Extracto
El cáncer de pulmón es causada por diversas combinaciones de mutaciones genéticas. A continuación, para entender la importancia de los receptores nucleares (NR) en la patogénesis del cáncer de pulmón oncogén asociado, se investigó el perfil de expresión de la totalidad de los 48 NR miembros mediante QPCR análisis en un panel de células epiteliales bronquiales humanas (HBECs) que incluía precancerosa y HBECs tumorigénicas albergar oncogénicos
K-ras
V12 y
o
p53 /
alteraciones. El análisis del perfil reveló que las alteraciones oncogénicas acompañados transcripcional cambios en la expresión de 19 NR en HBECs precancerosas y 15 NR de acuerdo con la progresión maligna de HBECs. Entre estos, el proliferador de peroxisomas receptor gamma activado (PPAR), un grupo NR elegido como un estudio de prueba de principio, mostraron una mayor expresión en HBECs precancerosas, que sorprendentemente se invirtió cuando estos adquieren plena HBECs
in vivo
tumorigenicidad . Cabe destacar que la activación de PPAR mediante tratamiento tiazolidindionas (TZD) revirtió el aumento de la expresión de la ciclooxigenasa proinflamatoria 2 (COX2) en HBECs precancerosas. En HBECs completamente tumorigénicas con expresión inducible de PPAR, los tratamientos TZD inhibió el crecimiento de células tumorales, clonogenecity, y la migración celular de una manera dependiente de PPAR-sumoylation. Mecánicamente, la sumoilación de liganded-PPAR? Disminución de la expresión de COX2 y aumento de la expresión 15-hidroxiprostaglandina deshidrogenasa. Esto sugiere que sumoylation mediada por ligando de PPAR juega un papel importante en la patogénesis del cáncer de pulmón al modular el metabolismo de la prostaglandina
Visto:. Kim J, Sato M, Choi JW, Kim HW, Yeh BI, Larsen JE, et al . (2015) Expresión de receptores nucleares y función en el cáncer de pulmón humano Patogénesis. PLoS ONE 10 (8): e0134842. doi: 10.1371 /journal.pone.0134842
Editor: Geun Seok-Lee, de la Universidad de Kyung Hee, Corea, República de
Recibido: 4 Febrero 2015; Aceptado: July 15, 2015; Publicado: 5 Agosto 2015
Derechos de Autor © 2015 Kim et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. la Fundación Nacional de Investigación de Corea financiado por el Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología (NRF-2013R1A1A1A05005075 a YJ). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la superfamilia de receptores nucleares comprende 48 miembros de factores de transcripción que son en su mayoría ligando-activado y juegan un papel crucial en diversos procesos fisiológicos, incluyendo el metabolismo, el desarrollo y la diferenciación en el cuerpo. La desregulación de las vías de NR causa enfermedades crónicas graves como la diabetes [1-3], aterosclerosis [4, 5], y varios tipos de cáncer [6-8]. La expresión de toda la superfamilia NR se ha investigado en diversas condiciones fisiológicas y patológicas, incluyendo modelos celulares de diferenciación [9-12], sistemas anatómicos ratón [1], el panel NCI60 de líneas celulares de cáncer humano [6], y líneas celulares de cáncer de pulmón humano y muestras de pacientes [7, 8]. Estos estudios han revelado que los subconjuntos de NR no sólo están asociadas con la fisiología de los tejidos específicos, pero también son relevantes para la diferenciación funcional en linajes celulares específicos [13, 14]. Además, la firma genética de la superfamilia de NR o de los miembros individuales NR es un biomarcador de pronóstico para el cáncer de pulmón, y algunos NR son objetivos druggable que pueden ser farmacológicamente desarrollaron en potenciales tratamientos contra el cáncer [6-8, 15-19]. De hecho, varias líneas de evidencia indican que NR individuales están asociados con la aparición y el desarrollo, así como el tratamiento o la quimioprevención del cáncer. Por ejemplo, la sobreexpresión de retinoico alfa del receptor de ácido (RAR) debido a su fusión a PML (RAR /PML) y los receptores de estrógenos alfa (ER) expresión causa la aparición de la leucemia y la progresión del cáncer de mama, respectivamente [20-22]. Orientación de ER usando el modulador selectivo del receptor estrogénico (SERM) tamoxifeno o raloxifeno y el bloqueo o ablación de la dihidrotestosterona (DHT), que es el ligando endógeno más fuerte para el receptor de andrógenos (AR), son bien conocidos esquemas terapéuticos en las clínicas de cáncer para el tratamiento de la correspondientes tipos de cáncer [19, 23-25]. Mientras SERMs han sido ampliamente utilizados para el tratamiento de cáncer de mama o incluso evaluado clínicamente como agentes quimiopreventivos contra la incidencia de cáncer de mama, un alto riesgo uterino y la incidencia de cáncer de endometrio se ha informado anteriormente [26, 27] de. Del mismo modo, aunque las TZD drogas anti-diabéticos están en ensayos clínicos para el tratamiento del cáncer de pulmón, la función molecular de la PPAR-activado TZD no ha sido claramente todavía definido como un factor anti-tumorigénico en el cáncer de pulmón, o incluso argumentado como un tumor de promoción factor en otros tipos de cáncer, es decir, cáncer de mama y cáncer de próstata [28-30].
