Extracto
bidireccionales efectos promotores del cáncer y anti-cáncer de arsénico para las células cancerosas se han puesto de manifiesto en anteriores estudios. Sin embargo, cada uno de estos efectos (promotor del cáncer o anti-cáncer) se encontró en diferentes células en diferentes-concentración tratado de arsénico. En este estudio, por primera vez indicamos que el arsénico a una concentración de 3 mM, igual al promedio de concentración en el agua potable en las zonas propensas al cáncer en Bangladesh, expresa al mismo tiempo sus efectos sobre las células bidireccionales HSC5 carcinoma de células escamosas humanas con distintas vías. El tratamiento con 3 M de arsénico promueve la invasión de células a través de la regulación positiva de la expresión de MT1-MMP y regulación a la baja de la expresión de p14ARF e indujo simultáneamente apoptosis de las células a través de la inhibición de la expresión de N-cadherina y aumento de la expresión de p21 (WAF1 /CIP1) en ambos transcripción y los niveles de proteína en las células HSC5. También puso de manifiesto que la inhibición de la expresión de MT1-MMP por NSC405020 dio lugar a disminución de la invasión de arsénico mediada por células de HSC5 que implican disminución de quinasas reguladas por señales extracelulares fosforilada (pERK). Tomados en conjunto, nuestros resultados biológicos y bioquímicos sugieren que el arsénico expresó efectos bidireccionales como un carcinógeno y un agente anti-cáncer en células HSC5 carcinoma de células escamosas humanas con distintas vías. Nuestros resultados podrían desempeñar una importante evidencia científica para realizar nuevos estudios para encontrar una mejor manera en el tratamiento de cánceres inducidos por arsénico, especialmente en el carcinoma de células escamosas
Visto:. Thang ND, Yajima I, Kumasaka MI, Kato M (2014) Funciones bidireccionales de arsénico como un carcinógeno y un agente anti-cáncer en el carcinoma epidermoide humano. PLoS ONE 9 (5): e96945. doi: 10.1371 /journal.pone.0096945
Editor: Shrikant Anant, Universidad de Kansas Facultad de Medicina de los Estados Unidos de América
Recibido: 10 Febrero, 2014; Aceptado: April 13, 2014; Publicado: 9 Mayo 2014
Derechos de Autor © 2014 Thang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación está financiado por la Fundación Nacional para el Desarrollo de Vietnam Ciencia y Tecnología (NAFOSTED) bajo el número de concesión 106-NN.02-2013.07. La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la contaminación por arsénico en el agua potable de pozos de agua es un problema grave de salud pública en el mundo [1], [2]. El arsénico es un carcinógeno humano bien documentada. la exposición de dosis baja crónica de arsénico causado decoloración de la piel, indigestión crónica, hipertensión, enfermedad vascular periférica, enfermedad isquémica del corazón, y muchos tipos de cáncer, incluyendo la piel, pulmón, vejiga, hígado, y cánceres de riñón [3]. Efectos de arsénico como un agente para la carcinogénesis o la progresión del tumor o un fármaco anti-tumor dependen de su concentración [4] - [6], la duración de la exposición [6], [7] y células de cáncer de tipos [3] - [7] . Anterior automóviles estudios en animales mostraron que radiográficos carcinoma cutáneo de células escamosas (SCC) es uno de los cánceres de arsénico mediada representativos [8]. Aunque el arsénico ha sido ampliamente reconocido como un carcinógeno, también se ha usado clínicamente como un agente quimioterapéutico eficaz en el tratamiento de la leucemia en los seres humanos [9]. El arsénico también expresó sus efectos contra el cáncer en varios cánceres sólidos, incluyendo el carcinoma cutáneo, mediante la promoción de la muerte apoptótica de células [10], [11]. Los promotores del cáncer y anti-cáncer bidireccionales efectos del arsénico en las células cancerosas se han llevado a una situación difícil de aclarar el mecanismo del cáncer de arsénico mediada. Aunque había muchos estudios centrados en revelar el mecanismo de los efectos del arsénico sobre las células del cáncer, todavía no está claro.
