que se requiere para la caspasa-3 inducida por CDDP procesamiento Rictor en las células sensibles a la quimioterapia Ovča humanos. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que confiere resistencia Rictor CDDP en OVCA humana y Rictor inducida por CDDP baja regulación depende tanto de la caspasa 3-actividad y la degradación proteasomal en sensible a la quimioterapia, pero no en líneas celulares Ovča chemoresistant.
supresores de tumores
TP53
es también uno de los genes más frecuentemente mutado en OVCA humana, y podría ser tan alta como 50% en los pacientes Ovča [41]. La pérdida o mutación de p53 puede tener un enorme impacto en la agresividad del tumor, el pronóstico y el tratamiento exitoso de IMPLEMENTACIÓN [42]. Dado que el mecanismo de CDDP-resistencia es multifactorial y el estado de p53 es una de las principales preocupaciones en OVCA humano, hemos investigado la relación entre Rictor y la p53 supresor de tumores, en el aspecto de la quimiorresistencia. Nuestra investigación, por lo tanto, examina también la función de Rictor en la resistencia a CDDP y muestra que desmontables Rictor no sólo promueve la apoptosis, sino que también aumenta la apoptosis inducida por CDDP en las células Ovča humanos. Este resultado se correlaciona con un estudio reciente que muestra que la orientación de Rictor evita la migración celular y promueve la apoptosis en el cáncer de mama [23]. Los resultados de nuestro estudio muestran también que la sensibilización de las células Ovča chemoresistant silenciando Rictor parece depender de la condición de p53. Esta idea es apoyada por la observación de que una combinación de caída Rictor y reconstitución de peso-p53 aumenta la apoptosis en las células p53-comprometidos cuando inducida por el tratamiento con CDDP, un resultado que no eventuate sin peso-p53. Esta última respuesta es concomitante con un aumento en la activación de p53 a través de la fosforilación en el residuo Ser15, que cambia la estructura de p53 e inhibe la interacción p53-MDM2, así, estabilizar p53 [35]. Esta podría ser la razón para la estabilización de p53 observada en A2780cp y SKOV-3 en presencia de fosfo-p53 (Ser15). En conjunto, estas observaciones sugieren que desmontables Rictor induce la apoptosis y aumenta la apoptosis inducida por CDDP de una manera dependiente de p53.
La vía de señalización de Akt es un determinante de la quimiorresistencia y su activación promueve un fenotipo quimiorresistente, detectado con frecuencia en tan alto como el 87% de los casos en OVCA humana [10].