Extracto
El sulfuro de hidrógeno de liberación lenta (H
2S) donante, GYY4137, causado muerte dependiente de la concentración de las siete líneas celulares de cáncer humano (HeLa diferentes, HCT-116, Hep G2, HL -60, MCF-7, MV4-11 y U2OS) pero no afectó la supervivencia de los fibroblastos pulmonares humanos normales (IMR90, WI-38) como se determinó por exclusión de azul de tripano. hidrosulfuro de sodio (NaHS) fue menos potente y no está activo en todas las líneas celulares. Un análogo estructural de GYY4137 (ZYJ1122) que carecen de azufre y de allí no es capaz de liberar H
2S estaba inactivo. Se obtuvieron resultados similares usando un ensayo clonogénico. La incubación de GYY4137 (400 M) en medio de cultivo condujo a la generación de baja (& lt; 20 mM) concentraciones de H
2S mantuvieron durante 7 días. En contraste, la incubación de NaHS (400 mM) de la misma manera llevó a concentraciones mucho más altas (hasta 400 mM) de H
2S que persistieron por sólo 1 hora. Estudios mecanicistas revelaron que GYY4137 (400 M) se incubaron durante 5 días con células MCF-7, pero no IMR90 células causó la generación de PARP escindida y se escindió de la caspasa 9, indicativo de un efecto pro-apoptótica. GYY4137 (pero no ZYJ1122) también causó G parcial
arresto 2 /M de estas células. Ratones estudios de xenoinjertos utilizando HL-60 y MV4-11 células mostraron que GYY4137 (100-300 mg /kg /día durante 14 días) redujo significativamente el crecimiento del tumor. Concluimos que GYY4137 exhibe actividad anti-cáncer mediante la liberación de H
2S durante un período de días. También proponemos que una combinación de la apoptosis y la detención del ciclo celular contribuye a este efecto y que H
2S donantes deben investigarse más a fondo como potenciales agentes anticancerosos
Visto:. Lee ZW, Zhou J, Chen CS, Zhao Y, Tan CH, Li L, et al. (2011) El donante de sulfuro de hidrógeno de liberación lenta, GYY4137, presenta novedosos contra el cáncer Efectos
in vitro
y
En Vivo
. PLoS ONE 6 (6): e21077. doi: 10.1371 /journal.pone.0021077
Editor: Joseph Alan Bauer, Fundación de Investigación Bauer, Estados Unidos de América
Recibido: 27 Marzo, 2011; Aceptado: 17-may de 2011; Publicado: 20 Junio 2011
Copyright: © 2011 Lee et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo con el apoyo de una beca de investigación de la Universidad Nacional de Singapur para PKM, LWD y CHT (R-183-000-240-720, R183-000-240-101, R183-000-268-733). La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el sulfuro de hidrógeno (H
2S) se sintetiza de forma natural a partir de cisteína por varias enzimas, incluyendo liasa cistationina γ (CSE), cistationina β sintetasa (CBS) y 3-mercaptosulfurtransferase (3-MST) en una amplia gama de células de mamíferos y no mamíferos, tanto
in vitro
y
in vivo
. En la última década, se han propuesto numerosos papeles fisiológicos y fisiopatológicos para este gas, junto con una gran cantidad de dianas celulares y moleculares, incluyendo una gama de canales iónicos, enzimas y factores de transcripción [1].
Además de su potencial funciones en la fisiología normal, también hay una amplia literatura que describe la toxicidad de H
2S y su papel como un contaminante del medio ambiente [2]. Un número de estudios han investigado el papel de H
2S en el desencadenamiento de la muerte celular y se han presentado pruebas de que este gas puede ejercer tanto la actividad pro-y anti-apoptóticos en las células cultivadas [3], [4]. Sin embargo, el mecanismo exacto (s) que participan siguen sin estar claros.