detención del ciclo celular y la apoptosis están relacionadas con la muerte celular y que se considera como aspectos importantes para el cáncer el tratamiento [12] - [15]. Estudios anteriores mostraron que el arsénico induce la apoptosis en células de cáncer mediante la activación de la expresión de los supresores de tumores de p21 (WAF1 /CIP1) y p14ARF (p19ARF en ratón) [12] - [15]. p21 (WAF1 /CIP1) y p14ARF juegan un papel importante en el control de la detención del ciclo celular mediante la regulación de la actividad de las ciclinas y quinasas dependientes de ciclina (CDK) [16] - [19]. p21 (WAF1 /CIP1) y p14ARF son capaces de inhibir el crecimiento celular a través de la detención del ciclo celular de las células de cáncer de piel, incluyendo melanoma, carcinoma de células escamosas y carcinoma de células basales [20] - [24]. Otros informes revelan que la exposición a la transformación celular causa arsénico a través de la inhibición tanto de la expresión de proteína y el gen de la supresores de tumores p19ARF [22] - [24].
Invasion es marca del pasillo para el grado de malignidad de las células cancerosas. Se ha informado de que el arsénico reduce las propiedades invasivas y metastásicas de las células tumorales de glioma través de la inhibición de la activación de la metaloproteinasa de matriz 14 (MT1-MMP) [7], [25], que es capaz de conducir la invasión de las células cancerosas en gran parte por la degradación de ECM barreras. MT1-MMP también se considera como una aguas arriba de ERK. ERK es una molécula clave en las principales cintas de señalización de la vía de la proteína quinasa activada por mitógenos [26],. ERK juega un papel importante en el desarrollo del cáncer, [26], [27]. Por lo tanto MT1-MMP puede ser capaz de regular el nivel de fosforilados ERK [26], [27]. Sin embargo, en los otros estudios, alta concentración de arsénico aumenta la expresión de MT1-MMP en células de fibroblastos [28] - [30]. Estudios anteriores también informaron que el arsénico reduce la expresión de E-cadherinas [31], [32]. La regulación por disminución de la E-cadherina se correlaciona con la regulación positiva de N-cadherina, una molécula de promotor de la invasión [33] -. la adhesión N-cadherina-dependiente altera la regulación al alza de la p21 inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina [37], [38]. La expresión ectópica de N-cadherina aumenta la motilidad de las células tumorales [35], [39].
En nuestro informe anterior mostró que hay alrededor de 3 M (210,7 mg /L) de arsénico en el agua potable contaminada con arsénico también (n = 72) en las zonas propensas al cáncer en Bangladesh [40]. Hay muchos tipos de cánceres, incluidos los carcinomas de células escamosas (SCC) que ocurren en estas áreas [40]. En este estudio, por primera vez, mostramos que el arsénico a una concentración de 3 mM actuado simultáneamente como cáncer-promotor y medicamento contra el cáncer en las células HSC5 carcinoma de células escamosas humanas con distintas vías.
Materiales y Métodos
Reactivos
arseniuro de sodio (arsénico) se adquirió de Sigma. NSC405020 se adquirió de Millipore. El arsénico se disolvió en agua para su uso. NSC405020 se disolvió en DMSO para su uso.
Cultivo de células de queratinocitos transformados
Humanos HSC5 células [40] (Ciencias de la Salud Recursos de Investigación del Banco, Japón) se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina /estreptomicina a 37 ° C en 5% de CO2.
Crystal ensayo de violeta
ensayo de violeta cristal se realizó mediante el método descrito anteriormente [40]. Brevemente, las células (3 × 10
4 células) se sembraron en placas de seis pocillos y se cultivaron durante 24 h. Las células se trataron luego con arsénico y se cultivaron durante otros 3 días. Las células adherentes viables se fijaron con formalina al 10% y se tiñeron con 0,1% de cristal violeta. La absorbancia a 595 nm en las células teñidas solubilizaron con 0,1% SDS se midió utilizando un lector de microplacas.
