cáncer
Extracto
Recientes evidencias apuntan a Myc - un factor de transcripción bHLHZip multifacético desregulado en la mayoría de los humanos - cánceres como un objetivo prioritario para la terapia. Cómo orientar Myc es menos claro, dada su participación en una variedad de funciones clave en las células sanas. Aquí nos informe sobre el mecanismo de acción de la molécula que interfiere Myc denomina Omomyc, que demostró una eficacia terapéutica asombrosa en modelos de cáncer de ratón transgénico
in vivo
. acción Omomyc es diferente de la que se puede obtener por eliminación de genes o la interferencia de ARN, los enfoques diseñado para bloquear todas las funciones de un producto génico. Esta molécula - en lugar - parece causar una perturbación de punta específica que destruye algunas interacciones proteína del nodo Myc y mantiene otros intacto, con el resultado de la remodelación de la transcriptoma Myc. Omomyc se dirige selectivamente a las interacciones proteína Myc: se une C- y N-Myc, Max y Miz-1, pero no se une Mad o seleccionar proteínas HLH. En concreto, se impide la unión a Myc promotor cajas E y transactivación de genes diana al tiempo que conserva Miz-1 dependiente de la unión a los promotores y transrepresión. Esto va acompañado de grandes cambios epigenéticos como la disminución de la acetilación y el aumento de la metilación en H3 lisina 9. En presencia de Omomyc, interactoma Myc se canaliza a la represión y su actividad parece cambiar de un pro-oncogénica a un supresor tumoral uno. Dado el impacto terapéutico extraordinario de Omomyc en modelos animales, estos datos sugieren que la orientación con éxito Myc para la terapia del cáncer puede requerir una acción doble similares, a fin de evitar Myc /Max unión a cajas E y, al mismo tiempo, mantener la represión de genes que serían reprimidos por Myc
Visto:. Savino M, Annibali D, N Carucci, Favuzzi E, Cole MD, Evan GI, et al. (2011) El mecanismo de acción del inhibidor de Myc denomina Omomyc puede dar pistas sobre cómo dirigirse a Myc para la terapia del cáncer. PLoS ONE 6 (7): e22284. doi: 10.1371 /journal.pone.0022284
Editor: Laszlo Tora, Instituto de Genética y Biología Molecular y Celular, Francia |
Recibido: 2 de noviembre de 2010; Aceptado: June 23, 2011; Publicado: 21 de julio 2011
Derechos de Autor © 2011 Savino et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de investigación de AIRC, ASI, MIUR y la Fundación Guido Berlucchi (SN), una necesidades del oso Fundación de cáncer Pediátrico subvención (LS), un corto período de la beca de movilidad CNR (SN) y por CNR - becas de doctorado de la Universidad de Sapienza (MS, DA). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
myc reguladores transcripcionales - C-, N- y L-myc - son básicas, hélice-bucle-hélice, cremallera de leucina (bHLHZip) proteínas que se unen a una serie de sitios genómicos a cualquiera de inducir o reprimir la transcripción de genes importantes para el crecimiento celular, el metabolismo y la diferenciación [1] - [4]. Estos factores - especialmente c-myc y N-Myc - están desreguladas en la mayoría de los cánceres humanos. Esto no se debe generalmente a
Myc
mutación genética, pero el resultado de mutaciones que afectan a otras aguas arriba oncogenes o supresores tumorales. así la actividad Myc parece ser necesaria para el desarrollo y mantenimiento de la mayoría de los tumores, incluso cuando inicia por otras causas. En los tumores inducidos por Myc upregulation en ratones transgénicos, aunque breve Myc de-activación desencadena la regresión del tumor acompañado por la detención del crecimiento, diferenciación, y el colapso del sistema vascular del tumor [5]. Myc opera dentro de una red interactoma altamente interconectadas y una posible estrategia para orientar la función oncogénica Myc es la interferencia dominante de las interacciones proteína Myc. A este respecto, Myc dominio de oligomerización - la región bHLHZip - demostró ser capaz de inhibir dominantemente Myc capacidad en las células de fibroblastos de embrión de rata transformación de [6], [7]. Este dominio media la interacción directa con Max y específica secuencia de unión a secuencias específicas de consenso - las cajas E - en los promotores de los genes diana activadas. El dominio bHLHZip también está implicado en la interacción con otros socios - como Miz-1 - que median la represión transcripcional por Myc [4], [8]. Para interferir con Myc interacciones proteína-proteína, hemos desarrollado una molécula dominante negativa mediante la introducción de cuatro mutaciones seleccionadas en la región bHLHZip de c-myc humano. El 90 amino miniprotein ácido resultante - denominado Omomyc por su capacidad para formar homodímeros - es capaz de inhibir c-Myc /asociación Max, para afectar a la activación transcripcional de c-Myc, y para mejorar c-Myc apoptosis dependiente en las células de cultivo de tejidos [9 ], [10]. Se ha demostrado para prevenir el c-Myc papilomatosis inducida
in vivo
sin afectar la homeostasis del tejido [11] lo que sugiere una capacidad de atacar a las células tumorales sin dañar el tejido normal.
