Extracto
aberrante citosina 5-metilación subyace en muchos elementos desregulados de cáncer. Entre no pequeñas de cáncer de pulmón de células emparejadas (NSCLC), hemos tratado de perfil de ADN características 5-metil-citosina que pueden subyacer a la desregulación de todo el genoma. En una de las más densas interrogatorios de la metiloma, tomamos muestras de 1,2 millones de sitios de GPC-de veinte de cuatro tumor de NSCLC (T) non-tumoral (NT) pares utilizando una restricción sensible a la metilación enzima basan ensayo HELP-microarrays. Encontramos 225,350 diferencialmente metiladas (DM) sitios en adenocarcinomas
frente
tejido no tumoral adyacente que varían en frecuencia a través del compartimiento de genómica, particularmente notable en los cuerpos de genes (GB; P & lt; 2.2e-16). Además, cuando DM se acopló a la diferencia de transcriptoma (DE) en las mismas muestras, 37056 loci diferencial en adenocarcinoma emergió. Aproximadamente el 90% de las relaciones DM-DE eran no-canónica; por ejemplo, el promotor de DM asociada con DE en la misma dirección. De los cambios canónicos se ha indicado, el promotor (PR) loci DM con cambios recíprocos en la expresión en los adenocarcinomas incluidos
HBEGF
,
AGER
,
PTPRM
,
DPT
,
CST1
,
Melk;
DM GB loci con cambios en la expresión concordantes incluido
FOXM1
,
FERMT1
,
SLC7A5
, y
FAP
genes. analiza IPA mostró promotor específico adenocarcinoma DMxDE superposición identificó familiares nodos de cáncer de pulmón [
TP53
,
Akt
], así como los nodos menos familiares [
HBEGF
,
NQO1
,
GRK5
,
FVW
,
HPGD
,
CDH5
,
CTNNAL1
,
PTPN13
,
DACH1
,
SMAD6
,
Lama3-
,
AR
]. Los hallazgos únicos de este estudio incluyen el descubrimiento de numerosos candidatos los hallazgos únicos de este estudio incluyen el descubrimiento de numerosos sitios de metilación del candidato en ambas regiones PR y GB no identificados previamente en el CPNM, y muchas relaciones no canónica a la expresión génica. Estas características de metilación del ADN potencialmente podrían desarrollarse como biomarcadores de riesgo o de diagnóstico, o como candidato objetivos para los agentes preventivos o terapéuticos locus orientados por metilación nuevas
Visto:. Mullapudi N, de Ye B, Suzuki M, M Fazzari, Han W, Shi MK, et al. (2015) Genome Wide metiloma Las alteraciones en el cáncer de pulmón. PLoS ONE 10 (12): e0143826. doi: 10.1371 /journal.pone.0143826
Editor: Osman El-Maarri, Universidad de Bonn, Instituto de Hematología Experimental y Medicina de Transfusión, Alemania |
Recibido: 18 Agosto, 2015; Aceptado: 10 de noviembre de 2015; Publicado: 18 de diciembre 2015
Derechos de Autor © 2015 Mullapudi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Los datos pertinentes pueden se encuentran en el repositorio GEO-GSE315520, GSE 31552.
Financiación: Este trabajo fue apoyado por el NCI 1RC1 CA145422-01 (SDS); 1K24-CA139054-01 (SDS); Fundación Herbert Stony-Wold (NM); 1R01-CA180126-01 (SDS Co-PI); P30 CA013330 (Albert Einstein Cancer Center de subvención núcleo)
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer
pulmón es responsable de la mayor número de muertes relacionadas con cáncer en los Estados Unidos [1]. El cáncer se caracteriza por los cambios en todo el genoma en CpG de metilación, incluyendo una hipometilación generalizada en todo el genoma (pérdida de metilación) que incluye al oncogenes, y la hipermetilación recíproca en loci particulares (aumento de la metilación), incluyendo los promotores de genes supresores de tumores [2,3]. Estudios recientes han demostrado que la consecuencia funcional de 5-metilación de la citosina es dependiente del contexto genómico y la secuencia específica en la que se produce [4,5]. La metilación de residuos de CG dentro de islas CG (CGI) en los promotores de genes está asociado con el silenciamiento de genes. Sin embargo, la metilación de CGI dentro de los cuerpos de genes se encuentra asociado con la expresión específica de tejido y la activación de genes en los genomas del cáncer [6-8].