Hemos desarrollado un modelo preclínico que implica inmortalizado células epiteliales bronquiales humanas normales (HBECs) que puede ser manipulada genéticamente con los cambios oncogénicos específicos para estudiar la patogénesis del cáncer de pulmón y el desarrollo de nuevos enfoques específicos para el diagnóstico precoz, la prevención y el tratamiento del cáncer de pulmón. Recientemente, hemos sido capaces de desarrollar modelos totalmente progresado y tumorigénicos con HBECs basado en la manipulación de p53, KRAS, y c-myc [31]. Estos modelos precancerosas y completamente tumorigénicas proporcionan un sistema ideal para estudiar el papel de los RN en la patogénesis del cáncer de pulmón incluyendo preneoplasia y la formación de tumores.
En este estudio, hemos perfilado la expresión de mRNA de los 48 rupias en este HBEC oncogene- inducida de pulmón modelo de la patogénesis del cáncer [32, 33]. Esto nos permitió identificar un papel clave en la patogénesis de PPAR cáncer de pulmón. En un estudio mecanicista de prueba de principio, se encontró que PPAR sumoylation es importante para el efecto anti-tumorigénico de TZD en la patogénesis del cáncer de pulmón. Este estudio proporciona información sobre una modificación bioquímica de PPAR, que es útil para la comprensión de la patogénesis del cáncer de pulmón y también indica la potencia de este sistema preclínico para estudiar el papel de los RN en la patogénesis del cáncer de pulmón y estos resultados debe tener un valor de traslación clínica.
Materiales y Métodos
cultivo de células
Como se informó anteriormente, las células epiteliales bronquiales humanas normales fueron inmortalizados por CDK4 y hTERT (HBEC-KT), seguido de la introducción más estable de alteraciones oncogénicas incluyendo K-ras
sobreexpresión v12, desmontables de p53, o ambas cosas [31-33]. Una serie de HBEC-KTs incluido HBEC-KT, HBEC-KTZ, HBEC-KT + + pSRZ pLenti-
K-ras
v12 gratis (HBEC-KTR
L ), HBEC KT + pSRZ-
p53
shRNA + pLenti-
lacZ gratis (HBEC-KT53), y HBEC KT + pSRZ-
p53
shRNA + pLenti-
K-ras
v12 gratis (HBEC-KTR
L53), donde pSRZ y PLENTI representan shRNA vectores de lentivirus y estables, respectivamente [31]. HBECs inmortalizadas y clones HBEC tumorigénicas (C1 y C5) se cultivaron en K-SFM (Gibco, Gaithersburg, MD, EE.UU.) suplementado con 50 g /ml de bovino Pituitaria Extraer sin factor de crecimiento epidérmico (EGF) y RPMI suplementado con 10% fetal de suero bovino, respectivamente.
la clonación molecular y la línea celular estable
Ambos genes PPAR y mejorado la proteína de fluorescencia verde (EGFP) flanqueado por sitio de entrada ribosomal interno se construyeron bicistronically bajo el control de inducible por tetraciclina (Tet /On) promotor de citomegalovirus del vector lentiviral (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). mutaciones dirigidas al sitio se introdujeron en ambos sitios sumoylation (K79R y K367R para PPARγ1; K107R y K395R de PPAR? 2) en PPAR. Los lentivirus se produjeron y se transdujeron en líneas celulares HBEC-C1 tumorigénicas. Además proceso de selección se llevó a cabo para seleccionar un clon HBEC-C1-PPAR en el que tanto PPAR y la expresión de EGFP son estrictamente regulados por tratamiento tetraciclina.