ensayo de invasión
capacidad de invasión celular se evaluó mediante el ensayo de invasión de acuerdo con el método descrito anteriormente [41 ]. Brevemente, 2 × 10
5 células en medio de cultivo 300 ml con 0,5% de FBS se aplicaron a la cámara superior matrigel recubierto de 8 mm de diámetro (8 mm de tamaño de poro). Entonces las cámaras superiores se colocaron en placas de cultivo de 24 pocillos que contenían 600 ml de medio acondicionado con 0,5% de FBS para desencadenar la actividad de la invasión y se incubaron durante 12 horas. células invasoras se tiñeron con hematoxilina-eosina o violeta cristal y se contaron bajo un microscopio.
en tiempo real el análisis de PCR
ARN total se preparó a partir de muestras de líneas celulares utilizando una alta Kit RNA Pure (Roche Diagnostics) de acuerdo con el método descrito anteriormente [41]. a continuación, se sintetizó ADNc mediante transcripción inversa de RNA total usando Super-criptTMIII transcriptasa incluido en la mezcla de enzima RT y la mezcla de reacción de RT de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente [41] inversa. Cuantitativa en tiempo real RT-PCR con SYBR verde se realizó mediante energía SYBR1 Green PCR master mix (Applied Biosystems) en un sistema de detección de secuencias ABI Prism7500 (Applied Biosystems). Los niveles de expresión de p14ARF, p21 (WAF1 /CIP1), MT1-MMP y transcripciones N-cadherina medidos por RT-PCR cuantitativa en tiempo real (PCR) se ajustaron a través del nivel de expresión de la transcripción de la caja TATA-proteína de unión (PDD) . PCR se llevó a cabo utilizando 10 ml de poder SYBR1 Green PCR master mix (Applied Biosystems) que contenía 900 nM de cebador directo y 900 nM cebador inverso en un volumen final de 20 ml. Las secuencias de los cebadores se presentan de la siguiente manera:
Reenviar: GTGGTCTCGGACCATGTC
e inversa: GTAGCCATATTGCTGTAGCC de MT1-MMP
Reenviar:. ATTGCTGTTTTGGACCGAGA
e inversa: CACTTGAGGGGCATTGTCAT para N-cadherina
Reenviar:. AAGTCAGTTCCTTGTGGAGC
y retroceso:. ATTAGCGCATCACAGTCGCG de p21 (WAF1 /CIP1)
Reenviar: ATGGTGCGCAGGTTCTTGGT
y reversa : TGCCCATCATCATGACCTGG para p14ARF
Reenviar:. CACGAACCACGGCACTGATT
y retroceso:. TTTTCTTGCTGCCAGTCTGGAC para TBP
el análisis por inmunotransferencia
el análisis por inmunotransferencia se realizó de acuerdo con el método descrito anteriormente [42]. policlonales de conejo primeros anticuerpos contra fosforilados treonina 202 en ERK1 y tirosina fosforilada 204 en ERK2 (Señalización Celular), anti-metaloproteinasa de matriz 14 (MT1-MMP) la región bisagra de anticuerpo (Millipore), ERK1 /2 (Señalización Celular), cabra anticuerpos policlonales contra p14ARF y p21 (WAF1 /CIP1) (Santa Cruz), anticuerpo monoclonal de ratón contra N-cadherina (
BD
Biosciences) y el anticuerpo monoclonal de ratón contra alfa-tubulina (Sigma).