Tal vez sorprendentemente, ha habido pocos estudios sobre el efecto de H
2S sobre las células cancerosas
in vitro Opiniones y no hay informes de su efecto sobre la progresión tumoral
in vivo
. Hace varios años se informó de que H
2S protegida células de cáncer de colon (HCT-116) de la apoptosis debido a isotiocianato de ß-feniletilo [5]. Otros posteriormente han informado de que H
2S aumenta la proliferación de células de cáncer de colon humano y reduce la apoptosis en varias líneas celulares (por ejemplo, HCT-116, [6]), mientras que la disminución de la supervivencia en otras líneas celulares de colon humano (por ejemplo, WiDr, [7]) . Estas observaciones dispares son difíciles de conciliar. Sin embargo, una explicación puede estar en la elección de H
2S donante. sales de sulfuro tales como hidrosulfuro de sodio (NaHS) y sulfuro de sodio (Na
2S) han sido ampliamente utilizados para estudiar los efectos biológicos de este gas en muchas células, tejidos y animales. Por adición de agua, estas sales generan una gran cantidad de H
2S durante un período de tiempo corto. Desde el cultivo de células se lleva a cabo durante un período de horas o días, es probable que poco, si alguno, H
2S está presente en el medio dentro de un corto período de tiempo de la adición de o bien NaHS o Na
2S. Así, mientras que no hay mediciones directas se han hecho hasta este punto, parece probable que la concentración de H
2S que el cáncer (o incluso otros) las células no cancerosas están expuestos a durante el cultivo con NaHS será alta al comienzo y no sostenida durante todo el experimento. Por lo tanto, puede ser difícil sacar conclusiones firmes acerca de la capacidad de H
2S afectar la supervivencia de las células cancerosas usando sales de sulfuro como agentes donantes
.
Con esto en mente, hemos informado anteriormente que GYY4137 libera H
2S lentamente tanto en medios acuosos y cuando se administra a animales intactos durante un período de horas a días [8], [9]. Ahora hemos comparado el efecto de GYY4137 y NaHS sobre la supervivencia de una amplia gama de células cancerosas y no cancerosas en cultivo y se correlacionó con su efecto cambios en la concentración de H
2S en el medio. Además, hemos examinado el efecto de GYY4137 sobre el crecimiento tumoral mediante un modelo de xenoinjerto en ratones inmunodeficientes.
Materiales y Métodos
Protocolos se llevaron a cabo con la aprobación de la Universidad Nacional de Singapur (NUS) Comité de Revisión institucional (IRB, código de referencia: 09-120E) y la Universidad Nacional de Singapur institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC, número de protocolo: 804/05).
La síntesis química de GYY4137 y ZYJ1122
GYY4137 fue sintetizado químicamente en la casa como se describe anteriormente [8]. ZYJ1122 (morfolin-4-io difenilfosfinato) se sintetizó como sigue. A una solución de ácido difenilfosfínico en diclorometano (1,0 mmol, 1,0 equiv.); Se añadió gota a gota (DCM 2 ml) a temperatura ambiente, morfolina (2,0 mmol, 2,0 equiv.). La reacción se agitó a la misma temperatura durante 1 hora y el producto posteriormente recogido por filtración de succión. El producto puro se obtuvo después de lavar con DCM frío. sólido blanco se obtiene como un rendimiento del 56%.
1H RMN (500 MHz, CDCl $
3, ppm): δ = 7,77-7,74 (m, 4H), 7,38-7,32 (m, 6H), 3,77-3,75 (m, 4H), 2,95-2,93 (m, 4H); LRMS (ESI) m /z 217,2 (M
-). La pureza y estructuras de los compuestos se verifica por medio de Resonancia Magnética Nuclear de Protón Espectrometría (
