Extracto
Fondos
invasión peritoneal en el cáncer de colon es un factor pronóstico importante. invasión peritoneal puede ser objetivamente identificado como invasión periotoneal elástico laminal (ELI) mediante el uso de la mancha elastica, y el microambiente cáncer formado por la invasión peritoneal (CMPI) también se pueden observar. Los casos con ELI muestran con mayor frecuencia metástasis a distancia y la recurrencia. Por lo tanto, CMPI puede representar un medio particular que facilita la progresión tumoral. patológica y biológicos en CMPI pueden arrojar luz sobre este microambiente del cáncer posiblemente distintivo.
Métodos
Se analizaron microarrays de tejidos específicos de cada área para determinar las características patológicas de la CMPI, y propagados subperitoneales fibroblastos (PESA ) y fibroblastos de la submucosa (SMF) de tejido de colon humano. Características biológicas y resultados de los análisis del perfil de expresión génica se compararon para comprender mejor la invasión peritoneal de cáncer de colon y cómo esto pueden formar un microambiente especial a través de la interacción con PESA. xenoinjertos de tumores de ratón, derivadas por la co-inyección de células cancerosas, ya sea con FPS o SMF, se establecieron para evaluar su papel activo en la progresión tumoral y la metástasis.
Resultados
Se encontró que la fibrosis con alfa actina de músculo liso (α-SMA) expresión era una característica patológica importante de CMPI. Las diferencias en la proliferación y la expresión génica perfil analiza sugirieron PESA y SMF eran poblaciones distintas, y que SPFs se caracterizan por un alto expresiones de la matriz extracelular (ECM) -asociado genes. Además, en comparación con SMF, mostraron alteración FPS más variable en las expresiones de genes después de la estimulación medio acondicionado de células cancerosas. Gene ontología análisis reveló que los genes regulados positivamente SPF-específicos fueron enriquecidos por la actina vinculante o genes contráctiles asociada incluyendo α-SMA codificación ACTA2. tumores de xenoinjertos de ratón obtenidos por co-inyección de células de cáncer con FPS mostraron mejora del crecimiento del tumor, metástasis, y la capacidad para la formación de tumores en comparación con los derivados de co-inyección con las células cancerosas y SMF.
Conclusiones
CMPI es un microambiente especial, y la interacción de PESA y células cancerosas dentro de CMPI promover el crecimiento tumoral y la metástasis
Visto:. Kojima M, Higuchi y, Yokota M, Ishii G, Saito N, Aoyagi K, et al. (2014) Human subperitoneal de fibroblastos y el cáncer de interacción célula crea microambiente que mejora la progresión tumoral y la metástasis. PLoS ONE 9 (2): e88018. doi: 10.1371 /journal.pone.0088018
Editor: Soroku Yagihashi, Hirosaki University Graduate School of Medicine, Japón
Recibido: 27 de septiembre de 2013; Aceptado: 2 Enero 2014; Publicado: 4 Febrero 2014
Derechos de Autor © 2014 Kojima et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por la JSPS KAKENHI subvención número 24590458, y una donación de una Estrategia Integral de 10 años 3ª plazo para el control del cáncer (23-a-3). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
a pesar de que el tamaño del tumor es un factor pronóstico importante en muchos tipos de cáncer, el pronóstico en el cáncer gastrointestinal es estratificado no por el tamaño del tumor, sino por la extensión del tumor [1]. invasión peritoneal en el cáncer colorrectal se ha informado a ser un factor de pronóstico fuerte, pero este término no estaba bien definido, y se han cuestionado los métodos de detección y diagnóstico [2] - [4]. informes patológicos recientes han demostrado que la mancha elastica, que pone de relieve la lámina elástica peritoneal cerca de la superficie periotoneal, es útil para la detección objetivo de la invasión peritoneal. Nosotros y otros han determinado que la invasión peritoneal definido como la invasión tumoral más allá de la lámina elástica peritoneal (elástico invasión laminal: ELI) es un fuerte factor pronóstico que pueden influir en futuros criterios de Pt en la Unión Internacional contra el Cáncer (UICC) clasificación TNM [5] - [7]. El peritoneo es una membrana muy delgada, dentro de 500 m de espesor, y existe la lámina elástica peritoneal dentro de esta membrana. La frecuencia de metástasis sincrónica y la recurrencia se incrementa en 2 a 4 veces cuando un tumor invade este espacio estrecho [5]. Estos resultados pueden sugerir que la progresión tumoral y la metástasis son facilitadas por un microambiente cáncer formado por la invasión peritoneal (CMPI). El grado de CMPI se puede identificar mediante el uso de la mancha elastica, y las características patológicas de CMPI también se puede determinar.