A pesar de su papel dominante en humanos cáncer, Myc se reunió con un escepticismo considerable como diana terapéutica desde su requerimiento para la proliferación y mantenimiento de los compartimentos de células madre adultas preocupación por la toxicidad de la inhibición de Myc para los tejidos sanos [12] planteadas, [13]. En parte gracias al trabajo en Omomyc el potencial de Myc como diana terapéutica se ha establecido. Muchas dudas sobre la selectividad para los tumores se han disipado por estudios que muestran que la inhibición transitoria Myc en la piel, el epitelio intestinal y otros tejidos no altera de manera espectacular la homeostasis del tejido [11], [14], [15]. La eficacia y seguridad de la orientación Myc
a la Omomyc
se ha demostrado de manera concluyente por la expresión reversible de Omomyc en modelos transgénicos [16], [17]. expresión sistémica de Omomyc atenúa la proliferación en los tejidos que se dividen rápidamente, pero esto fue bien tolerado; homeostasis del tejido se mantuvo, no se observó apoptosis en los tejidos normales y todos los efectos secundarios fueron rápidamente reversible tras la retirada Omomyc. En los tumores de pulmón accionados-Ras, el impacto de Omomyc fue impresionante. Los ratones que expresan de forma continua Omomyc no desarrollaron adenocarcinoma de pulmón. En los ratones que habían desarrollado cáncer avanzado, la inducción de Omomyc provocó la regresión del tumor que fue acompañada por una proliferación reducida y aumento de la apoptosis del tejido tumoral [16]. Un impacto contra el cáncer análoga fue encontrado en un virus de simio 40 (SV40) impulsada modelo de tumor de islotes pancreáticos [17], en el cáncer de mama (G. Evan, comunicación personal) y glioma (en preparación). Por lo tanto, la manipulación de la función de Myc de manera similar a Omomyc podría tener el potencial de una estrategia eficaz contra el cáncer de varios tipos de tumores.
En vista de las propiedades sorprendentes de esta molécula, es extremadamente relevante para dilucidar su mecanismo de acción. Omomyc efectos biológicos son simplemente los resultados de
tout corte
función de Myc ablación, ya que se produciría con el gen Myc o golpes de gracia de ARNm? Es evidente que, para explicar las notables propiedades de Omomyc es importante entender si son el resultado de la orientación selectiva de la interactoma Myc y sus impactos en los objetivos de Myc activados y reprimidos. Estas cuestiones se abordan en el presente trabajo.
Nuestros datos indican que Omomyc no causa una inhibición global de la función de Myc, pero actúa como una perturbación de punta específica de la interactoma Myc, canalizando su actividad hacia la trans. Esta puede ser la clave para su éxito como un agente anticancerígeno.