inmunotransferencia análisis
Un panel de líneas de células inmortalizadas se HBEC se cultivaron en presencia o ausencia de PPAR troglitazona agonista o pioglitazona durante 48 horas y a continuación, los lisados celulares totales se prepararon como se describe anteriormente [7]. Los anticuerpos primarios para la señalización celular incluidos para anticuerpos contra p53 (sc-126, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.), K-ras (SC-30, Santa Cruz), fosfo-MEK1 /2 (# 9121, la señalización celular Technology, Beverly, MA, EE.UU.), MEK1 /2 (# 9122, Cell Signaling), COX2 (sc-19999, Santa Cruz), fosfato ERK1 /2 (# 9101, Cell Signaling), ERK1 /2 (# 9102, señalización celular), β-actina (Ab6276, Abcam, Cambridge, Cambridgeshire, Reino Unido), lamina A /C (sc-7292, Santa Cruz), y PPAR (# 2435, la señalización celular). Los anticuerpos primarios para la progresión del ciclo celular incluyen anticuerpos contra cyclinD1 (# 2926, Cell Signaling), ciclina A (sc-239, Santa Cruz), p16
TINTA (sc-468, Santa Cruz), y p21
WAF1 ( OP64, Calbiochem, La Jolla, CA, EE.UU.).
El crecimiento celular y la formación de colonias de ensayo
Cell ensayo de recuento se llevó a cabo para medir las respuestas de crecimiento celular. Para el ensayo de recuento de células, dos cientos de HBECs se sembraron en placas de 96 pocillos en un volumen de medio final de 100 l por pocillo, seguido de tratamiento con troglitazona en concentraciones de 3 mM, en presencia de 100 nM sintético RXR LG268 ligando. El número de células se contó a los cinco días post-tratamiento. crecimiento relativo% se normalizó para cada dosis de tratamiento con vehículo. Para el ensayo de formación de colonias, cinco miles de células HBEC haya sido dividido en placas de 6 pocillos y se trataron con ligandos de PPAR o PPAR. Las colonias se tiñeron con azul de metileno después de 7 a 10 días de tratamiento ligando.
La migración de células de ensayo
HBECs con expresión inducible de WT-PPAR? O SUMO-PPAR se sembraron en placas de 6 pocillos y totalmente crecido con 100% de confluencia, seguido de tratamiento con mitomicina C para suprimir la proliferación celular. Una herida se formó por el rascado capa de células con punta de pipeta estéril. Después las células se incubaron en medio RPMI 1640 que contenía suero bovino fetal al 5% con o sin inducción de tetraciclina para la expresión del receptor, y seguido de tratamiento ligando. La migración celular se midió después de 24 horas de tratamiento ligando PPAR contando el número de células migradas en las áreas heridas.
informe de ensayo de luciferasa
HEK 293 células fueron co-transfectadas con la cantidad equivalente (15 ng ) de cualquiera de los plásmidos de expresión o de control de plásmidos para la de tipo salvaje (wt-PPAR?) o mutante sumoylation (SUMO-PPAR?) de PPAR en combinación con un plásmido informador de luciferasa de elemento de respuesta a PPAR (TK-PPRE3x-Luc, 50 ng) y un beta- galactosidasa plásmido (β-Gal, 20 ng) para la normalización de la eficacia de transfección. Las células se trataron entonces con vehículo (EtOH), 1 M de pioglitazona o troglitazona y se ensayaron para actividad de luciferasa.
Reverse transcripción y QPCR ensayo
se prepararon Todos los ARN utilizando el kit de Qiagen y inversa transcrito en cDNA para el ensayo de QPCR (método TaqMan) como se describe anteriormente [12]. La transcripción inversa del ARN total de 2 g en 100 l de volumen de reacción se ajustó además a un 200 volúmenes finales l. El software SDS versión 2.1 se utilizó para detectar el tiempo real de reacción PCR realizada en el sistema ABI 7900HT. Los ensayos de curva estándar de eficiencia corregida se optimizaron para, la comparación no sesgada multidisco como se describe anteriormente [8].