A microarray de tejido facilita la evaluación de la expresión de proteínas para un gran número de bloques de tejido a partir de una sola muestra, y microarrays de tejidos específicos de cada área se han reportado para ser útil para el estudio de las zonas tumorales específicos en grandes cohortes [8]. Después de la determinación de CMPI utilizando mancha elastica, un núcleo de tejido se puede obtener de esta área y una comparación con las características de otras áreas tumorales también se puede realizar. Este proceso puede permitir una evaluación de los fenómenos biológicos importantes que se producen en este microambiente del cáncer.
Los recientes avances en la investigación del cáncer han establecido el concepto de microambiente del cáncer que promueve la iniciación del tumor, invasión y metástasis [9]. Aunque el microambiente del cáncer se compone de muchos tipos de células, el uso de microarrays de tejidos específicos de cada área puede permitir un enfoque en los componentes celulares que caracterizan CMPI. Por otra parte, si estos componentes celulares pueden cultivarse desde la región histológicamente subperitoneal correspondiente, un estudio biológico para dilucidar este microambiente putativo promotor de cáncer se puede realizar.
El objetivo de este estudio fue explicar cómo el pronóstico del cáncer colorrectal se ve afectada por la invasión peritoneal. Hemos construido sistema de microarrays de tejidos específicos de cada área para determinar los componentes celulares característicos de CMPI. A continuación, cultivamos subpoblaciones específicas de fibroblastos de la submucosa y las capas subperitoneales de la pared del colon humano. Las características biológicas y los perfiles genéticos de los fibroblastos de la submucosa (SMF) y fibroblastos subperitoneales (PESA) con o sin medio acondicionado de las células del cáncer se compararon (CCCM) estimulación. Posteriormente, se construyó tumores de xenoinjertos por co-inyección de las células cancerosas, ya sea con o FPS SMF. Nuestro estudio propone un nuevo candidato para un microambiente promotor de cáncer en el cáncer de colon y se aclararán FPS jugadores como cruciales en la mejora de la progresión tumoral y la metástasis.
Pacientes y métodos
Ética Declaración
Este estudio fue aprobado por el Comité Nacional de Revisión del hospital Cancer Center de Oriente Institucional (No: 19-021). Un consentimiento general por escrito el uso de materiales biológicos para la investigación se obtuvo de cada participante antes de la adquisición de tejidos. Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Centro Nacional del Cáncer Hospital del Este (K11-032).
Características de los pacientes y la detección de ELI
Cuatrocientos pacientes consecutivos con la clasificación TNM (5
ª edición) pT3 y pT4a cáncer de colon [10], sometidos a cirugía entre 1996 y 2003 en el Centro Nacional del cáncer hospital del Este, se inscribieron. El uso de cloruro elastica, se identificaron 173 casos con ELI y examinamos más a fondo estas utilizando microarrays de tejidos específicos de un área [5], [8]. De los 173 casos con ELI, 107 eran pT3 y 66 eran pT4a.