estadística análisis
el análisis estadístico en este estudio se realizó de acuerdo con el método descrito anteriormente [40]. Los resultados de tres experimentos independientes en cada grupo se analizaron estadísticamente mediante la prueba t de Student. El SPSS (versión 18) paquete de software (SPSS Inc., Japón) se utilizó para estos análisis estadísticos, y el nivel de significación se fijó en p. & Lt; 0,05
Resultados
El arsénico apoptosis inducida de HSC5 células
Nuestro trabajo de campo previo mostró que la concentración de arsénico en el agua potable contaminada con arsénico en áreas propensas al cáncer en Bangladesh es de aproximadamente 3 M (210,7 mg /L) [40]. Sin embargo, hay un hecho que es difícil identificar el efecto del arsénico en el desarrollo del cáncer [3] - [11] Por lo tanto, se decidió investigar los efectos del arsénico sobre la apoptosis de las células HSC5. células HSC5 fueron tratados con arsénico en 0, 1,0, 3,0, 5,0 y 10,0 mM durante 24 hrs. Se demostró que la concentración más alta de arsénico causó la apoptosis más fuerte de las células. A una concentración de 1 mM, arsénico no tuvo efecto sobre las células muertas (Figura 1A). Sin embargo, en 3 M y 5 M, arsénico provocó disminución de la viabilidad celular casi 2 y 5 pliegues, respectivamente (Figura 1A). 10 M de arsénico llevó a casi todas las células muertas (datos no mostrados). a continuación, se investigó el efecto de 3 M de arsénico en los muertos de las células HSC5 con un curso de tiempo. El tratamiento con arsénico durante 24 horas, 48 horas y 72 horas disminuyó significativamente la viabilidad de las células HSC5 1,4, 1,8 y 1,7 veces, respectivamente (Figura 1B). Estos resultados indican que la apoptosis de las células HSC5 fueron causados directamente por arsénico.
Viabilidad de HSC5 células tratadas con 0, 1,0, 3,0 y 5,0 M de arsénico fue evaluada por violeta cristal (CV). Las células se presentan en las fotografías (A) y proporciones de células vivas tratadas arsénico y células vivas de control se presenta en un gráfico (B). **, Significativamente diferentes (p & lt; 0,01) desde el control mediante la prueba t de Student
El arsénico promovió la invasión de las células HSC5
A continuación examinó los efectos del arsénico sobre la invasión de. HSC5 células. Las células fueron tratadas previamente con arsénico a diferentes concentraciones (0, 1.0, 3.0, 5.0 y 10.0 mM) durante 24 horas antes de la cosecha para el ensayo de invasión. El tratamiento con 1 mM de arsénico no tuvo efecto, sin embargo 3 M y 5 M promovidos invasión de HSC5 aproximadamente 1,8 y 3,7 pliegues, respectivamente (Figura 2A). A 10 mM, arsénico causó la muerte de casi todas las células, por lo que no fue posible investigar el efecto del arsénico sobre la invasión de célula a esta concentración. Luego investigó el efecto de 3 M de arsénico en la invasión de células HSC5 con un curso de tiempo de 0, 24, 48 y 72 horas. Pre-tratada con arsénico durante 24, 48 y 72 horas aumento de la invasión de las células HSC5 2.14, 2.27 y 1.75 pliegues, respectivamente (Figura 2B). Resultados Se sugirió que el arsénico resultó en la promoción de la invasión de las células HSC5. El tratamiento con 3 M o 5 M de arsénico aumento de la apoptosis (Figura 1) y al mismo tiempo promueve la invasión de células HSC5 (Figura 2). Estos resultados son evidents científicos para bifunctions de arsénico como un carcinógeno y un agente anti-cáncer en el cáncer escamoso células de carcinoma de células HSC5. Basándose en estos resultados y los datos del trabajo de campo, se decidió utilizar 3 M de arsénico para experimentos adicionales.
capacidad invasiva de las células tratadas HSC5 0, 1,0, 3,0 y 5,0 M de arsénico fueron evaluados por la invasión ensayo. Número de células invasoras HSC5 tratados con arsénico en el ensayo de invasión se presentaron en las fotografías (A) y un gráfico (B). **, Significativamente diferentes (p & lt; 0,01). Desde el control mediante la prueba t de Student
El arsénico promovió la invasión de las células HSC5 por la regulación positiva de MT1-MMP y la regulación a la baja de p14RAF tanto en la transcripción y expresión niveles
a continuación examinó el mecanismo molecular de la invasión celular arsénico mediada por células en HSC5. El tratamiento con 3 M de arsénico inducida transcripción y niveles de expresión de MT1-MMP (Figura 3A-B) y de transcripción y de expresión inhibidos niveles de p14ARF (Figura 3C-D). Los estudios previos [20] - [24], [27] indicaron que MT1-MMP y p14ARF podrían desempeñar un papel importante en la modulación del crecimiento y la invasión de células de carcinoma de células escamosas. De acuerdo con estos informes anteriores [20] - [24], [27], nuestros resultados sugieren que el arsénico podría promover la invasión de las células HSC5 a través de la regulación positiva de MT1-MMP y la regulación a la baja de p14ARF
A y C). los niveles de transcripción de expresión de MT1-MMP y p14 fueron medidos por PCR en tiempo real. **, Significativamente diferentes (p & lt; 0,01) del control por la prueba t de Student. B y D) los niveles de expresión de proteínas de MT1-MMP y p14 se midieron mediante inmunotransferencia. TUBULINA se utilizó como control positivo. Tres experimentos independientes se realizaron y se obtuvieron los mismos resultados.