Datos QPCR análisis
Una macro se creó para analizar los datos en bruto importados a Microsoft Excel. La eficiencia PCR (e), se calculó como e = 10
[- 1 /pendiente] donde la pendiente se obtiene a partir de la curva estándar por SDS software 2.1, por la referencia 18S y NR de interés. La macro incluye los siguientes cálculos estadísticos. La cantidad media (Avg.) Para las muestras individuales se deriva de la cantidad relativa media de triplicados, cuando la cantidad es igual ae
-Ct (es decir,
cantidad
= (10
[- 1 /pendiente])
-Ct). El coeficiente de variación (CV) puede obtenerse dividiendo la desviación estándar de la media (STDEV) por la cantidad media (avg.), CV = STDEV /promedio. El punto atípico estadístico fue excluido si era & gt; 17% CV. Mediante el uso de estas cantidades para ambos 18S y NR de interés, el valor normalizado para cada expresión se calculó NR más lejos de la división de NR promedio de la cantidad promedio de cantidad de referencia. (Es decir, valor normalizado = NR cantidad promedio /cantidad de referencia promedio). Además, la desviación estándar para el valor normalizado se calculó como S.D. = (Valor normalizado) X {(CV de referencia)
2 + (CV de NR)
2}
1/2.
Resultados
Caracterización de inmortalizado HBECs
El esquema general para la generación de HBECs inmortalizadas y tumorigénicas se muestra en la figura 1A. Para entender el efecto de las alteraciones oncogénicas en el potencial tumorigénico de las células epiteliales bronquiales, hemos generado previamente un panel de HBECs inmortalizadas que alberga ya sea
K-ras
V12
expresión, desmontables p53, o ambos cambios, que son las principales mutaciones en el cáncer de pulmón [32, 33]. El uso de un modelo de xenoinjerto de ratón, clones HBEC, C1 y C5, se identificaron ser tumorigénicos y caracterizado. caída estable de p53 se confirmó para ambos ARNm y la expresión de proteínas usando el ensayo de QPCR y análisis de inmunotransferencia, respectivamente (Fig 1B y S1 Fig). La actividad oncogénica de
K-ras
V12
de forma estable introduce en las líneas celulares inmortalizadas HBEC fue confirmado por la fosforilación de MEK, un objetivo quinasa aguas abajo de K-ras (Figura 1B) . Estos cambios genéticos inducidos claramente un cambio morfológico celular vacuola similar que parecía ser la senescencia celular, lo cual es consistente con los resultados de un informe anterior [31] (Figura 1C).
Esquemas (a) generar un panel células de HBEC. (B, C)
in vitro
caracterización de HBECs. (B) ensayos de inmunotransferencia se llevaron a cabo para la expresión de K-ras
V12, p53, pMEK, MEK total y beta-actina en células HBEC. (C) Una vista microscópica de células HBEC (ampliación, 1x). Tenga en cuenta que HBEC-KT significa líneas celulares inmortalizadas HBEC por
CDK4
más
hTERT
; KTR
L, KT además oncogénico
K-ras
V12
; KT53, KT, más
p53
knock-down; KTR
L53, KTR
L más
p53
knock-down.
NR expresión en el panel HBEC
Como nos ha demostrado recientemente que la patrón de expresión para los 48 NR es un biomarcador de pronóstico establecido así como potencialmente son dianas terapéuticas para el cáncer de pulmón [6-8], nos preguntamos si cualquier NR están asociados con la patogénesis del cáncer de pulmón. Por lo tanto, para explorar si la introducción de
K-ras
V12
y
p53
cambios oncogénicos afectó a la expresión de los RN en células epiteliales bronquiales del pulmón humano, nos primero perfilada la expresión de mRNA de los 48 miembros de la superfamilia NR por QPCR en el panel HBEC isogénica que se oncogenically bien definida y compuesta de líneas genéticamente idénticos epiteliales bronquiales de células (Fig 2 y Fig S2). Hemos encontrado 31 de los 50 rupias (incluyendo PPARδ2 y PPAR? 2, isoformas de PPAR y PPAR, respectivamente) para exhibir diferencias en el panel isogénica (tampoco tenía ninguna expresión o ningún cambio en la expresión) (Fig S2). Por el contrario, 19 NR mostraron distintos patrones de expresión a través de los paneles HBEC isogénicas, que cayeron en tres grupos diferentes. El primer grupo (p53 dependiente) incluye dos miembros, ovoalbúmina de pollo aguas arriba factor de promotor de transcripción (Golpe-TF) α, receptor de estrógeno (ER) β, NR que muestran un patrón de expresión dependiente de p53 (Fig 2A). El segundo grupo estuvo representado por los RN con una K-ras
patrón de expresión V12 dependiente incluyendo Golpe-TFβ, estrógenos relacionada con el receptor (ERR) α, factor nuclear de células germinales (GCNF), factor de crecimiento nervioso inducido por el gen B (NGFIB ) 3, receptor huérfano de neuronas derivadas de 1 (NOR1), PPAR, PPAR, PPARδ2, reverse-erb (Rev-erb) α, y el receptor huérfano relacionada con el ácido retinoico (ROR) α, receptor de la hormona tiroidea (TR) β (Fig 2B). El tercer grupo (K-ras
V12 y p53 dependiente) fueron ER, factor nuclear de hepatocitos 4 (HNF4) γ, el factor 1 (NURR1), PPAR?, Receptor de ácido retinoico (RAR) relacionados nur-β, huérfano relacionados con RAR receptor (ROR) β, que eran NR con un patrón de expresión de oncogenes dependiente dual (Fig 2C). En línea con los resultados de nuestro informe anterior, en el que la expresión NR fue altamente asociados con la progresión del cáncer de pulmón [7], este resultado apoya la idea de que los subconjuntos de NR también podrían estar involucrados en la patogénesis del cáncer de pulmón inducido por
K-ras
V12
sobreexpresión y /o pérdida de la función de p53.