Los paneles de genes supresores de tumores candidato conocidas han sido examinados en clínica especímenes de cáncer de pulmón para caracterizar promotor metilación [9,10], produciendo firmas concisas de metilación [11], así como para distinguir los diferentes subtipos histológicos [12]. cambios en la metilación ocurren temprano durante el desarrollo de cáncer de pulmón [13] y por lo tanto se pueden utilizar como marcadores predictivos para detectar posibles tumores malignos [14,15]. Por lo tanto, la identificación de marcas de metilación discriminatorias se puede desarrollar adicionalmente en ensayos de diagnóstico para ayudar en la evaluación del riesgo y diagnóstico.
metilación del ADN se puede medir por métodos específicos, tales como la secuenciación de bisulfito (tBGS) [16], metilación PCR específica (MSP) [17], y los métodos basados en espectrometría de masas (Epityper
®) [18]. Cada plataforma ensayos de locus específicos de metilación en una resolución más alta, en la que se define un panel de genes puede ser evaluado por el estado de metilación de un número selecto de residuos de CpG dentro de ellos. Sin embargo, estos métodos se basan en el conocimiento previo de los loci epigenómico específica para diseñar el ensayo.
Entre los métodos de descubrimiento para detectar patrones de metilación en un genoma de gran escala, un enfoque es emplear enzimas de restricción isoschizmer metilación-sensibles y resistentes ( AYUDA, RLM, otros). Otros enfoques incluyen la inmunoprecipitación de la cromatina con anticuerpos de unión a ADN metilado (MBD, MeDIP, otros), o la secuenciación de bisulfito de un componente reducido del genoma (RRBGS, otros) [19]. Cada uno de estos métodos tiene sus propios prejuicios y por la necesidad de la escala, las muestras sólo un pequeño subconjunto de los metiloma humano. la secuenciación del genoma completo de bisulfito [20] está diseñado para consultar toda la densamente metiloma a una resolución específico de base única. Sin embargo actualmente este método es muy costoso y analíticamente intensiva para llevar a cabo en muestras de gran tamaño
.
Los estudios recientes han evaluado la metilación de todo el genoma del cáncer de pulmón para descubrir las firmas de metilación específica tumoral de los genomas del cáncer [13,21,22] . Selamat
et al
[23] utiliza la plataforma Illumina Infinium HumanMethylation27k para caracterizar la metilación de todo el genoma de ~ 27.000 sitios CpG en 59 muestras de adenocarcinoma emparejados T /NT pulmonares, y se acoplan a las matrices que transcriptoma. perfilado molecular global de 230 pacientes (adenocarcinoma) y 178 pacientes (carcinomas de células escamosas) por TCGA [24,25] hecho uso de una versión ampliada de la misma plataforma, HM450k, que interroga a más de 480.000 sitios CpG, a través de las islas CpG y costas en el genoma humano.
la hipótesis de que un tumor en todo el genoma imparcial vs búsqueda no tumoral de loci diferencialmente metilado dará lugar a la identificación de nuevos loci conocidos y desregulado en el cáncer de pulmón. Además, la investigación de las mismas muestras para la expresión diferencial de genes permitiría la identificación de loci superior DM impacto, en virtud de impacto potencial sobre la expresión. Para probar estas hipótesis, se utilizó el ensayo de HELP [26] para ensayar la metilación CpG de 24 pares de tumor (T) y muestras humanas adyacentes no tumorales (NT). Este ensayo consulta fragmentos con motivos definidos 1.200.000 CCGG en todo el genoma mediante enzimas de restricción
Hpa
II (sensible a la metilación) y
Msp
(resistente metilación) para aislar fragmentos diferencialmente metiladas del genoma. Estos fragmentos son entonces ligado al adaptador y amplificados y marcados, tras lo cual son co-hibridizada a un microarray de alta densidad. La metilación se detecta en los extremos de los fragmentos generados por enzimas (sitios CCGG) y se mide como una relación de
Msp
generados-I fragmentos a
fragmentos generados-II Hpa
. El razonamiento de que los genes de metilación-desregulado podría ser más evidente si se altera la expresión afín /gen próximo, hemos examinado aún más la asociación de regiones diferencialmente metilado (DM) con los genes expresados diferencialmente (DE), utilizando los datos de expresión de ARNm de la misma t pareada y NT muestras de resección quirúrgica.