Resultados
Omomyc se dirige selectivamente a la Myc interactoma
interacción física directa con la proteína bHLHZip Max es crucial para la función de Myc : el complejo Myc /Max se une al ADN - reconociendo cajas e - y funciona como un activador transcripcional [18]. Omomyc es capaz de homodimerize, para formar heterodímeros con proteínas c-Myc y Max, y para interferir con la formación de c-Myc /Max complejo y unirse a cajas E in vitro [9], [10]. Para abordar mejor Omomyc selectividad se determinó su capacidad de unión N-Myc - que comparte la redundancia funcional sustancial con c-Myc y tiene un papel importante en la formación de tumores en el sistema nervioso -, Mad - se une a un factor de bHLHZip estrictamente relacionado que dimeriza con Max, e-cajas y actúa como represor transcripcional [4] -, Hb y Id1 - dos proteínas HLH representante de una gran familia de reguladores transcripcionales implicados en los procesos de desarrollo [19]. Para evaluar la capacidad de unirse N-Myc se realizaron inmunoprecipitaciones en células 293T que expresan ectópica Omomyc fusionado con el receptor de estrógenos ER ™ - Omomer [10] -, junto con la bandera etiquetada C- o N-Myc. Se encontró que Omomyc obligado a N-Myc de manera similar a c-Myc (Figura 1A), de acuerdo con la identidad virtual de las secuencias de aminoácidos de dominio bHLHZip de proteínas de la familia Myc. Para evaluar la unión a Max, Mad y las dos proteínas HLH Heb (una proteína E) y Id1 hemos realizado ensayos de pull-down con GST ligado a Max, Mad, Hb y Id1 en extractos de células 293T que expresan ectópica Omomyc bandera de etiquetado. Mientras que la unión a Max era fuerte como se informó anteriormente [9], la unión a Mad Omomyc era apenas visible y la unión a Hb y Id1 fue indetectable (Figura 1B). La débil señal en el desplegable GST-Mad es probablemente debido a los altos niveles de expresión de FLAG-Omomyc en las células transfectadas y no reflectantes de la interacción fisiológica entre las dos proteínas. En resumen, hemos encontrado que Omomyc especificidad de unión de proteínas Max y Mad era el mismo que Myc. De manera similar a Myc, Omomyc no parece interactuar con las proteínas HLH y por lo tanto no actúa mediante la interrupción de las redes de proteínas HLH cruciales para el control de la diferenciación [20] - [22]. Luego preguntamos wether Omomyc interactuó con factor inducible por hipoxia 1-alfa (HIF-1α), una proteína que funciona como un regulador transcripcional maestro de la respuesta adaptativa a la hipoxia, juega un papel esencial en la angiogénesis tumoral y muestra una interacción considerable con Myc en la regulación de múltiples genes glicolítico [23] - [25]. HIF-1α contiene un dominio bHLH y antagoniza Myc mediante la unión a Max [24]. Para investigar la unión a HIF-1α Omomyc inmunoprecipitaciones se realizaron en células 293T que expresan ectópica FLAG etiquetados Omomyc junto con HIF-1α. Hemos obtenido (Fig. 1C) que Omomyc no se une HIF-1α, mientras que Max no según lo informado. En conjunto, estos experimentos indican claramente que es la red Omomyc Myc-Max-Mad específico y - dentro de esta red - afecta selectivamente a Myc /Max dimerización, necesario para la unión a Myc E-cajas y de transactivación de un gran número de genes
A) se une Omomyc c-Myc y N-Myc. Inmunotransferencia (BM) con anticuerpos FLAG y ER - como se indica - de inmunoprecipitaciones realizados con anticuerpos de la bandera en las células 293T transfectadas con FLAG-c-Myc o FLAG-N-Myc expresando vectores, junto con el vector que expresa Omomer. B) Omomyc une Max pero no Loco y dos proteínas HLH representativos. Inmunotransferencia (BM) con anticuerpos bandera de pull-down ensayos realizados con GST GST, GST-MAX, GST-MAD, GST-ID 1 y GST-HEB (10 ìg cada una) en las células 293T transfectadas con el vector de expresión de FLAG-Omomyc. células 293T transfectadas con FLAG o ID2-13I [65] vectores que expresan se utilizaron como control positivo para la GST-HEB y GST-ID1, respectivamente. Los extractos de bacterias que expresan Su-MAX se utilizaron como controles positivos para GST-MAX y GST-MAD. C) Omomyc no se une HIF-1α. Inmunotransferencia (BM) con 1 alfa HIF-Max, anticuerpos y la bandera - como se indica - de inmunoprecipitaciones realizados con anticuerpos de la bandera en las células 293T transfectadas con HIF-1α, Max y vectores que expresan FLAG-Omomyc. D) Omomyc une Miz-1. Inmunotransferencia (BM) con anticuerpos Miz-1 y ER - como se indica - de inmunoprecipitaciones realizados con anticuerpos Miz-1 en las células 293T cotransfectadas con vectores que expresan Miz-1 y Omomer