Construcción de microarrays de tejidos de la zona específica del
Para dilucidar las características patológicas de la CMPI en el tejido de cáncer de colon, que definimos el cáncer microambiente de la siguiente manera: (a) CMPI tiene un borde tumor con invasión peritoneal y (b) el microambiente cáncer formado por la invasión de la submucosa (CMSI) tiene una submucosa invasiva frontera tumor (Figura 1A) [5]. Se estableció entonces los microarrays de tejidos de 2 puntos como [8] se describe anteriormente. Cada área del tumor fue marcado con tinta sobre el portaobjetos histológico; un solo núcleo de tejido de 2 mm de diámetro se obtuvo de cada microambiente del cáncer y se transfiere a un bloque receptor que usa un tejido Microarrayer (Azumaya, Tokio, Japón). En 24 casos, se obtuvo el tejido de cáncer insuficiente desde el CMPI. Sin embargo, se obtuvo tejido suficiente en 149 casos; éstos se analizaron histológicamente y el estudio inmunohistoquímico (ver Materiales y Métodos S1 y el cuadro S1).
(A) Esquema de la microambiente cáncer formado por la invasión peritoneal (CMPI) y el microambiente del cáncer formada por la invasión submucosa (CMSI) se define como (a) frente invasivo con la invasión peritoneal y el frente invasivo (b) de la submucosa, respectivamente. (B) La distribución de la fibrosis en el tejido de cáncer de colon humano. barras grises oscuros muestran el número de los casos con fibrosis más del 50% del núcleo de cada área del tumor y la luz barras grises muestran el número de los casos sin fibrosis extensa. Las muestras de núcleos con CMPI mostraron una mayor frecuencia de la fibrosis marcada que hicieron muestras de núcleo con CMSI (
P Hotel & lt; 0,01). (C) de distribución de la expresión de α-SMA en el tejido de cáncer de colon humano. CMPI mostró expresiones más altas α-SMA que los vistos en la CMSI (
P Hotel & lt; 0,01). (D) La distribución de células CD3 positivas en el tejido de cáncer de colon humano. El número de células CD3 positivas no fueron significativamente diferentes entre CMPI y CMSI. (E) Distribución de las células CD68-positivas en el tejido de cáncer de colon humano. El número de células CD68-positivo no fueron significativamente diferentes entre CMPI y CMSI. (F) La distribución de los vasos CD31-positivo en el tejido de cáncer de colon humano. Los números de los vasos CD31-positivo no fueron significativamente diferentes entre CMPI y CMSI. Los resultados en (B) están representados por números de casos, y los de (C-F) se presentan como la media ± SD de 149 casos (**
P Hotel & lt; 0,01).
los anticuerpos, Regents, e inmunohistoquímica
los anticuerpos, reactivos y los procedimientos inmunohistoquímicos utilizados se describen en Materiales y Métodos S1 y S2 la tabla.
Evaluación del Área específica de microarrays de tejidos secciones
diapositivas de imágenes de alta resolución fueron adquiridos de todos los núcleos de tejido con hematoxilina-eosina (HE) y la tinción inmunohistoquímica, utilizando NanoZoomer escáner de diapositivas 2,0-HT (fotónica Hamamatsu, Hamamatsu, Japón). Todos los núcleos fueron examinadas usando software de visualización (NDP vista: fotónica Hamamatsu, Hamamatsu, Japón). Cuando el área de fibrosis superó el 50% de un núcleo de todo el tejido con un diámetro de 2 mm en la tinción H.E, se define como positiva para fibrosis marcada. En la tinción inmunohistoquímica, los puntos calientes con CD3, CD31-, CD68-positivas y se seleccionaron las células o los vasos en el software de visualización, a continuación, una imagen de magnificación x20 (0,51 mm
2) fue tomada, y se guardan como un archivo JPEG . Las células positivas o vasos fueron contados en cada imagen usando el software morfométrico (WinRoof, Mitani Corporation, Fukui, Japón). Por otra parte, la zona con mayor alfa actina de músculo liso expresión (α-SMA) en fibroblastos fue seleccionado, y luego una ampliación x20 (0,51 mm
2) fue tomada la imagen, y se guardan como un archivo JPEG. La relación del área de α-SMA positivos en la imagen se calculó usando software morfométrico, tal como se describe anteriormente [11]. La expresión α-SMA en el tejido muscular normal, tal como se determina por comparación con un tobogán H.E serie, no se evaluó. HE y los datos de tinción inmunohistoquímica de CMPI se comparó con la de la CMSI para dilucidar las características histológicas del CMPI.