resultados
encuesta de todo el genoma de loci diferencialmente metilado en el tumor de pulmón en comparación con no tumoral
Entre 24 NSCLC donantes resección pulmonar (S1) de mesa, utilizando el ensayo HELP-microarrays se identificaron 452,754 fragmentos HpaII significativamente diferencialmente metilado (DM; p & lt; 0,05, FDR-ajustados) en el tumor frente a no tumoral adyacente (Tabla 1). De estos sitios DM, 57% se encuentra en las regiones (que comprende 38% de estos sitios CCGG representados en la matriz) de codificación. (Fig 1) Otro 39% de ellas se encuentra en las regiones intergénicas (48% de los sitios representados en la matriz) y se hypomethylated sobre todo en los tumores. Aproximadamente el 7% se encuentra en las regiones promotoras (26% de esos sitios en la matriz). promotores de genes (PR) y cuerpos de genes (GB) mostraron tanto hiper e hipo-metilación. (Tabla 1). hipometilación Promotor superó hipermetilación en número (Tabla 1). Sobre la base de una prueba de permutación llevó a cabo mediante un muestreo aleatorio dentro de los compartimentos (PR /ES /IG) se encontró que los loci DM están excesivamente representados en las regiones del cuerpo gen (p & lt; 2.2e-16).
452754 loci son significativamente diferencialmente metilado (DM) entre T y NT basado en un FDR & lt; 0.05. Mayoría de los loci DM se hypomethylated en T vs NT.
(A) Aproximadamente el 91% de los 1,2 millones de loci representados en el microarray HELP se encuentran en el cuerpo de genes (GB) y intergénica (IG) regiones, con una pequeña minoría (9%) de los loci situado dentro de los promotores (PR). (B) La significación estadística (eje Y) frente al delta (eje X) (magnitud) de la MS. Delta (eje X) indica la diferencia en la metilación entre el tumor (T) vs no tumoral (NT) en un locus dado. Loci hypermethylated en T con respecto al NT tienen delta & lt; 0. P-valor (eje Y) se calcula sobre la base de Benjamini Hochberg FDR ajustado. En FDR p & lt; 0,05, 433.505 loci a través de todos los compartimentos genómicas se encuentran para ser metilado diferencialmente en T vs NT. Los puntos rojos indican estadísticamente significativa loci DM.
La magnitud de metilación diferencial (delta) varía por compartimento y dirección del cambio. /grandes grados moderados de hipermetilación DM en PR y GB (delta & gt; 1; PR = 74%, GB = 63%) fueron más comunes que los pequeños grados (1 & lt; Delta & lt; 0,5; PR = 24%, GB = 33%) de cambios hipermetilación en estos compartimentos (Fig 2). La magnitud de grandes cambios moderados /hipermetilación fuera distinta de la de los cambios hipometilación, donde la gran distribución moderada /por región genómica se PR = 12%, GB = 14%, IG = 17%. Dentro de promotores tumorales, islas CG (CGI) y las costas del CG (CGS) fueron más a menudo de lo hypermethylated hypomethylated (figura 2B). distribución general de los loci DM variado por PR localización genómica (CGI, CGS, otros) entre todas las histologías de NSCLC (ChiSquare p = 2.2e-16) y entre adenocarcinoma de sólo (ChiSquare1.9E-4). Hubo DM sustancial fuera del CGI y CGS.
(A) Todo NSCLC histologías DM fue clasificado como insignificante, pequeño o moderado sobre la base del valor absoluto. (1 & lt; abs delta & lt; 2 es moderada /Grande; 1 & lt; abs delta & lt; 0,5 es pequeño; 0,5 & lt; abs Delta & lt; 0 es despreciable). loci DM con FDR p & lt; 0,05 basado en ensayo T por parejas fueron considerados para este análisis. La mayoría de hipermetilación en los tumores se observa que es de gran magnitud moderada /en los promotores de genes y los órganos, mientras que en las regiones intergénicas, los pequeños cambios son más frecuentes. La mayoría de hipometilación se observa que es de pequeña magnitud en todos los tres compartimientos. Una fracción significativa de los cambios hipometilación son de una magnitud insignificante todavía estadísticamente significativa. (B) Dirección de la MS y la distribución dentro de los promotores categorizados en base a la ubicación dentro CG-islas y CG-costas. Dentro de la categoría de promotor DM loci, la hipermetilación es más frecuente en los tumores en comparación con hipometilación para esos loci dentro CG-islas y CG-costas. Las diferencias globales DM varían según la localización genómica PR (CGI, CGS, otros); todas las histologías NSCLC eran ChiSquare p = 2.2e-16; adenocarcinoma de sólo la histología ChiSquare p = 1.9E-4.