El arsénico apoptosis inducida de células HSC5 por regulación a la baja de N-cadherina y la regulación positiva y de p21 (WAF1 /CIP1), tanto a nivel de transcripción y expresión
a continuación se investigó el mecanismo molecular de la apoptosis mediada por el arsénico en células HSC5. El tratamiento con 3 M de arsénico redujo fuertemente los niveles de transcripción y de expresión de N-cadherina (Figura 4A-B) y promovidos los niveles de transcripción y de expresión de p21 (WAF1 /CIP1) (Figura 4C-D). Los estudios previos [20] - [24], [29] - [36] demostraron que la N-cadherina y p21 (WAF1 /CIP1) podrían desempeñar un papel importante en la modulación de la apoptosis de células de carcinoma de células escamosas humanas. Nuestros resultados de este estudio sugieren que el arsénico puede causar apoptosis de células HSC5 a través de regulación a la baja de N-cadherina y /o regulación al alza de p21 (WAF1 /CIP1).
A y C) de transcripción de expresión niveles de N-cadherina y p21 se midieron mediante PCR en tiempo real. ***, Significativamente diferentes (p & lt; 0,001) desde el control por la prueba t de Student. B y D) los niveles de expresión de la proteína de N-cadherina y p21 se midieron mediante inmunotransferencia. TUBULINA se utilizó como control positivo. Tres experimentos independientes se realizaron y se obtuvieron los mismos resultados.
La inhibición de la promoción de arsénico mediada por células de invasión HSC5 por un inhibidor de MT1-MMP
A continuación examinó el efecto de NSC405020 , un inhibidor de MT1-MMP, en la invasión de arsénico mediada por células HSC5 (Figura 5). Desde MT1-MMP se ha informado de que el potencial situada aguas arriba de ERK [41], [42] y puede estar asociada con arsénico mediada invasión (Figura 2). El tratamiento con 3 M arsénico nuevo aumento de la invasión (Figura 5A), con un aumento en el nivel de expresión de MT1-MMP (Figura 5B). Sin embargo, no hubo ningún cambio en el nivel de fosforilados ERK (pERK). Estos resultados indican que los efectos bidireccionales de arsénico en esta concentración en pERK eran equilibrio. invasión arsénico mediada fue bloqueado por el tratamiento con 1 mM de NSC405020 (Figura 5A). NSC405020 (1 M) causado a disminución del nivel de expresión de MT1-MMP, así como disminución de fosforilados de ERK en las células HSC5 (Figura 5B).
A), la actividad invasiva de HSC5 tratados con 3 M de arsénico se evaluó ensayo de invasión. Nivel de capacidad invasora se presenta como el número de células invasoras en un gráfico (izquierda) y fotografías (derecha). **, Significativamente diferentes (p & lt; 0,01) desde el control mediante la prueba t de Student. se presentan los niveles de ERK fosforiladas (P-ERK) y los niveles de expresión de proteínas de MT1-MMP y ERK en las células tratadas con HSC5 3 arsénico mu M durante 24 horas. los niveles de expresión de proteínas TUBULINA se presentan como un control interno.