Un aspecto clave de Myc. función es la transrepresión de numerosos genes implicados en el control del crecimiento, la diferenciación y la supresión de tumores [4]. Esta actividad no parece implicar la unión de cajas E directa Myc. Myc se recluta a los promotores de los genes reprimidos sólo indirectamente, tras la interacción con las proteínas que se unen directamente a dichos promotores. El más conocido de ellos es Miz-1, una proteína con dedos de zinc implicado en la represión dependiente de Myc de inhibidores del ciclo celular - p15-INK4b (dependiente de ciclina quinasa 4 inhibidor B) y p21 (CDKN1: dependiente de ciclina inhibidor de quinasa 1) - y en la apoptosis dependiente de Myc en respuesta a la retirada del factor de crecimiento [26] - [29]. Es de suponer que en el complejo con Max, contactos Myc región Miz-1 N-terminal a través de la D394 sitios de aminoácidos y S405 [28] que se encuentra en la región de HLH. A medida que estos sitios no están mutados en Omomyc, la hipótesis de que Omomyc retiene la capacidad de unirse Miz-1. Pusimos a prueba esta posibilidad, mediante inmunoprecipitación de células 293T que expresan ectópica Omomer y Miz-1. Figura 1D demuestra que Omomyc interactúa directamente con Miz-1. Endógeno Miz-1 se informó a acumularse en el citoplasma de las células, con una fracción menor en el núcleo; Myc provoca la translocación nuclear de Miz-1 y el secuestro en focos discretos subnuclear [30]. Para investigar la interacción y la localización intracelular de Omomyc, Omomyc /Miz-1 y /complejos de c-Myc Omomyc, 293T transfectadas las células con FLAG etiquetados Omomyc o c-Myc expresando plásmidos junto con plásmidos que expresan sin etiquetar Miz-1 y c-Myc, y se detecta la localización de proteínas mediante inmunofluorescencia con anti FLAG, c-Myc, y los anticuerpos Miz-1 (Figura 2). En las células transfectadas con individuales plásmidos de expresión, Miz-1 era en su mayoría (aproximadamente 90%) localizada en el citoplasma como se informó anteriormente [30], Myc estaba presente exclusivamente en el núcleo como se esperaba, y Omomyc fue en gran medida en el núcleo (alrededor de 85% ) con una parte menor en el citoplasma (Figura 2). Omomyc carece de la señal de localización nuclear de las proteínas Myc: puede entrar en el núcleo debido a su pequeño tamaño o la dimerización con Myc endógena o Max. Cuando se co-transfectadas, las proteínas más Myc co-localizada con Omomyc en el núcleo; una fracción de Omomyc permaneció en el citoplasma - no está asociado a Myc - probablemente debido a un mayor nivel de expresión. expresión Myc ectópico activa la translocación nuclear de Miz-1 (aproximadamente 40%) y la formación de focos subnuclear discreta, como se informó anteriormente [30]. Miz-1 fue vuelto a poner en parte en el núcleo, en presencia de un Omomyc overexpressed así (aproximadamente 35%). Endógeno Miz-1 - que está presente en bajas cantidades dentro de las células [30] -. Será presumiblemente principalmente en el núcleo, en presencia de un Myc sobreexpresada o Omomyc
fotomicrografías A) de inmunofluorescencia de células 293T transfectadas con Miz -1, c-Myc, FLAG-c-Myc y FLAG-Omomyc plásmidos que expresan - como se indicó anteriormente paneles - y se tiñeron con anticuerpos contra FLAG (verde), Miz-1 (rojo) y c-Myc (rojo) como se indica en el interior paneles. Los núcleos de los mismos campos se tiñeron de azul con DAPI (4,6-diamino-2-fenilindol). B) La cuantificación de los experimentos mostrados en A), basadas en el examen de microscopía de campo 15 y al menos tres réplicas biológicas.