el ensayo qPCR se realizó para la expresión de ARNm de toda la superfamilia NR en el panel HBEC inmortalizado. (A)
p53
expresión desmontables-dependiente. (B) Oncogénicos
K-ras
V12
dependiente de expresión. (C)
p53
desmontables y
K-ras
V12
dependiente de expresión. Tenga en cuenta que HBEC-KT significa líneas celulares inmortalizadas HBEC por
CDK4
más
hTERT
; KTZ, KT, más plásmido de control con el marcador de selección zeocina; KTR
L, KT además oncogénico
K-ras
V12
; KT53Z, KTZ más
p53
knock-down; KTR
L53, KTR
L más
p53
caída. Los datos representan la media ± SD (n = 3). Los asteriscos muestran puntos estadísticamente significativas según la evaluación de
ANOVA
. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01 y ***
P Hotel & lt; 0,001 en comparación con HBEC-KT.
activación de PPAR? Invertido la oncogénico
K-ras
V12
inducida por la expresión de la proteína COX-2
Desde el PPAR ha sido relativamente bien estudiado, entre otros rupias en diversas funciones fisiológicas (por ejemplo, la diferenciación de adipocitos, el control de la inflamación) y sus TZD ligando disponibles en la clínica de la diabetes tipo II, el próximo decidieron investigar el estudio molecular de PPAR? , como una prueba de concepto-, de los 48 rupias en la patogénesis molecular del cáncer de pulmón [11, 34, 35]. De acuerdo con informes anteriores que muestran que la expresión de COX2 se asocia con la progresión del cáncer de pulmón [36, 37], se observó un aumento espectacular en la expresión de COX2 en HBECs modificado para contener oncogénico
K-ras
V12
(Fig 3A y 3B). Mientras PPAR mRNA aumentó en paralelo con la expresión de COX2, PPAR proteína expresiones fueron comparables en los 4 células HBEC que sugiere la regulación postranscripcional de PPAR mRNA (Figura 3B). Teniendo en cuenta que PPAR juega un papel importante en la respuesta anti-inflamatoria [34, 35], hemos querido poner a prueba si la activación de PPAR inhibe la expresión de COX2 pro-inflamatorias en el modelo de la patogénesis del cáncer de pulmón. De hecho, la troglitazona agonista de PPAR? Invirtió el aumento de la expresión de COX2 mRNA y proteína (Fig 3A y 3B). Junto con la inhibición de la proliferación de PPAR cáncer de pulmón como se informó anteriormente [38, 39], este resultado sugiere que PPAR supresión de la expresión de COX2 puede ser importante en la modulación de la transformación maligna inducida por oncogén de HBECs en cáncer de pulmón. Con la pérdida de la función de p53, la expresión de la proteína ciclina D1, un factor clave en la progresión del ciclo celular de G1 a la fase S, disminuyó en HBECs con desmontables p53 y disminuyó aún más en HBECs con doble
p53
y
K-ras
V12
alteraciones oncogénicas, junto con el tratamiento con troglitazona (figura 3B). Por el contrario, la ciclina D1 exhibió ningún cambio en HBECs con sólo K-ras
expresión V12 con o sin troglitazona. Estos datos sugieren que durante las lesiones precancerosas (tipificada por las células HBEC con
p53
pérdida y
K-ras
V12 cambios
), PPAR se expresa y su la activación dependiente de ligando puede dar lugar a cambios dramáticos en la COX-2 y la expresión de ciclina D1 (figura 3A y 3B). Sin embargo, el tratamiento con troglitazona mostró igual inhibición de la proliferación HBEC-KT través del panel isogénica (Figura 3C). Esto sugiere que los factores adicionales, además de COX-2 y ciclina D1, podrían estar involucrados en la supresión del crecimiento mediada por PPAR? De células HBEC.