Primaria células y líneas celulares
El tejido submucoso se obtuvo a partir de tejido de colon sigmoide más de 5 cm distante del tumor. tejido colónico se diseccionó de la capa muscular en el lado luminal, y se obtuvieron lámina propia y de los tejidos de la capa de la mucosa. A continuación, la lámina propia se restregó distancia para obtener tejido submucoso. tejido subperitoneal se obtuvo del mesenterio colon sigmoide en más de 5 cm de distancia del tumor mediante el uso de pinzas que funcionan y tijeras. Estos tejidos se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se incubaron en 5% de tripsina durante 20 minutos, 3 veces. El sobrenadante se centrifuga, se sembraron en un plato, y se obtuvieron fibroblastos de la submucosa (SMF) y fibroblastos subperitoneales (PESA) y luego se cultiva y se mantiene en MF-medio (Toyobo, Tokio, Japón) [12]. Todos los experimentos se realizaron en las células dentro de las 8 pasajes.
Las líneas celulares de cáncer colorrectal humano DLD-1 y Caco-2 se obtuvieron de la American Type Culture Collection y se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (Sigma- Aldrich, Saint Louis, MO) que contenía 100 U /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO), y suero bovino fetal al 10% (FBS;. Gibco, Palo Alto, CA):
ensayo de proliferación celular, inmunocitoquímica de tinción, y análisis de citometría de flujo
ensayos de proliferación celular, tinción inmunocitoquímica, y citometría de flujo se realizaron análisis como se describe en Materiales y Métodos S1.
estimulación de fibroblastos por Cancer Cell Medium
Inicialmente, 1,7 × 10
4 /cm
2 de fibroblastos y células DLD-1 se cultivaron por separado en DMEM que contiene 100 U /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina, y el 10% de SFB durante 48 horas, y luego se mantuvieron en ayunas durante 24 horas. A continuación, se retiró el medio de los fibroblastos, y se añadió el medio de las células DLD-1 murieron de los fibroblastos durante 24 horas para establecer fibroblastos con estimulación medio acondicionado de células de cáncer (CCCM). Como control, los fibroblastos se mantuvieron en ayunas durante 48 horas (rendimiento fibroblastos sin CCCM). PESA y SMF, ya sea con o sin CCCM se evaluaron mediante el uso de análisis de inmunocitoquímica o la expresión génica. En cuanto a la evaluación de la expresión de α-SMA inmunocitoquímica, se seleccionó el área con alta expresión α-SMA, a continuación, una ampliación x20 (0,51 mm
2) la imagen fue tomada, y se guarda como un archivo JPEG. La relación del área de α-SMA positivos en la imagen se calculó utilizando el software de morfometría (WinRoof, Mitani Corporation, Fukui, Japón). Análisis FODA
Expresión génica mediante microarrays
Tres juegos de FPS y SMF , ya sea con o sin CCCM, obtenido a partir de 3 pacientes diferentes, se utilizaron en este estudio. Utilizamos GeneChip Human Genome U133 Plus 2,0 arrays (Affymetrix, Santa Clara, CA). Target ADNc se genera a partir de 100 ng de ARN total extraído de cada muestra usando un kit de 3 'IVT Express (Affymetrix, Santa Clara, CA). Los procedimientos para la hibridación con la diana, el lavado y la tinción de amplificación de la señal se realizaron de acuerdo con los protocolos del proveedor. Los arrays se escanearon con un escáner de Gene Chip de 3000 (Affymetrix, Santa Clara, CA), y la intensidad de cada característica de la matriz se calculó mediante el uso de GeneChip Software operativo, versión 1.1.1 (Affymetrix, Santa Clara, CA). La intensidad media se estandarizó a la intensidad de destino, que se fijó igual a 1000, para comparar de forma fiable diferentes matrices. Los valores fueron log transformado y centrado en la mediana. El GeneSpring programas (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) y Excel (Microsoft Corporation, Redmond, WA) fueron utilizados para realizar el análisis numérico para la selección de genes.