genes del cáncer individuo identificado por metilación diferencial
El 25 loci diferencialmente metilado superior dentro de las regiones promotoras de genes y organismos se enumeran (S2 Mesa). En resumen, para todas las histologías se observó combinado DM en muchos promotores (S2A cuadro) [hipermetilación en
C7orf54
,
DARS
,
SPTAN1
,
DOM3Z
,
PCNX
,
CTNNAL1
, otros; hipometilación en
NQO1
,
SIRP1B
,
UNC5CL
,
NFIA
,
CST1
, otros] y en los órganos de genes [hipermetilación en
NOL10
,
ARHGEF12
,
UST
,
RGS3
,
Mbnl2
, otros; hipometilación
FBXL7
,
RYR2
,
NTRK3
,
ADAMTS12
,
PARK2
, otros]. Para el adenocarcinoma específicamente, DM se observó en promotores [hypermethylated
RASL12; SPTAN1
,
miR-26a
, hypomethylated
NQO1
,
SIRPB1
,
NF1A
] y cuerpos de genes [hypermethylated
AKAP13
,
familia ANK
,
PRKCE
,
ROS1
; hypomethylated
FAM171A1
,
PARK2
,
BCAS3
,
RHOJ
] y muchos otros.
mapas de calor de la parte superior 50 más diferencialmente metilado loci dentro del subgrupo de adenocarcinomas (figura 3A y 3B): perfil
(A) las regiones promotoras; y (B) regiones del cuerpo de genes. Varios genes muestran metilación diferencial (DM) en más de un locus y aparecen varias veces en el mapa de calor. . Azul = no tumoral, Rojo = Tumor
El 50 loci más DM superior (FDR p ajustados & lt; 0,05, clasificados en orden de magnitud del delta), reflejan la separación de T y NT en la mayoría de las muestras pareadas , excepto en las muestras 603T, 653T y 542T. Varios loci dentro del mismo gen muestran DM, lo que resulta en la recurrencia de los nombres de genes en los mapas de calor. Aquellos múltiples loci dentro de un gen (por ejemplo, PR:
TMEM88
,
GIMAP6
,
RUSC2
, otros; GB:
CDH13
,
CACNA203
,
NOMO3
, otros) tendían a ser concordante, aunque de manera imperfecta, con la dirección de la MS (hiper vs hipometilación).
CpG metilación de validación
la estados de metilación de tres representativa loci DM CCGG elegido sobre la base de la magnitud de marcos alemanes (uno en el promotor del DARS y dos en el promotor de RGS3) se determinaron cuantitativamente por la alta resolución Sequenom MassARRAY
® método, y en comparación con los resultados del ensayo basado en microarrays de ayuda para utilizar el software de Spearman correlación de orden [27]. La correlación (Rho) fue de 0,72 (p = 0,0006), lo que indica que los resultados del ensayo de AYUDA correlacionaron significativamente con los resultados de referencia de la Sequenom MassARRAY
® ensayo de referencia (S1 figura)
Identificación de clasificadores discriminatorias
La precisión media de la parte superior 100 o tumor loci 25 DM superior en comparación con los modelos de clasificación no tumorales, todas las histologías NSCLC en su conjunto, fue del 87% y 90% respectivamente. En el subconjunto de datos adenocarcinoma, la precisión media de la parte superior 100 y la parte superior 25 loci DM fue del 80% y el 79% respectivelyIn general, los modelos de clasificación tienden a ser más específico que sensible. (Tabla S7). Dos loci (
LOXL4
y
LINC00841
) fueron seleccionados en varias ocasiones dentro de los loci DM superior durante el proceso de clasificación.
La metilación x Expresión Combinar
loci de ADN se integraron con los datos de microarrays mRNA transcriptoma previamente generadas entre los 21 pares de T-NT que se disponía de ambos conjuntos de datos. (S2 figura). Este análisis produjo n = 433.666 loci DM en todos los compartimentos (Tabla 2). Por ejemplo, la puesta en común todas las histologías, identificamos n = 75 loci que mostraron hipermetilación en las regiones de relaciones públicas y concurrente baja regulación de la expresión de mRNA de microarrays. Había n = 219 loci dentro de las regiones que mostraron hipermetilación GB concurrentes y sobre regulación de la expresión.