(A) PPAR? Y expresión COX2 mRNA se midió usando el ensayo de QPCR en líneas HBEC con o sin tratamiento con troglitazona. (B) Las inmunotransferencias usando anticuerpos contra la COX2, ciclina D1, PPAR o beta-actina se utilizaron para medir la expresión de la proteína correspondiente en el panel de HBEC cuando son tratados o no tratados con 1 M de troglitazona. (C) la respuesta de crecimiento de líneas de células HBEC-KT para el tratamiento combinado de PPAR troglitazona ligando (3 M) y RXR LG268 ligando (100 nM). Los datos representan la media ± SD (n = 3). Los asteriscos muestran puntos estadísticamente significativas según la evaluación de
ANOVA
. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01 y ***
P Hotel & lt; 0,001 en comparación con el control HBEC-KT,
###
P Hotel & lt; 0,001 en comparación con K-ras
de control V12,
+++
P Hotel & lt; 0,001 en comparación con K-ras
+ V12 de control p53shRNA.
Caracterización de clones HBEC tumorigénicas
Dado que los diferentes niveles de expresión de PPAR reflejan diferencias en la inhibición del crecimiento de no tumorigénicos HBECs cuando son tratados con troglitazona (figura 3C), nos preguntamos si los HBECs transformadas muestran una respuesta diferente al tratamiento ligando PPAR y distintos patrones de expresión de otros rupias en comparación con los HBECs precancerosas. En primer lugar, caracterizamos los dos clones tumorigénicas, HBEC-C1 y -C5, en los niveles celulares y tisulares. Caracterización histológica de los tumores de xenoinjertos reveló, como se muestra recientemente por nosotros, para que HBEC-KT con desmontables p53 y K-ras
manipulación V12 alta expresión podría dar lugar a derivados de clones con diferentes carcinoma de células escamosas histologies- (SCC, HBEC-C1 ) y adenocarcinoma (ADK, HBEC-C5) [31] (Fig 4A). El análisis bioquímico confirmó que tanto las alteraciones oncogénicas,
K-ras
actividad
V12, así como la pérdida de
p53
expresión, se mantiene también en el HBEC- tumorigénico C1 y -C5 clones (Fig 4B). Sorprendentemente, tanto de PPAR y COX2 expresiones se redujeron dramáticamente en clones tumorigénicas HBEC (Fig 4B y S3 FIG) y los clones fueron consistentemente tumorigénicas resistente a la inhibición del crecimiento de PPAR? (Fig 4C). Estos datos sugieren la posibilidad de que durante lesiones premalignas impulsado por
p53
y
K-ras
cambios oncogénicos que PPAR y COX2 pueden ser dianas terapéuticas, sino que con el desarrollo de la plena malignidad que los tumores pasar por alto esta control, que en algunos casos se produce por regulación a la baja de PPAR. Tales hallazgos serían coherentes con los informes de que el uso de no esteroideo antiinflamatorio (AINE) puede proteger contra el desarrollo de cáncer de pulmón en los hombres, mientras que su uso en los cánceres de pulmón completamente desarrolladas no parece ser terapéutico [40].
(A) El análisis histológico de los clones tumorigénicas; C1 tumor carcinoma pobremente diferenciado con células grandes sugestivos de carcinoma de células escamosas (H & amp; E, x40) (izquierda) y C5 tumor de carcinoma pobremente diferenciado con características de adenocarcinoma (H & amp; E, x40) (derecha). (B)
in vitro
caracterización de clones HBEC tumorigénicas C1 y C5. ensayos de inmunotransferencia se llevaron a cabo utilizando anticuerpos contra K-ras, p53, Perk, ERK total y beta-actina en clones HBEC tumorigénicas. Usando ensayo de QPCR, la expresión de ARNm de PPAR se midió en clones tumorigénicas (abajo en B). (C) la respuesta de crecimiento de clones HBEC tumorigénicas para el tratamiento combinado de PPAR (3 M troglitazona) y RXR (100 nM) LG268 ligandos. Los datos representan la media ± SD (n = 3). Los asteriscos muestran un punto de vista estadístico significativo como evaluadas por
ANOVA
. *
P Hotel & lt; 0,001 en comparación con el control HBEC-KT.