1 H RMN) y espectrometría de masas (figuras S1, S2, S3, S4).
Medición de H
2S
La generación de H
2S, ya sea NaHS (Sigma), GYY4137 o ZYJ1122 (todo 400 M) se determinó en alícuotas (100 l) retirados a intervalos de tiempo (hasta 7 días) de MCF-cultivadas 7 células se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Sigma) como se describe a continuación. La concentración de H
2S (determinada como una combinación de libre H
2S, SA
- y S
2) se midió espectrofotométricamente como se describe anteriormente [10]. Brevemente, medio (100 l) se mezcló con 0,85% w /v de acetato de zinc mezcla NaOH /3% (proporción de 1: 1, 100 l). El azul de metileno a continuación se formó por la adición de N, tinte N-dimetil-p-fenilendiamina-dihidrocloruro y FeCl
3 (concentraciones finales, 2,5 mM y 3,3 mM, respectivamente) y la absorbancia supervisadas posteriormente a 670 nm. Se determinó la concentración de H
2S (definido anteriormente) utilizando una curva estándar de NaHS. (0-400 M; I
2 = 0.9987)
Cultivo de células y la viabilidad celular
Todas las líneas celulares excepto HCT-116 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC). carcinoma cervical humano (HeLa), carcinoma colorrectal (HCT-116), carcinoma hepatocelular (Hep G2), osteosarcoma (U2OS), adenocarcinoma de mama (MCF-7) y fibroblastos diploides de pulmón humano (IMR90 y WI-38) se cultivaron en DMEM suplementado con 10% v /v de suero fetal bovino (FBS; Hyclone), penicilina /estreptomicina (100 U /ml; Sigma) y L-glutamina (2 mM; Caisson) a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO
2. Las células humanas leucemia promielocítica aguda (HL-60) fueron cultivadas en DMEM que contiene 20% v /v FBS, mientras que la leucemia mielomonocítica humana (MV4-11) las células se cultivaron en RPMI con 10% v /v FBS en las mismas condiciones de incubación. poblaciones de células vivas incubadas con NaHS, GYY4137 o ZYJ1122 (400 o 800 mM) se recogieron después de 5 días y se contaron por triplicado después de la tinción con azul de tripano usando un hemocitómetro. respuesta a la concentración para GYY4137 (100-1000 mu M) se generaron en células MCF-7, HL-60 y MV4-11 expuestos a las drogas durante 5 días y la capacidad de reducir la supervivencia evaluado como IC
50 valores. La formación de colonias utilizando células MCF-7 también se evaluó por un ensayo de supervivencia clonogénico como se describe en otra parte [11]. Brevemente, células MCF-7 (10,000) se sembraron por triplicado en placas de 6 pocillos en presencia de GYY4137, NaHS o ZYJ1122 (200 a 600 mM) durante 10 días hasta que las colonias eran fácilmente visible. Las colonias fueron teñidas con cristal violeta (5% w /v) y las imágenes representativas fueron capturados utilizando un sistema de imágenes Bio 2 ChemiGenius (SynGene Ltd).
En vivo
eficacia de GYY4137
El protocolo experimental animal ha sido descrito previamente [12]. En pocas palabras, femenino, inmunodeficiencia combinada severa (SCID) (17-20 g, 4-6 semanas de edad) fueron criados en casa y mantenerse a lo largo de los aisladores libres de patógenos específicos (SPF). Que crecen exponencialmente células HL-60 y MV4-11 (1 × 10
7) (& gt; 95% de viabilidad) se lavaron dos veces en solución salina tamponada con fosfato y se inyecta por vía subcutánea en la piel suelta entre los omóplatos y la pata delantera izquierda de los ratones receptores. Los animales fueron tratados ya sea con GYY4137 (100, 200 y 300 mg /kg /día, ip) o solución salina (1 ml /kg /día, ip) durante 14 días comenzando 14 días después de la inyección de las células, en cuyo punto los ratones tenían tumores palpables de 100 mm
3 tamaño medio Todos los animales fueron monitoreados de cerca. El peso y el tamaño del tumor se midieron a intervalos diarios. Para la medición del tamaño del tumor, la longitud (L) y el ancho (W) del tumor se midieron con un calibrador, y el volumen tumoral (TV) se calculó como TV = (L x W
2) /2.