Todas las histologías (21 pares).
La distribución subcompartimento-promotor específico (CGI , CGS, otros) de las relaciones DMxGE canónicas (
e
g
la hipermetilación del promotor:.. génica baja regulación)
frente
relaciones no canónicos (
e
g
la hipermetilación del promotor:.. génica regulación) se muestra en la figura 4. en general, dentro de las regiones de relaciones públicas, los patrones CGI tendían a seguir DM canónica: patrones de GE (primera barra de cada uno de la más a la izquierda dos tripletes de gráfico de barras dentro de un panel) algo menos frecuentemente que los otros compartimentos promotor. Es notable que no canónica DM: DE relaciones eran aproximadamente iguales en frecuencia global a las relaciones canónicas, según la evaluación de este análisis. Para los 21 pares (todas las histologías NSCLC, la figura 4A), la distribución global de las diferencias DMxDE varían según la localización genómica PR (CGI, CGS, otros), ChiSquare p = 3.32E-4. Del mismo modo, dentro del conjunto de los adenocarcinomas (figura 4B), diferencias globales DMxDE varían según la localización genómica PR (CGI, CGS, otros), ChiSquare p = 1.10E-7. La mayoría de los loci PR DM están asociados con hipermetilación cuando los loci DM se encuentran dentro de las islas CG. Este efecto es notable entre los adenocarcinomas subconjunto también, donde el DM hypermethylated loci en islas CG se asocia sobre todo con la regulación a la baja del gen.
El análisis de loci DM dentro de las regiones promotoras y su superposición con la expresión diferencial de genes. (Izquierdo Panel A) Todos los 21 pares (todas las histologías NSCLC), diferencias globales varían según la localización genómica PR (CGI, CGS, otros), ChiSquare p = 3.32E-4.
(Panel derecho B)
Dentro del conjunto de los adenocarcinomas diferencias globales varían según la localización genómica PR (CGI, CGS, otros), ChiSquare p = 1.10E-7. La mayoría de los loci DM promotoras están asociados con hipermetilación cuando los loci DM se encuentran dentro de las islas CG. Este efecto es más pronunciado entre los adenocarcinomas, donde los loci DM en las islas CG se asocia sobre todo con la regulación a la baja del gen. CLAVE: "M" = metilación, "E" = expresión. flecha hacia arriba indica aumento y la flecha hacia abajo indica disminución.
El número de loci obtenidos a partir de la superposición de expresión-metilación se visualiza en coordenadas 3D en el panel A (figura S3). genómica coordenadas también se muestran por parcelas Circos; un ejemplo del cromosoma 3 se muestra en el panel B (figura S3). Estos paneles denotan los patrones generales de cuerpo de genes y la metilación del promotor y que acompañan a los cambios de expresión de genes. La superposición entre la MS y GE para GB fue más frecuente que PR (en parte debido a la sobrerrepresentación relativa de la GB
frente a regiones de relaciones públicas en el microarray HELP (Tabla 1). El patrón canónico observa con mayor frecuencia en GB era hipometilación y la baja regulación (Fig S3).
los ejemplos de la relación cuantitativa de DM a GE en los promotores de genes y organismos se muestran en parcelas seleccionadas de dispersión (Fig S4). la mayoría de los genes que son cualitativamente canónica para la relación DM⬄GE mostró una relación cuantitativa ambigua (no se muestra);. aquellos genes que son seleccionados para la exhibición no ejemplificar una relación canónica
los ocho mejores expresados diferencialmente (dE) genes asociados con loci promotor DM (S3 Tabla:
FILIP
,
HBEF
,
TMEM88
,
VWR
,
CASP12
,
NQO1
,
CST
,
XAGE1D
) fueron sometidos a una verificación cuantitativa de GE cambios de expresión basados en microarrays, QRT-PCR utilizando a escala en
GAPDH
ama de llaves interno. S5 figura muestra estos resultados, mostrando concordancia general de dirección de GE entre las dos plataformas (microarrays y QRT-PCR;
r
2
= 0.9367815, p & lt; 0,0007), aunque con un rango dinámico comprimido de los datos de microarrays, como es típico en la literatura [28].