xenoinjerto Trasplante y formación de tumores Ensayo
cualquiera de 1 × 10
6 humana células de cáncer colorrectal Caco-2 o DLD-1 solo, o ya sea con 1 x 10
6 SPFs o SMF, fueron inyectados por vía subcutánea (sc) en la parte posterior de los ratones SCID (8 -12 semanas de edad; CLEA, Tokio, Japón). Los volúmenes tumorales se calcularon semanal como se ha descrito anteriormente [13]. Los ratones inyectados con células Caco-2 solo o con cualquiera de FPS o SMF murieron después de 10 semanas, y aquellos inyectados con DLD-1 solo o con cualquiera de FPS o SMF fueron asesinados después de 8 semanas, y se evaluaron los pesos del tumor. Para el análisis metastásica distante, se eliminó el tejido de pulmón y el hígado y se fijó en formalina al 10%, y para el análisis de la metástasis de los ganglios linfáticos, el cuello y el tejido adiposo inguinal también se retiró y se fija; Todos los tejidos se examinaron histológicamente. Se utilizó 8 ratones en cada grupo.
Para dilucidar la capacidad de los fibroblastos para mejorar la formación de tumores, diluciones en serie de DLD-1 en las células de cáncer de Caco-2 o se co-inyectados con 1 x 10
6 SMF o PESA. La formación de tumores se evaluó 4 semanas después de la inyección. Utilizamos 4 ratones para cada grupo.
Análisis estadístico
X
2 test y
t de Student
se utilizaron en los microarrays de tejidos análisis, ensayo de proliferación celular, el trasplante de xenoinjerto, y ensayo de formación de tumor. A
P
& lt; 0,05 se definió como estadísticamente significativo. En el análisis de microarrays, los datos de expresión génica se analizaron mediante GeneSpring GX12 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). datos de fila se resumieron mediante el uso de MAS5 y normalizado por la transformación logarítmica y la mediana de centrado para el análisis numérico para la selección de genes. Para el análisis de componentes principales (PCA), se utilizó la sonda fija que se midieron de forma fiable y variada por 3 veces por encima de la media global en al menos 2 muestras (aproximadamente el 10%); Los análisis se realizaron con GeneSpring GX12. Los conjuntos de sonda expresados diferencialmente utilizados en la agrupación jerárquica supervisado fueron seleccionados en base a
P Hotel & lt; 0,05 y doble cambio (FC) & gt; 2,0.
Los valores P
se calcularon utilizando ANOVA de una vía con Benjamini y Hochberg FDR múltiples pruebas de corrección. La agrupación jerárquica con promedio en peso vinculación agrupación se realizó utilizando programas de racimo y Treeview (Michael Eisen, Universidad de Stanford, genome-www.stanford.edu). La agrupación anotación funcional de análisis de ontología de genes de enriquecimiento se realizó utilizando el software de DAVID, con la rigurosidad de clasificación establecido en "Alto", y los grupos significativos fueron seleccionados en base a una puntuación de enriquecimiento & gt; 2,0 y un
P Hotel & lt; 0.01 (prueba exacta de Fisher después de Benjamini y Hochberg FDR múltiples pruebas de corrección) [14], [15].