Análisis del ciclo celular y Western Blot
células MCF-7 (40.000) se incubaron en placas de 6 pocillos en presencia o ausencia de GYY4137 (400 mM), ya sea para 5 u 8 días. Las células tratadas con ZYJ1122 se utilizaron como control. Para analizar el perfil del ciclo celular, las células se fijaron con 70% v /v de etanol en hielo durante al menos 2 horas y después se tiñeron en una solución de yoduro de propidio (20 mg /ml de yoduro de propidio, 100 mg /ml de RNasa A y 0,1% v /v Triton X-100) durante 15 min a 37 ° C. Las células teñidas fueron luego sometidos a análisis de contenido de ADN por citometría de flujo (Dako cian ADP) y los datos obtenidos fueron procesados utilizando el software Summit (Beckman Coulter). Los lisados celulares de las células MCF-7 se sometieron a SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF). Las membranas fueron bloqueadas en solución salina amortiguadora Tris (TBS) que contenía leche en polvo no grasa (5% w /v) y posteriormente se incubaron con el anticuerpo primario correspondiente (1 mg /ml) a 4 ° C durante la noche. Los anticuerpos utilizados fueron α-PARP, se escindió-α-PARP, α-escindido con la caspasa 9 (Señalización Celular Ltd.) y α-tubulina (Sigma).
El análisis estadístico
La supervivencia celular, IC
50 y tumorales volúmenes se expresan como media ± error estándar (SEM). Para
in vitro
estudios, la supervivencia celular tanto de la falta de tratamiento (NT) y los grupos de tratamiento se analizaron mediante ANOVA de un factor seguido de una prueba t post-hoc. Para
in vivo
estudios, las comparaciones entre el grupo de control del vehículo y diferentes tratamientos de dosis fueron analizados utilizando el modelo mixto lineal para el análisis de datos longitudinal mediante el software SPSS (IBM).
P
. & Lt; 0,05 fue considerado significativo
Resultados
La liberación de H
2S de NaHS y GYY4137 en medio de cultivo
La incubación de cualquiera NaHS o GYY4137 en medio de cultivo dieron como resultado la liberación de cantidades detectables de H
2S como se refleja por un aumento en la concentración de H
2S (M) después de la extracción de alícuotas y ensayo para la formación de azul de metileno. La liberación de H
2S de NaHS fue rápida - alcanzando un máximo en o antes de 20 minutos y la disminución a niveles indetectables por 90 min. En marcado contraste, H
2S liberación de GYY4137 era mucho más bajo (& lt; 10% de la observada con NaHS), pero se mantuvo, siguen siendo superiores a la línea de base hasta por 7 días. Sin autorización de H
2S era evidente a partir de ZYJ1122, un control para GYY4137 carece de azufre y por lo tanto incapaz de formar H
2S, en las mismas condiciones experimentales para un máximo de 7 días (Figura 1A). Las estructuras químicas de GYY4137 y ZYJ1122 se muestran en el recuadro a la figura 1A
.
(A) H
2S-liberación de perfil de NaHS, GYY4137 y ZYJ1122. H
2S liberados de NaHS y GYY4137 (400 M) se determinó en alícuotas (100 l) de medio retirados a intervalos de tiempo (hasta 7 días) a partir de células cultivadas MCF-7. La concentración de H
cantidades 2S se evaluó espectrofotométricamente utilizando N, N-dimetil-p-fenilendiamina-dihidrocloruro y los resultados mostraron que el H
2S de concentración (M). H
2S liberación de GYY4137 fue significativamente diferente (
P Hotel & lt; 0,05) a partir de T = 0 en todos los puntos de tiempo de 0,3 hora hasta 7 días. H
2S liberación de NaHS fue significativamente diferente (
P Hotel & lt; 0,05) a partir de T = 0 en todos los puntos de tiempo de hasta 1,5 horas. No detectable H
2S fue liberado de ZYJ1122 (400 M) bajo CONDICIONES experimentales idénticas. Los resultados muestran la media ± S. E. significa, n = 3. Las estructuras químicas de GYY4137 y ZYJ1122 se muestran en el recuadro. análisis de la curva (B) El crecimiento de las células MCF-7, HL-60 y MV4-11 células tratadas con NaHS, GYY4137 y ZYJ1122 (400 mM) durante 5 días. La supervivencia celular se determinó mediante tinción con azul de tripano. Los resultados muestran el crecimiento celular como un porcentaje relativo al número de células NT en días 5 y son la media ± S.E. decir, n = 3.