NR expresión en los clones HBEC tumorigénicas
Dado que la expresión de PPAR se suprimió notablemente en los HBECs totalmente malignas, nos preguntamos si cualquier otros rupias se expresan de forma diferente con la misma progresión tumorigénico. Por lo tanto, hemos completado el perfil de expresión de ARNm de toda la superfamilia NR en el panel de no tumorigénicos HBEC-KTR
L53 células y los derivados clonales tumorigénicas incluyendo líneas celulares tumorigénicas establecidas a partir de tumores C1 y C5, y sí C5 tumoral (Fig 5A y S4 Fig). Quince de los 50 NR mostraron patrones de expresión potencialmente asociados con la progresión maligna de HBEC-KTR
L53 células en tumores HBEC (Figura 5A). Se incluyen en este grupo fue de AR, Golpe-TFα, Golpe-TFβ, hipoplasia del sexo inverso-suprarrenal congénita región crítica sensible a la dosis en el cromosoma X, el gen 1 (DAX1), ER, ERRα, HNF4γ, hígado del receptor homólogo-1 (LRH1 ), NOR1, NURR1, PPAR, RARβ, RORα, RORβ, y VDR (Fig 5A). Curiosamente, nueve de las 15 rupias (AR, Golpe-TFα, DAX1, HNF4γ, LRH1, NOR1, Nurr1, RORα, y RORβ) mostraron continuamente creciente patrón de expresión en la progresión tumorigénico (figura 5B). AR y DAX1 mostraron un aumento de forma espectacular la expresión sólo en tumores HBEC, pero no en las líneas celulares inmortalizadas HBEC. ERRα y VDR mostraron una disminución de expresión durante la tumorigénesis de no oncogénico HBEC-KT, a través de HBEC-KTR
L53 a HBEC tumores (Figura 5B). Golpe-TFβ, ER, y RARβ mostraron un patrón de expresión bifásica, donde la expresión inicial de los IN en HBEC-KT disminuyó en HBEC-KTR
L53, pero se recuperaron en los tumores HBEC, que es opuesta a la pérdida completa de PPAR? expresión en tumores HBEC (Fig 5B). Más interesante, de tipo adenocarcinoma células HBEC-C5 y tumor, pero no el carcinoma de células escamosas HBEC-C1, mostraron un aumento de expresión de Golpe-TFα y β, y disminución de la expresión de ERRα y VDR, lo que sugiere que estos cuatro NR podrían estar involucrados específicamente en específicas del tipo de adenocarcinoma patogénesis del cáncer de pulmón.
el ensayo qPCR se realizó para la expresión de ARNm de toda la superfamilia NR en no tumorigénicos HBEC-KTR
L53 células con
p53
y
K-ras
V12
cambios, dos clones tumorigénicas C1 y C5, y de tejido tumoral de xenoinjertos C5. (A) mRNA cuantitativa perfiles de expresión de los subgrupos NR con distinto patrón de expresión a través del panel. Tenga en cuenta que el resto del perfil de NR se muestra en la Fig S4. (B) Resumen de expresión NR desde el panel A y la figura 2 para mostrar las cascadas de expresión NR correlacionados con la progresión tumorigénico. Los datos representan la media ± SD (n = 3). Los asteriscos muestran puntos estadísticamente significativas según la evaluación de
ANOVA
. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01 y ***
P Hotel & lt; 0,001 en comparación con HBEC-KTR
L53.