genes individuales reveladas por DM x GE fusionar
Todos los histologías NSCLC
: superposición de DM x dE superposición (S3 Tabla) dio loci genómico DM con los patrones de expresión canónica (
e
g
PR hipermetilación:.. mRNA downregulated y PR hipometilación: ARNm upregulated; GB hypermethylated: ARNm upregulated y hypomethylated: mRNA downregulated) [PR n = 113; GB n = 3972] (Tabla 2). Notable loci PR hypermethylated con recíproca disminución de la expresión de GE fueron
HBEGF
,
DPT
,
AGER
,
SPARCL1
,
PTPRM
,
ARHGEF6
,
TMEM88
,
Sema6A
. Aquellos PR hypomethylated loci con un aumento de GE fueron
NQO1
,
CST1
,
TNS4
,
FUT2
,
Melk
,
FAM83A
,
MMP9
,
y SLCO1B3
. Aquellos loci GB con la metilación concordantes y de expresión que se pronuncia: hypermethylated /aumento de GE:
FERMT1
,
SLC7A5
,
FAP
,
KRT15
,
ETV4
,
TFAP2A TPX2
,
FOXM1
; hypomethylated /disminución de GE:
AGBL1
,
RHOJ
,
LDB2
,
GHR
,
ITGA8
,
ABCB1
,
SEMA5A
,
GPM6A
.
Dentro de la categoría de los adenocarcinomas solos, nos fusionamos los resultados de DM con dE, y descubrimos varios loci con la metilación diferencial de promotores u organismos de genes y cambios de expresión génica afines. Hypermethylated PR loci con regulación a la baja de GE incluye
RPL23AP32
,
CTNNAL1
,
HBEGF
,
TMEM88 y CASP12
. Loci mostrando hipometilación relaciones públicas y la regulación positiva incluyen
NQO1
,
CST1
,
XAGE1D
,
IGKC y AIM2
. GB loci que muestra la hipermetilación y la regulación positiva incluyen
FAP
,
NLN
,
TPX2
,
y KIF26B
y otros. GB loci mostrando hipometilación y la regulación a la baja incluyen
AGBL1
,
RHOJ
,
LDB2
,
GHR
,
ITGA8 *
y otros ( Tabla S3)
relación
la metilación-Expresión en CG-islas y CG-shores
cuestionó la asociación entre DM y dE para los loci DM situado dentro del promotor islas CG (CGI) y las costas del CG ( CGS; define como 2 kb aguas arriba de una isla CG; figura 4; S5 Tabla). Se observó solamente un pequeño porcentaje de loci (3-11%) que exhibió DM dentro de CGI o CGS asociado con el cambio esperado en el gen de expresión del gen más cercano. Estos incluyen los genes, como
TMEM88
,
S1P1R
,
FZD4
,
GIPC2
,
DNAJB4
,
ADAMTS1
(hypermethylated en CGI y CGS y downregulated) y BUB1 (hypomethylated y upregulated).
analiza Camino
Un cuadro sinóptico de los análisis de IPA se ofrece en la Tabla S6. Todos los loci DM (Bejamini-Hochberg adj p & lt; 0,05) que corresponde a ocho categorías (basado en compartimento genómica, histología y con /sin combinación de la expresión génica) se analizaron por separado usando IPA, para identificar redes de genes enriquecidos dentro de los conjuntos de loci DM. En todos los ocho casos, "cáncer" fue la enfermedad superior asociado con el conjunto de datos de entrada, aunque los genes constitutivos eran diferentes. vías canónicas de base de conocimiento de Ingenuity que resultaron ser enriquecido dentro de los conjuntos de genes con adj. p & lt; se informa 0,05. Tres de las redes (Todas las histologías NSCLC, DM solamente, GB; adenocarcinomas DM solamente, GB, y adenocarcinomas DM + DE tanto, PR) entre las ocho categorías se encontró que tenían una asociación estadísticamente significativa con una vía canónica con adj. p & lt; 0,05, y se describen más adelante.
Redes relacionadas con el cáncer IPA representaciones.