Efecto de NaHS y GYY4137 en el crecimiento celular y la viabilidad
El efecto de NaHS, GYY4137 y ZYJ1122 en el crecimiento de líneas celulares de cáncer, es decir, tres MCF-7 (adenocarcinoma de mama), MV4-11 (leucemia promielocítica aguda) y HL-60 (leucemia mielomonocítica), se controló durante 5 días. En cada intervalo indicado, se registró el número de células vivas a partir de cada grupo de tratamiento por triplicado. GYY4137 (400 M) redujo significativamente la proliferación de células de las tres líneas de cáncer mientras que tanto NaHS y ZYJ1122 eran inactivos (Figura 1B).
Para determinar el efecto de dos concentraciones diferentes (400 mM y 800 mM) de GYY4137, NaHS y ZYJ1122 en un panel más amplio de líneas celulares de cáncer humano, supervivencia de las células de otras cuatro líneas celulares de cáncer de diferentes orígenes, es decir, carcinoma cervical (HeLa), carcinoma colorrectal (HCT-116), carcinoma hepatocelular (Hep G2) y osteosarcoma (U2OS ) las células se determinó en comparación con dos fibroblastos normales humanos diploides (WI-38 y IMR90) (Figura 2A). Durante un período de cultivo de 5 días, NaHS (400 mM) no pudo influir en la supervivencia de ninguna de las siete líneas de cáncer probados. En contraste, el efecto de GYY4137 sobre la supervivencia celular era mucho más profunda con 30 a 70% (
P
& lt; 0,01) la muerte en todas las líneas celulares de cáncer a la misma concentración. Una mayor concentración de NaHS (800 M) se tradujo en una mayor, aunque pequeño, la reducción de HCT-116, Hep G2 y MCF-7 supervivencia de las células (aproximadamente 15-30%), aunque de nuevo no hay diferencia significativa en la supervivencia de las células era evidente en HeLa , HL-60, U2OS y MV4-11 células. Por el contrario, GYY4137 a la misma concentración, reduce notablemente la supervivencia por aproximadamente 75 a 95% en todas las líneas celulares de cáncer. El grado absoluto de muerte celular causada por GYY4137 varió entre líneas celulares de cáncer con mayor efecto en HepG2, HL-60, MV4-11, MCF-7 y las células U2OS y menos efecto en las células HCT-116 y HeLa. Por esta razón, los experimentos posteriores se llevaron a cabo usando uno o más de HL-60, MCF-7 y MV4-11 células cancerosas. Es importante destacar que, ni NaHS ni GYY4137 cambiaron significativamente la supervivencia de WI-38 y fibroblastos IMR90 no cancerosas humanas. El compuesto de control que carece de azufre, ZYJ1122, fue sin efecto significativo en la supervivencia de cualquier línea celular, lo que sugiere que los efectos observados de GYY4137 sobre las células cancerosas son probablemente debido a H
liberación 2S. La relación de respuesta a la concentración para GYY4137 (100-1000 m) para reducir la supervivencia celular también se examinó en las células MCF-7, HL-60 y MV4-11 células. El IC
50 valores para este compuesto fueron 337,1 ± 15,4, 389,3 ± 16,8 y 341,8 ± 21,2 M (todo n = 3), respectivamente (Figura 2B).
(A) El efecto del tratamiento (5 día) de una gama de células cancerosas y no cancerosas con NaHS, GYY4137 y ZYJ1122 (400 micras o 800 mM), determinada por tinción con azul de tripano. Los resultados muestran el porcentaje de viabilidad celular a no tratamiento (NT) después de la incubación en ausencia de tratamiento de drogas y son la media ± S.E. decir, n = 3, (
#
P Hotel & lt; 0,05; *
P Hotel & lt; 0,01). (B) Curvas de concentración-respuesta que muestra el efecto del tratamiento GYY4137 durante 5 días en la supervivencia de las células MCF-7, HL-60 y MV4-11 células. Los resultados muestran la media ± S. E. decir, n = 3. (C) muestran fotografías representativas ensayos de supervivencia clonogénico de células MCF-7 después de la exposición (5 días, 200-600 M) a cualquiera de NaHS (fila superior), GYY4137 (fila central) y ZYJ1122 (fila inferior) . NT = no tratamiento.