PPAR inhibición sumoylation dependiente del crecimiento y la migración HBEC tumorigénico
Como ligando mediada por PPAR sumoylation reprime la expresión de óxido nítrico inducible sintasa (iNOS), una enzima proinflamatoria bien conocido que genera óxido nítrico, y el papel antiinflamatorio de los PPAR se cree que contribuye a su función supresora del tumor de ese receptor [34], hemos probado si PPAR sumoylation es crítica para la lucha contra -tumorigenic función de este receptor en la serie progresión HBEC. Para ello, se establecieron líneas celulares estables oncogénicas (HBEC-C1) que expresan el tipo salvaje (wt-PPAR?) O mutante sumoylation (SUMO-PPAR?) Forma de PPAR para estudiar si la ganancia de la función de las diferentes formas de PPAR ( en peso PPAR-vs SUMO-PPAR?) podría revertir la resistencia a la propagación de la tumorigénico HBEC-C1 a ligando tratamiento. Se identificaron que ambas formas de PPAR no mostraron diferencia en la función de trans-activación mediada por ligando para la expresión del gen diana usando un ensayo de luciferasa (Fig 6A). células HBEC-C1 estrictamente regulados la expresión de wt-PPAR? o SUMO-PPAR bajo el control del promotor operativo inducible por tetraciclina (Tet /ON) (Fig 6B). células HBEC-C1 con la expresión inducida de peso-PPAR mostraron inhibición del crecimiento significativa en más de un 50% cuando son tratados con pioglitazona o troglitazona (TZD) (figura 7A). Sin embargo, esta respuesta inhibitoria del crecimiento se redujo en gran medida en las células HBEC-C1 con la expresión inducible de SUMO-PPAR? En las mismas condiciones de tratamiento como los correspondientes células HBEC-C1 que expresan WT-PPAR? (Fig 7A y 7B). Del mismo modo, el ensayo de formación de colonias líquido mostró que clonogenecity PPAR tratamientos ligando inhibido de HBECs expresan en peso-PPAR? Y otras líneas celulares de cáncer de pulmón como calu6 y H2347 que expresa endogenouse PPAR, pero no de la que tiene SUMO-PPAR (figura 7B y 7C). Sin embargo, el tratamiento del ligando PPAR WY-14643 no mostró ningún efecto colonogenic tanto en peso-PPAR y PPAR-SUMO expresar HBECs (Figura 7C). Esto sugiere que el efecto inhibidor de los TZD depende específicamente en PPAR sumoylation. la activación de PPAR? también inhibió la migración celular de una manera dependiente de sumoylation (Fig 7D). Consistente con esto, la expresión tanto de la ciclina A y ciclina D1 se redujo en las células HBEC-C1 expresan WT-PPAR?, Pero no se ha modificado en las células HBEC-C1 expresar SUMO-PPAR?, Cuando se trata con TZDs (Fig 8A y S5A FIG). Tenga en cuenta que la expresión de la ciclina dependiente de los inhibidores de quinasa, p16 y p21, no se han cambiado de manera significativa en las mismas condiciones de tratamiento (Fig 8A y S5A FIG). Además, se investigó varias vías de señalización inflamatoria implicados en la producción de óxido nítrico, la bioquímica de la prostaglandina, y la transducción de señal de TNF. Curiosamente, se encontró que la activación de TZD en peso-PPAR? Disminuyó la expresión de COX2 proinflamatorias por tres veces, mientras que la activación de PPAR? SUMO-, en particular, el aumento de la expresión de la proteína COX2 por seis veces en las células HBEC-C1 (Fig 8B). Además, la expresión de la deshidrogenasa 15-hidroxiprostaglandina (HPGD), una enzima prostaglandina que metabolizan, se indujo de manera espectacular por dieciocho veces cuando el WT-PPAR fue activado por TZD. Sin embargo, las células HBEC-C1-SUMO-PPAR indujo la expresión HPGD significativamente menor (de cinco a siete veces) cuando se trata con TZD. la activación de PPAR? también suprimió significativamente la expresión de TNF, pero no otro NFkB factores de señalización, de una manera sumoylation-dependiente (Fig S5B). Tenga en cuenta que iNOS no se expresó en clones HBEC tumorigénicas (S5C FIG). Tomados en conjunto, esto sugiere que sumoylation PPAR inducida por ligando está implicada específicamente en la supresión de la COX2 inflamatoria y TNFa vías de señalización, pero no la vía de iNOS, en la patogénesis del cáncer de pulmón.
(A) ensayo de indicador de luciferasa de tipo silvestre y los plásmidos mutantes sumoylation PPAR. RLU, la unidad de luciferasa relativa. (B) La tetraciclina expresión inducida de la proteína PPAR y EGFP transfectadas de forma estable en el clon HBEC-C1-peso-PPAR. Una vista microscópica de expresión EFGP inducido por tetraciclinas (arriba en B). ensayos de inmunotransferencia para la expresión de la lamina A /C y PPAR tetraciclina inducida (abajo en B). Una construcción de bicistrónico de PPAR y EGFP se introdujo de forma estable en un clon HBEC tumorigénico para generar líneas celulares HBEC-C1-PPAR como se describe en Materiales y Métodos. Los datos representan la media ± SD (n = 3). Los asteriscos muestran puntos estadísticamente significativas según la evaluación de
ANOVA
. *
P Hotel & lt; 0,001 en comparación con el control HBEC-KT.
respuesta de crecimiento y la migración de células de cáncer de pulmón se analizaron con el tratamiento con ligandos PPAR. la respuesta (A) El crecimiento celular.