En conjunto, estos resultados demuestran que la perturbación de la interactoma Myc por Omomyc no resulta Sólo a partir de la inhibición de la unión a Myc Max - que se requiere para la unión caja e y la transactivación - sino también de la interacción de Omomyc con Miz-1, una pareja de unión Myc involucrado en la transrepresión
Omomyc afecta al. respuesta transcripcional de los fibroblastos al suero estimulación
proteínas Myc son capaces de unirse a un 10-20% de loci genómico y para modular la expresión de cientos a miles de genes. Omomyc se mostró a deteriorar la transactivación del gen diana Myc activa
cad Hoteles en fibroblastos Rat1 y no afectar a la regulación por disminución de la Myc reprimidos destino
GADD45
[10]. Para obtener una visión generalizada cambios de expresión génica influenciados por Omomyc, analizamos la respuesta transcripcional a la estimulación con suero de fibroblastos Rat1 establemente infectadas con un Omomer producir o un retrovirus vacía (Rat1-Omomer y las células de control Rat1, respectivamente, como se describe en [ ,,,0],10]). c-Myc se sabe que se downregulated por privación de suero e inducida bruscamente mediante la adición de suero - junto con una serie de otros genes tempranos inmediatos - alcanzando un pico después de 1 a 2 h; la inducción de c-Myc tiene un papel en el ciclo celular de re-entrada [31] - [33]. Además de la proliferación celular, la respuesta de suero de fibroblastos integra otros procesos - e. gramo. cicatrización de la herida [34] - y genes de suero regulado incluyen genes que son regulados por Myc, así como genes que no son. Las células fueron privadas de suero antes de la estimulación con suero y la expresión del ARNm se analizaron en el momento de suero re-adición (tiempo 0) y 90 'a partir de entonces - un punto de tiempo en el que la inducción de Myc es máximo - de modo que la inducción de un objetivo directo Myc debería estrechamente seguir la expresión de Myc. la expresión de ARNm se analizó a través de una matriz que contiene sondas de oligonucleótidos de aproximadamente 7.000 secuencias de longitud completa y 1.000 (etiquetas de secuencias expresadas) EST agrupaciones. Los datos están disponibles en la base de datos GEO con el siguiente número de acceso: GSE25039. los valores de expresión de mRNA relativa (pliegue Cambios) se calcularon tomando como referencia las células Rat1 de control en el tiempo 0; sólo los genes que muestran un pliegue del cambio de al menos +3 (genes regulados positivamente) o -3 (genes regulados negativamente) se tomaron en cuenta. En el momento de la estimulación con suero, Omomer expresar y control de las células Rat1 muestra un perfil prácticamente idéntica expresión de genes (Figura 3, parte superior). A los 90 minutos de la inducción de suero se upregulated 111 secuencias y 96 downregulated en las células de control Rat1. Sorprendentemente, una regulación a la baja pronunciada se observó en las células Rat1-Omomer: el mayor número de 516 secuencias de genes se downregulated y upregulated 143 (Tabla S1). En general, el número total de secuencias cuya expresión era arriba o downregulated en presencia de Omomyc después de 90 minutos de estimulación con suero ascendió al 8,2% de las sondas en la matriz. Entre las secuencias downregulated en presencia de Omomyc, 475 representados genes con un GeneID conocido (identificación de genes) y otros 41 regiones transcritas. Para averiguar si los genes regulados negativamente en la presencia de Omomyc también se validaron los objetivos de Myc los comparamos con el conjunto de genes que figuran en la base de datos Myc gen del cáncer (www.myccancergene.org), una colección de Myc genes de respuesta identificados en estudios independientes a través de una variedad de técnicas [35]. 115 (24%) de los 475 genes regulados negativamente en la presencia de Omomyc fueron listadas en la base de datos de genes diana Myc: 45 figuraban como upregulated y 35 como downregulated de Myc, mientras que la regulación hacia arriba o hacia abajo de los 35 genes restantes se desconocía. Para señalar blancos directos Myc dentro de la lista de genes regulados negativamente en la presencia de Omomyc, la lista se cruzaron con los de dos estudios que utilizaron Chip análisis para definir genoma amplia promotor de ocupación por Myc en células madre embrionarias (ES) las células [36], [37]. 31,5% de los genes regulados negativamente en la presencia de Omomyc tenía promotores que fueron reportados estar ligado directamente por Myc en células ES (P-valor: 1.3 × 10
-24), en comparación con 19% en su ausencia (P- valor: 3 × 10