El efecto de NaHS, GYY4137 y ZYJ1122 (200-600 M) sobre la supervivencia de las células MCF-7 también se evaluó
in vitro utilizando un
clonogénico ensayo. fotografías representativos se muestran en la Figura 2C. Para estos experimentos, células MCF-7 se cultivaron en presencia o ausencia de fármacos y se cultivaron durante un período de 10 días. GYY4137 causó una pérdida dependiente de la concentración de la formación de colonias de células que estaba cerca a la máxima a una concentración de 600 mM. La pérdida de células no fue aparente en tanto NaHS y ZYJ1122 muestras tratadas.
El efecto de GYY4137 (400 m, 5 u 8 días) en células MCF-7 también se examinó mediante análisis del ciclo celular. La población sub-G1 de las células MCF-7 expuestas a GYY4137 fue significativamente mayor (
P
& lt; 0,05) en comparación ya sea a las células no tratadas o las células expuestas a la misma concentración de ZYJ1122 en día 5 (Figura 3A ). Por lo tanto, la población sub-G1 de las células tratadas con GYY4137 representó 7,5% de la población total de células en el día 5 y 14,8% en el día 8 de tratamiento, en comparación con aproximadamente el 1% de las células que, o bien no recibieron tratamiento o fueron expuestos a ZYJ1122 ( Figura 3A). Además, hubo una acumulación significativa de población de células 4N-DNA en las células tratadas con GYY4137 (a 18,6% y 26,6% después de 5 y 8 días de incubación, respectivamente) en comparación con ya sea sin tratar (14,8%) o tratado con ZYJ1122 (14 %) células (Figura 3A). En experimentos adicionales, la posibilidad de que GYY4127 desencadena la muerte de células de cáncer mediante la promoción de la apoptosis también se estudió. Se detectó una fuerte señal para-PARP escindida y la caspasa activado 9 en MCF-7 muestras tratadas con GYY4137 (400 mM, 5 días) con una señal muy reducida en las células tratadas con ZYJ1122 (Figura 3B). Curiosamente, no se observaron la escisión de PARP y no la activación de la caspasa 9 en IMR90 células incubadas con cualquiera de los dos o GYY4137 ZYJ1122
.
(A) Análisis del ciclo celular de las células MCF-7 después de 5 días (NT y ZYJ1122) y 5 y 8 días (GYY4137) de tratamiento de drogas. El recuadro muestra la distribución porcentual de células en cada fase del ciclo celular. Los resultados mostrados son indicativos de 3 experimentos individuales. NT: no tratamiento. (B) Análisis de transferencia Western de los marcadores de la apoptosis (α-escinde-PARP, α-escindido con caspasa 9) de MCF-7 y IMR90 tratados (5 días) con GYY4137 o ZYJ1122 (ambos 400 M). El anticuerpo de la caspasa-9 anti-escindido utilizado detecta el fragmento grande de la caspasa-9 después de la escisión, pero no reconoce sin escindir procaspasa-9. α-tubulina se utilizó como control de carga. Los resultados mostrados son indicativos de 3 experimentos individuales.
Efecto de GYY4137 sobre el crecimiento tumoral
in vivo
El trasplante subcutánea de células HL-60 o MV4-11 resultado en el crecimiento tumoral dependiente del tiempo en el ratón SCID (Figura 4A, B). El volumen del tumor al final del experimento era de 3024 ± 220 mm
3 y 1166 ± 199 mm
3 (n = 4-6) en los animales que recibieron la inyección de vehículo diariamente y administrados células HL-60 y MV4-11 respectivamente . La administración de GYY4137 sobre una base diaria resultó en una disminución significativa (
P
& lt; 0,05) dosis inhibición relacionada del crecimiento tumoral en ambos grupos de animales. GYY4137 (a la dosis más alta utilizada es decir, 300 mg /kg) administrado diariamente durante 14 días redujo el volumen del tumor por 52,5 ± 9,2% (n = 6) y 55,3 ± 5,7% (n = 4) en HL-60 y MV4-11 inyectado animales. Aunque no se midió objetivamente en estos experimentos, el tratamiento GYY4137 no afectó el peso del animal o el comportamiento bruto.