Análisis de Redes de esas redes significativas tabulados en la Tabla S6 S6 se resumen en la figura. Las pantallas muestran que varios genes que juegan un papel importante en las vías relacionadas con el cáncer están metilados diferencialmente en T con respecto al NT en varias categorías, y destaca algunos genes que no son conocidos para hacerlo. Por ejemplo, la agrupación de todas las histologías de NSCLC, S6A Fig muestra la red relacionada con el cáncer derivado de IPA de todos los loci DM (adj p & lt;. 0.05) dentro de GB a través de todos los 24 pares T /NT. Los genes tales como
EZH2
,
CDH1
,
CDKN2A
y
DNMT3A /3B
se encuentran en los puntos centrales de esta red.
EZH2
(hypomethylated) es un miembro de la familia Polycomb-grupo y juega un papel importante en la proliferación celular, el crecimiento, la progresión del ciclo celular, la represión transcripcional y la invasión.
DNMT3A
/3B (hypermethylated) codifica un ADN metiltransferasa que se pretende para llevar a cabo la metilación de novo y tiene un papel importante en la señalización repressional transcripcional.
CDH1 gratis (hypermethylated) codifica E-cadherina, una molécula de adhesión superficial conocida regulado por disminución en los cánceres. CDKN2A (hypermethylated) es un inhibidor de CDK4 quinasa y es un gen supresor de tumor importante, conocido por ser mutado o suprimido en diferentes tipos de cáncer.
ZEB1
, GB hypomethylated, también se destaca como un nodo central en esta red relacionada con el cáncer. Que codifica un factor de transcripción con dedos de zinc (también conocido como
TCF8
), que se sabe que es un inductor de la transición epitelio-mesénquima en NSCLC [29].
Dentro de la categoría de los adenocarcinomas específicamente ( 16 pares S6B Fig muestra la red relacionada con el cáncer de genes identificados a partir de los más significativos (p ajustada & lt; 0,05). loci DM (en GB) Un eje central de esta red es el gen
AR gratis (receptor de andrógenos), que se encuentra que es GB hypomethylated en los tumores. AR es un factor de transcripción activado por el andrógeno hormona esteroide. desempeña un papel importante en el crecimiento celular, la proliferación, la muerte celular y la invasión. Debido a una centralidad aparente en esta red DM en particular, seguir explorando el patrón DM metilación de AR y su relación con el género. hemos observado que los dos fragmentos DM pertinentes (en GB) fueron notables por hipermetilación en GB en los hombres en comparación con las mujeres en NT tejido de forma única (prueba t FDR, el fragmento 1 = 0,041, fragmento 2 = 3.76E-5). Supervillin
(SVIL)
, es también un gen en un centro de esta red (S6B la figura), y es el GB hypomethylated en los tumores.
SVIL
es una proteína de membrana periférica que regula la motilidad celular, la difusión y es conocido para mejorar la supervivencia celular mediante la interacción con el gen supresor tumoral p53 y sus objetivos de abajo [30].
Adenocarcinoma específica promotor DM x DE superposición le dio realce familiarizado (
SMAD6
,
TP53
,
CTNNB1
,
NQO1)
, así como nodos IPA cáncer de pulmón no familiares ( S6C figura). La red relacionada con el cáncer derivada de este análisis consistió en un solo promotor del gen hypomethylated (NQO1) en el nodo de un clúster de interactuar con
TP53
,
HSP70 y NPM1
. Varios promotores de genes hypermethylated incluyendo
HBEGF
,
SMAD6
,
PTPN13
,
CDH5
y
SFTPC
fueron encontrados en la periferia de la red. Esta red está compuesta de varios genes que no son identificados como DM de nuestro estudio, pero no forman parte de la red en virtud de sus interacciones publicados anteriormente con otros loci DM, como se muestra en formas abiertas /blancas.
corriente vs Los ex fumadores
El conjunto de muestras de 24 sujetos constaba de 11 ex fumadores y 10 fumadores actuales. Se investigó la presencia de loci diferencialmente metilado basado en el consumo de tabaco. En ajustado p & lt; 0,05, no se encontraron loci para ser DM entre fumadores y exfumadores
Discusión
Se presenta un estudio de comparación metiloma para un conjunto de tumores de NSCLC
contra
el tejido no tumoral emparejados en muestras de resección quirúrgica con el fin de identificar las firmas de metilación de todo el genoma en el cáncer de pulmón, y filtrarlos para aquellos pertinente a las alteraciones de la expresión génica de las mismas muestras. El objetivo es informar el trabajo de diagnóstico biomarcador ya en curso en el laboratorio, [31] y la identificación de objetivos para el desarrollo futuro en los ensayos terapéuticos preventivos y de diagnóstico /[32,33].