-2). En total, 44,4% de la Omomyc downregulated genes resultaron ser objetivos Myc auténticos de acuerdo con cualquiera de la base de datos objetivo genes Myc o la lista de Myc promotores unidos en células madre embrionarias (diagrama de Venn: Figura 4A). Los genes comunes a los tres grupos se agrupan en una dimensión en la figura 4B. Tal un gran - aunque incompleta - solapamiento entre los genes cuya regulación a la baja se asoció a la activación Omomer en fibroblastos Rat1 y validado objetivos Myc es altamente significativa. Que el solapamiento es incompleta es coherente con otros análisis de expresión y computacionalmente derivados conjuntos de genes [38], [39], y podría deberse en parte a otros efectos del suero. Figura 3 (medio) muestra la clasificación en categorías funcionales basados en GO (Gene Ontología términos). Como se informó de los genes asociados con la actividad de c-Myc [36], [40], [41], los genes afectados por Omomyc caen en múltiples clases funcionales que implican el crecimiento, metabolismo, vías de señalización celular, la progresión del ciclo celular y la apoptosis. En particular, los genes regulados negativamente en la presencia de Omomyc fueron enriquecidos en categorías - nucleótidos y metabolismo de los ácidos nucleicos - que están sobrerrepresentados entre los objetivos regulados positivamente por c-Myc [36], [40] - [42], que apoya la idea de Omomyc como un inhibidor de Myc transactivación mediada (Figura 3, abajo). Objetivos conocidos que se upregulated por Myc y consideró downregulated por Omomyc incluyen genes que codifican proteínas implicadas directamente en la traducción y montaje ribosoma - tales como el factor de iniciación de la traducción Eif3s9, el factor de elongación de la traducción Eef1a1, y la proteína ribosomal L3 y S4 -, así como los genes que codifican enzimas metabólicas - isocitrato deshidrogenasa 2, lactato deshidrogenasa B y fosfoglicerato quinasa 1 -, proteínas implicadas en la progresión del ciclo celular - la subunidad complejo promotor de la anafase Anapc5, ciclina B1 y ciclina D1 -, el TIP49 ATPasa /helicasa de ADN (Ruvbl1) , y la HMGB1 proteína de la cromatina estructural. HMGB1 tiene un papel importante en la remodelación de la cromatina y es un mediador de la inflamación cuya sobreexpresión se asocia con muchos tipos de tumores [43]. TIP49 es un importante cofactor Myc, que participan en Myc de la transcripción y funciones oncogénicas [44]. Varios genes que se encuentran downregulated por Omomyc y se sabe que Myc reprimidos objetivos codifican proteínas implicadas en rutas de señalización, la adhesión celular y la transcripción - como Akt1, ErbB2, c-Jun y el factor de crecimiento de fibroblastos receptor Fgfr1 - mientras que
MXI1
codifica una proteína que interactúa con Max y regula negativamente la función Myc.
MXI1
es reprimida por Myc [45], pero activado por HIF-1α [46], [47]. Los defectos en este gen se han reportado en cáncer de próstata y en un subconjunto de glioblastomas [48], [49].
Omomyc promueve regulación a la baja de numerosos genes. Parte superior. Muchos más genes se downregulated en células Rat1 que expresan Omomer (Omomer) que en las células que no lo hacen (Control) en 90 'después de la estimulación de suero de fibroblastos Rat1 en presencia de tamoxifeno. El número de genes regulados positivamente era similar. Se tomaron células de control Rat1 en el tiempo 0 como referencia. Medio. La distribución en las diferentes clases de procesos biológicos - basado en la clasificación de ontología de genes - de los genes downregulated a 90 'después de la estimulación de suero en las células Omomer y control. Fondo. Genes relacionados con el metabolismo de nucleótidos y ácidos nucleicos son los más significativamente más representadas - como calculada por el software Panther -. Entre los genes regulados negativamente en presencia de Omomyc (células Omomer en presencia de tamoxifeno)
a) diagrama de Venn que ilustra el solapamiento entre los genes regulados negativamente por Omomyc en el presente estudio, los genes que figuran como objetivos de Myc en la base de datos del gen diana Myc (www.myccancergene.org), y los genes reportados a estar directamente vinculada por c-Myc en ES las células [29], [38]. Dentro de la base de datos del gen diana Myc y los conjuntos de datos de células madre embrionarias, sólo los genes que tenían una sonda en la matriz de Affymetrix U34A se tuvieron en cuenta. B) La superposición de buena fe, Myc genes diana fueron extraídos de nuestra base de datos y agrupados en una dimensión. C) el nivel de expresión relativa (doble cambio) - medida por PCR en tiempo real a los 90 minutos después de la estimulación de suero en presencia o ausencia de 4-OHT - de
CCND1
,
Eif3s9
,
PGK1
,
Akt1
,
ErbB2
,
Gadd45a
,
MXI1
ARNm de tipo salvaje (izquierda) y nula Myc (derecha) células Rat1 que expresan Omomyc inducible tamoxifeno (Omomer).