Los cambios en el volumen de los tumores establecidos en (a) HL-60 ratones de xenoinjerto (B) MV4-11 xenoinjerto en ratones tratados todos los días, ya sea con GYY4137 (100, 200 y 300 mg /kg, ip) o vehículo de control. El tratamiento con GYY4137 redujo significativamente el volumen de los tumores tanto en modelos animales, de una manera dependiente de la dosis. Los resultados muestran cambios en el volumen del tumor en S. E. ± media significa (n = 4-6,#
P Hotel & lt; 0,05; *
P Hotel & lt; 0,01).
Discusión
Presentamos aquí que, (i) GYY4137 (pero no NaHS) causa una reducción dependiente de la concentración en la supervivencia de células de cáncer, (ii) ni GYY4137 ni NaHS, utilizando concentraciones idénticas y las condiciones experimentales, afectó a la supervivencia de las células no cancerosas normales es decir, (iii) GYY4137 promovido de células de cáncer (MCF-7), pero no de células normal (IMR90) apoptosis como se indica por la medición de la población sub-G1 y por la observación de PARP escindida y la caspasa 9 escindida y provocó la detención del ciclo celular de las células MCF-7 en el G
2 /M fase, (iv) el h
concentración 2S detectado en medio que contiene las células MCF-7 superó los niveles "basal" de hasta 7 días después de la exposición a GYY4137 pero por menos de 2 horas después de la exposición a NaHS, (v) ZYJ1122, un control para GYY4137 falta de azufre y por lo tanto incapaz de formar H
2S, se inactiva en todos los casos y, (vi) GYY4137 administra diariamente a ratones inmunodeficientes durante 14 días causó una reducción dependiente de la dosis en el tumor de crecimiento provocada por la inyección previa de una de las dos líneas celulares de leucemia humana.
Así, la presente datos revela, por primera vez, un efecto anti-cáncer de la de liberación lenta H
donante 2S , GYY4137. Todas las células de cáncer probadas fueron sensibles a este compuesto aunque en diferentes grados. Está bien establecido que NaHS libera grandes cantidades de H
2S durante un período de tiempo corto. En los presentes experimentos, se muestra que GYY4137, como NaHS, también libera H
2S después de la incubación en un medio de cultivo que contiene las células MCF-7 lo que confirma nuestra observación anterior de la tendencia espontánea H
2S generación en medios acuosos [8]. Desde ZYJ1122 no exhibió actividad anti-cáncer en cualquiera de los
in vitro y modelos llegamos a la conclusión de que la actividad anti-cáncer de ambos GYY4137 y NaHS (a alta concentración) es muy probable que sea H
2S- dependiente. Tal vez resulte sorprendente, GYY4137 exhibió una mayor actividad de eliminación de células cancerosas que hizo NaHS
in vitro
a pesar de que lleva a concentraciones marcadamente más bajas de H
2S en el medio celular. De este modo, la matanza óptima de las células cancerosas por H
2S bajo estas condiciones experimentales se producen principalmente a bajas concentraciones de la propagación de gas durante un período de varios días en oposición a una concentración mucho más alta alcanzada durante un período de tiempo más corto después de la exposición de células a NaHS. Cabe señalar que, mientras que concentraciones relativamente altas de GYY4137 (es decir, 400 a 800 m) son necesarios para este efecto, la concentración efectiva del H
2S generado es mucho menos es decir & lt; 20 mM en base a las mediciones en medio de cultivo. Sin embargo, no podemos descartar la posibilidad de que GYY4137 puede acumularse dentro de las células cancerosas y con ello liberar grandes cantidades de H
2S intracelularmente. Con esta condición en mente, el presente de datos implica que la velocidad a la que se exponen las células a H
2S, así como la concentración de H
2S encontrado es crítico en la determinación de la capacidad de este gas para promover la muerte celular.