Usando el ensayo de HELP, hemos sido capaces de consultar 1.200.000 loci CCGG discontinua (~ 1% de la metiloma) en un representante manera de todas las regiones de tres genómico (PR, GB, IG). El uso de un p & lt FDR ajustado; 0,05 como punto de corte, 452.754 loci en todas las regiones y histologías muestra estadísticamente significativa metilación diferencial en los tumores. La distribución de estos sitios DM fue notablemente más concentrada en los órganos de genes que en las regiones promotoras, incluso teniendo en cuenta las variaciones regionales de representación en el microarray detector, como el apoyo de una permutación de prueba.
Los estudios hasta ahora han enfocado típicamente en la metilación del promotor en el cáncer de pulmón, utilizando centrado promotor microarrays personalizados [10,15,34] o matrices de perlas [23,35] y por lo tanto a menudo consulta sólo para las regiones genómicas preseleccionados y loci. Este es uno de los pocos estudios realizados hasta la fecha en la que examina más agnóstico metilación de todo el genoma en todas las regiones del genoma del cáncer de pulmón en múltiples muestras. Las regiones del genoma se ensayó mediante el ensayo de HELP dependen de las ocurrencias de sitios CCGG dentro del genoma, y no por cualquier clasificación funcional o un compartimento a gota antes de los loci. El ensayo HELP es menos promotor sesgado (regiones GB y IG se representan regiones promotoras veces 3.5x), permitiendo de este modo el descubrimiento de nuevos eventos asociados con la metilación en otras regiones genómicas en muestras de tumores [36]. Sin embargo, el ensayo no alcanza HELP sitios CpG incorporados no CCGG, así como aquellos CCGGs que definirían un intervalo de tamaño fuera del intervalo de tamaño de fragmento diana (200-2000bp). HELP (a diferencia de las matrices Infinium HM) no se centra en la detección de los CpG contiguos de promotores de genes predefinidos. Si bien la magnitud de las diferencias DM globales entre tumores y tejido pulmonar no tumoral en un locus dado tendía a ser pequeño (generalmente & lt; 2 veces), tranquilizador es que la validación de loci DM pre-seleccionado se compara favorablemente con la técnica de referencia cuantitativa ( Sequenom MassARRAY
®).
al examinar las listas de genes de la parte superior loci DM descubierto entre otros todo el genoma estudios publicados en el cáncer de pulmón a los reportados en nuestro estudio, se encontró que, como era de esperar, la grado de solapamiento entre nuestros estudios y otros es modesto, posiblemente indicativos de las diferencias en la plataforma HELP (que detecta fragmentos delimitadas por los sitios CpG, pero no adicional fragmento interno de sitios CpG), y las regiones objetivo buscado (que a su ayuda son igualmente distribuido entre las regiones de relaciones públicas, GB, e IG del genoma. además, observamos que el grado de solapamiento entre los estudios que utiliza el mismo metilación microarrays de base (por ejemplo, matriz Infinium) ([23,24,35] tampoco era grande. Esto podría deberse a diversos factores sujeto y heterogeneidad de la muestra, y los criterios utilizados para clasificar los loci DM. Por ejemplo, Sandoval
et al
[35] identificaron un
HOXA7
región entre los principales promotores CpG más variables, mientras que el mismo locus no se informó en el estudio TCGA [24] que utiliza el misma plataforma. Por otra parte, estos dos estudios informan de metilación diferencial de la
Hoxa9
locus. Ambos de estos loci no figuran en las listas de la parte superior loci DM de nuestro estudio
Los resultados generales de este estudio incluyen lo siguiente:. Hay muchos loci individuales DM /genes, en particular en los órganos de genes (S2 y S3 Tablas ); hay muchas relaciones DMxDE no canónicos; y genelists y relaciones de red incluyen tanto previamente reconocida y una miríada de loci no reconocido previamente. Como se ha reconocido con anterioridad, el genoma es en general más hypomethylated, pero también muestra la hipermetilación del promotor de cáncer en comparación con los tejidos no cancerosos pareadas, como fue cierto de todo el genoma estudios tempranos de metilación diferencial en el cáncer de pulmón [2,21-23]. Sin embargo, muchas características se diferencian claramente;