CCND1
,
Eif3s9
,
PGK1
representan Myc activa objetivos;
Akt1
,
ErbB2
,
Gadd45a
,
MXI1
representan Myc reprimidos objetivos. Expresión en el momento de la adición de suero (tiempo 0) se tomó como referencia para calcular el cambio veces.
A fin de validar nuestros resultados, hemos realizado ensayos de PCR en tiempo real en el tipo salvaje y fibroblastos Myc nula Rat1 expresando el tamoxifeno inducible Omomyc (Figura 4C). Comparamos - a los 0 y 90 minutos de estimulación con suero - los niveles de expresión de una muestra seleccionada de genes afectados por la estimulación de suero que son conocidos por ser reprimidos -
Gadd45a
,
MXI1
,
ErbB2
,
Akt1 CD - o activado -
PGK1
,
Eif3s9
,
CCND1 CD - por Myc [40], [45 ], [50]. Estos genes, como cualquier gen, no son objetivos exclusivos Myc, y otros factores de transcripción moduladas o no por el suero puede contribuir a su regulación. Se encontró que los niveles de expresión de los objetivos reprimidos
Gadd45a
,
MXI1
,
ErbB2
y
Akt1 Hoteles en células Rat1 tipo salvaje no se vieron afectados o incluso más reprimida en presencia de Omomyc mientras que la regulación positiva de los blancos activados
PGK1
,
Eif3s9
y
CCND1
fue comprometida (Figura 4C, izquierda). En las células nulas Myc, encontramos que Omomyc no afectó significativamente la expresión de lo reprimido y no afectó al regulación al alza de los blancos activados (Figura 4C, derecha). Por lo tanto el efecto de Omomyc en la transcripción de Myc activa objetivos parece requerir alguna actividad de Myc.
En resumen, estos resultados indican que Omomyc no lo hace a nivel mundial inhibir la función de Myc en la regulación transcripcional de los genes diana y sugieren que selectivamente perturba el transcriptoma Myc Myc al obstaculizar la transactivación mediada y la preservación de Myc mediada por la represión.
Omomyc afecta diferencialmente transactivación y la represión al influir en la unión a Myc objetivo promotores de genes
para investigar los mecanismos implicados en la regulación de genes de Omomyc, hemos realizado ensayos de reportero y de inmunoprecipitación de la cromatina (cHIP) de luciferasa en dos genes que codifican la proteína nucleolar nucleolina y el p21 inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina, que representan, respectivamente objetivos genuinos y directos de la activación mediada por Myc y la represión [51], [52]. c-Myc es capaz de activar
nucleolina
transcripción a través de dos cajas E altamente conservadas en el intrón 1 [51]. Para poner a prueba la capacidad de Omomyc para inhibir Myc mediada por la activación transcripcional, hemos realizado ensayos de reportero en células 293T transfectadas con el plásmido pNucL14 [51] indicador de luciferasa - que contiene el ratón
nucleolina
promotor, el exón 1, intrón 1 y el primeros 8 nt del exón 2 - junto con diferentes combinaciones de FLAG-c-Myc y Omomyc plásmidos de expresión (Figura 5A). Hemos encontrado que inhibe Omomyc Myc mediada por la activación del indicador de luciferasa de una manera dependiente de la dosis, mientras que no afecta a su actividad basal. Para probar si la inhibición de
nucleolina
transactivación por Omomyc se debió a una reducción de la unión del promotor, que mide la cantidad de Myc unido al
nucleolina
promotor en células 293T transfectadas con
nucleolina
reportero, FLAG-c-myc y Omomyc plásmidos que expresan. La recuperación de
nucleolina
ADN coprecipitado con Myc se cuantificó por PCR en tiempo real, utilizando cebadores localizados alrededor de las dos cajas E en
nucleolina