Curiosamente, ni GYY4137 ni NaHS causó una destrucción significativa de las células cancerosas es decir, no normales, sugiriendo que el efecto de ambos H
2S donantes es específico para las células cancerosas. El mecanismo de acción del efecto de matar células de cáncer de GYY4137 también ha sido investigado. El tratamiento de células MCF-7 con GYY4137 resultó en la detención del ciclo celular en el G
fase 2 /M y la promoción de la apoptosis como evidencia por el aumento de población sub-G1, así como la presencia tanto de PARP escindida y la caspasa 9. No escinde efecto significativo ya sea en el ciclo celular o en apoptosis fue evidente en las células tratadas con ZYJ1122 de nuevo lo que sugiere que ambos de estos efectos eran secundarias a la exposición continuada de las células a niveles bajos de H
2S. La capacidad de H
2S para causar la muerte de células de cáncer de esta manera no ha sido previamente reportado. Sin embargo, H
2S previamente se ha demostrado que afectan tanto del ciclo celular y apoptosis. Por ejemplo, H
2S promueve la entrada del ciclo celular y la proliferación de célula intestinal IEC-18
in vitro
mediante la activación de MAPK [13]. H
2S también puede exhibir tanto pro- (por ejemplo [14]) y anti- actividad apoptótica (por ejemplo [15]) en función del tipo de célula estudiado y las condiciones experimentales, particularmente la concentración de H
2S utilizado. Un número de dianas moleculares potenciales han sido implicados en el efecto de H
2S sobre la apoptosis incluyendo p38 y la caspasa-3 [15], [16], otros MAPK tales como MEK y JNK [17], así como la producción aumentada de proteína de choque térmico (HSP-90) [18]. Mientras que el mecanismo celular de acción preciso de GYY4137 sigue siendo poco clara, no parece razonable que H
2S, liberado lentamente durante un período de varios días, puede afectar a mecanismos redox dentro de la célula para producir el efecto anti-cáncer. En este sentido, podría ser de interés para evaluar el efecto de los niveles de enzimas en GYY4137 generación de especies reactivas de oxígeno y anti-oxidantes en las células cancerosas.
En conclusión, GYY4137 exhibe actividad de las células contra el cáncer tanto
in vitro
y
in vitro
. Proponemos que GYY4137 se descompone lentamente para producir H
2S que, por una combinación de la detención del ciclo celular y la apoptosis promover, inhibe el crecimiento tumoral. No muerte celular fue evidente en las células no cancerosas. Si tales células simplemente se descomponen H
2S a un ritmo más rápido o si las células cancerosas son especialmente sensibles al efecto letal de este gas queda en estudio. El hallazgo de que las células cancerosas se pueden matar selectivamente cuando se expone a cantidades relativamente pequeñas de H
2S durante un período de tiempo relativamente largo es la clave. Esta observación debe tenerse en cuenta en cualquier trabajo futuro examinar el papel desempeñado por H
2S en la supervivencia de las células cancerosas y también en el desarrollo de nuevos H
2S-basada agentes antitumorales.
Apoyo a la Información
Figura S1.
espectro de 1H RMN de GYY 4137.
doi: 10.1371 /journal.pone.0021077.s001 gratis (TIF)
figura S2. espectro de espectrometría de masas de
GYY 4137.
doi: 10.1371 /journal.pone.0021077.s002 gratis (TIF)
Figura S3.
espectro de 1H RMN de ZYJ1122.
doi: 10.1371 /journal.pone.0021077.s003 gratis (TIF)
figura S4. espectro de espectrometría de masas de
ZYJ1122.
doi: 10.1371 /journal.pone.0021077.s004 gratis (TIF)
Reconocimientos
Estamos muy agradecidos al Dr. Thilo Hagen por sus valiosas sugerencias sobre diseños experimentales, y el Dr. Zhao Yudong por su asesoramiento en
in vivo
análisis de datos. Agradecemos al Dr. Bert Vogelstein para proporcionar línea celular HCT-116.