Discusión
El arsénico ha sido considerado como un agente para la carcinogénesis y la progresión tumoral de hace mucho tiempo [1], [2 ]. Con base en el análisis de muestras de agua de pozos entubados 52202 mano durante los últimos 14 años en Bangladesh mostró que alrededor de 36 millones y 22 millones de personas podrían estar bebiendo agua contaminada Como-por encima de 10 y 50 mg /l, respectivamente [43]. Este puede ser el principal motivo de grave problema del desarrollo de cáncer, especialmente de cáncer de piel en Bangladesh [3]. En un medio de contraste, el arsénico también se ha utilizado como un medicamento para el tratamiento de muchos tipos de cáncer [8] - [11]. Basándonos en nuestros resultados anteriores [40], se examinaron los efectos del arsénico 3 M en la invasión celular, un sello distintivo de grado de malignidad de las células cancerosas y la apoptosis, un marcador de células muertas en el tratamiento del cáncer. Nuestro resultado mostró que el arsénico simultáneamente fuertemente inducida por apoptosis (Figura 1) y promovió la invasión (Figura 2) de las células HSC5. Estos resultados sugieren que a esta concentración, el arsénico expresó sus funciones bidireccionales en células HSC5 carcinoma de células escamosas. Estamos entonces a analizar los mecanismos moleculares relacionados con estos eventos en las células HSC5. Nuestros resultados revelaron que el arsénico 3 M mejorada invasión celular a través de la regulación positiva de tipo de membrana 1 de metaloproteinasas de matriz (MT1-MMP) (Figura 3A), que desempeña un papel crucial en la tumorigénesis [7], y regulación por disminución de p14ARF (Figura 3B), que es una inhibidor para la proliferación celular [20] - [24], tanto en los niveles de transcripción y expresión. Esta es la primera vez que demostramos que hay una posibilidad de cooperación entre MT1-MMP y p14ARF en el desarrollo del cáncer en las células HSC5. En el otro lado, nuestros resultados mostraron que 3 M arsénico apoptosis inducida de células HSC5 a través de regulación a la baja de N-cadherina (Figura 4A), que juega un papel en la diferenciación celular, la transformación, así como la invasión [33] - [36] y la regulación positiva p21 (WAF1 /CIP1) (Figura 4B), un supresor de tumor [20] - [24], tanto en los niveles de transcripción y expresión. Nuestros resultados de acuerdo con los estudios previos [37], [38] sugiere que la N-cadherina puede participar en la detención del ciclo de células asociado a través de la acumulación nuclear de la ciclina dependiente de inhibidores de la quinasa p21. Aunque tanto p14ARF y p21 (WAF1 /CIP1) se informaron como moléculas que juegan un papel importante en el control de la detención del ciclo celular mediante la regulación de las actividades de las ciclinas y las quinasas dependientes de ciclinas (CDK) [16] - [19], en este estudio, estas moléculas expresaron sus distintos efectos sobre la invasión y la apoptosis de las células HSC5. Además, se demostró que NSC405020, un inhibidor de la MT1-MMP, inhibe la promoción de arsénico mediada por células de invasión HSC5 (Figura 5). Se puede explicar que el tratamiento con NSC405020 resultó en la disminución del nivel de expresión de MT1-MMP. A su vez, MT1-MMP regula el nivel fosforilada de quinasas reguladas por señales extracelulares (pERK) [26], [27], que desempeña un papel importante en la invasión celular, la proliferación y el desarrollo de tumores [26], [27]. Por último, la regulación por disminución de MT1-MMP y pERK por NSC405020 condujo a la disminución de la invasión de las células HSC5 (Figura 5). Bidireccionales que promueven el cáncer y contra el cáncer efectos del arsénico para las células células cancerosas se han revelado. Sin embargo, el arsénico como un agente promotor del cáncer o un fármaco anti-cáncer se encontró en diferentes células en diferentes-concentración tratado en un informe en particular [1] - [3], [8] - [11]. Esta es la primera vez que mostramos simultáneamente las funciones bidireccionales de arsénico en células de carcinoma de células escamosas humanas HSC5 con vías moleculares distintas. Este estudio ayudó a explicar la razón por la cual, aunque hay muchas personas han estado expuestas al arsénico, no todos ellos tienen enfermedades arsenicosis incluyendo el cáncer. Nuestros resultados proporcionan una información importante para otros estudios en el futuro para encontrar una mejor manera en el tratamiento de cánceres inducidos por arsénico, especialmente en el carcinoma de células escamosas.