intrón 1. Se encontró que Omomyc causó una reducción del 40% de la cantidad de promotor ligado Myc (Figura 5B, izquierda). Además de competir para la asociación Myc /Max, Omomyc es capaz de formar homodímeros así como dímeros Omomyc /Max: sólo los últimos se unen cajas E
in vitro
con una alta eficiencia [9]. Por lo tanto, podría afectar Omomyc Myc unión a ADN a través de dos mecanismos concurriendo: inhibición de Myc /Max dimerización, así como la competencia directa para la caja E de unión. Para evaluar esta última, que mide la cantidad de Omomyc unido al
nucleolina
promotor en las células transfectadas con c-Myc y FLAG-Omomyc expresando plásmidos (Figura 5 B, derecha). Se encontró que Omomyc fue reclutado específicamente a la caja E que contiene la región en el intrón 1 y que competía con c-Myc de la unión a esta región. En conjunto, estos datos indican que Omomyc puede afectar a la transactivación por el secuestro de Myc en complejos incapaz de unirse a E-cajas, así como actuando - presumiblemente en asociación con Max -. Como inhibidor competitivo de los complejos de Myc /Max para la unión E-Box
Una actividad) de la luciferasa del ratón
nucleolina
promotor reportero plásmido - pNucL14 - transfectadas en células 293T junto con FLAG-c-myc y Omomyc vectores que expresan. Los datos se normalizaron por cotransfección de PRL-TK Renilla luciferasa. La actividad basal del reportero se establece en un valor de 100. B) Ensayo cuantitativo chip de Myc y Omomyc unión a la
nucleolina
región promotora (NCL; barras grises). A la izquierda: FLAG-c-Myc vinculante en células 293T transfectadas con el
nucleolina
reportero pNucL14 junto con FLAG-c-myc y Omomyc plásmidos que expresan. Derecha: FLAG-Omomyc unión en las células 293T transfectadas con el
nucleolina
reportero junto con FLAG-Omomyc y c-Myc plásmidos que expresan. Una región del
luciferasa
secuencia de codificación (Luc; barras negras) se utilizó como control. Las barras representan el porcentaje de ADN de entrada inmunoprecipitado, después de la sustracción del fondo. valores de las fichas se expresan como% de ADN de entrada
Para investigar cómo Omomyc puede actuar para apoyar Myc mediada por la represión, se llevaron a cabo ensayos en el ser humano
p21
promotor -. específicamente la secuencia comprendida entre -194 y +16 del sitio de inicio de la transcripción - Myc en la que es reclutado por la proteína de zinc dedo Miz-1 [27], [52]. Hemos realizado ensayos de reportero y se encontró que la expresión de luciferasa impulsado por el humano de longitud completa
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promotor - p21Cip1-Luc [53] - fue inhibida por c-Myc y que Omomyc era sinérgico con c-Myc (Figura 6A ). Es interesante - incluso en ausencia de un cotransfected c-Myc - Omomyc provocó
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promotor de la represión a niveles similares a los causados por c-Myc. Por lo tanto Omomyc es capaz de soportar
p21
promotor represión tanto en presencia como en ausencia de una c-Myc sobre-expresado. Para investigar si esto se asoció a una mayor promotor de unión, se realizaron ensayos de chip en células 293T transfectadas con el reportero p21 junto con FLAG-Myc y aumentar la cantidad de Omomyc plásmido. Hemos observado que Omomyc aumentó notablemente c-Myc unión a la región de -194 a 16 (Figura 6B, parte superior). Curiosamente, el ensayo de reciprocidad en las células transfectadas con FLAG-Omomyc aumentando así la cantidad de c-Myc plásmido indicó que Omomyc era capaz de interactuar con el mismo
región p21
promotor (Figura 6B, parte inferior). En este caso, la sobreexpresión Myc no competir con la unión Omomyc.