Resultados
características histológicas de ELI
No sólo las células tumorales, sino también las variedades de células del estroma constituyen un microambiente del cáncer distinto, y algunas promover la metástasis del tumor [9]. En primer lugar, hemos dilucidado las características histológicas significativas de CMPI para arrojar luz sobre los fenómenos que ocurren en este ambiente mediante el uso de microarrays de tejidos específicos de cada área. Las características clínico-patológicas de los 149 casos utilizados se muestran en la Tabla S1. En la tinción H.E, encontramos fibrosis extensa (más de 50%) con más frecuencia en CMPI de lo que se ve en la CMSI (Figura 1B). La relación de área de α-SMA positivos en CMPI también fue mayor que la observada en CMSI (Figura 1C). Las proporciones de los linfocitos T, macrófagos, o microvasos evaluados utilizando CD3, CD68, o CD31, respectivamente, no fueron significativamente diferentes entre CMPI y CMSI (Figura 1D-F). Tanto en CMPI y CMSI, fibroblastos fusiformes regordetas eran la principal fuente de expresión α-SMA, y la relación se analizó con éxito mediante el uso de software morfométrico (Figura 2A-D). Teniendo en cuenta nuestros resultados anteriores, lo que indica que la invasión peritoneal definido por ELI estaba estrechamente asociado con metástasis a distancia, la hipótesis de que los fibroblastos en la capa subperitoneal podrían estar implicados no sólo en la fibrosis y la activación prominente, sino también en la progresión y la metástasis del tumor. Decidimos entonces para aislar los fibroblastos de la capa subperitoneal que histológicamente correspondió a la invasión peritoneal. Los fibroblastos de la capa submucosa se utilizaron como controles.
(A) Las características histológicas del componente estromal de CMPI. Tanto en CMPI y el microambiente del cáncer formado por submucoso invasión (CMSI), fibroblastos fusiformes regordetas eran las principales fuentes de la estroma. (B) Marcado expresión α-SMA se encontró en los fibroblastos. (C) Un aumento mayor revela con mayor claridad los fibroblastos fusiformes regordetas. (D) El uso de software morfométricos, que hemos detectado con éxito y analizamos la expresión α-SMA.
Aislamiento y Caracterización de FPS cultivadas humanos y SMF
En un primer momento, se evaluaron las características morfológicas y biológicas características del PESA y SMF en un estado normal. Tanto FPS humanas cultivadas y SMF mostraron características morfológicas similares en forma de huso (Figura S1 A-B). PESA y SMF a partir de 3 pacientes podrían cultivarse más de 10 pasajes, a excepción de 1 caso SPF (datos no mostrados). La inmunocitoquímica y citometría de flujo reveló el PESA y SMF obtenidos fueron consistentes con los fibroblastos (Figura S1C-D). Encontramos una expresión débil α-SMA en pocos PESA y SMF. El tiempo de duplicación para PESA y SMF fue 79,9 horas y 36,3 horas, respectivamente, y el crecimiento de SMF era más rápido que el de FPS (
P
& lt; 0,05), lo que sugiere una diferencia biológica entre PESA y SMF ( Figura S1E).
perfiles de expresión génica Comparación entre el PESA y SMF
Para evaluar las diferencias fenotípicas entre PESA y SMF, se compararon los perfiles de expresión génica de fibroblastos con o sin estimulación CCCM. PCA reveló 4 grupos distintos, dependiendo de su origen y la CCCM estimulación, que se sobrepuso a la variación individual (Figura 3A y B). análisis de agrupamiento supervisado también reveló 4 grupos distintos (Figura 3C). Esto indica la diferencia fenotípica en los fibroblastos dentro de la pared del colon. Y esta diferencia depende de la ubicación histoanatomical. Por otra parte, la reacción a la estimulación CCCM también fue diferente.
(A) El rojo es el perfil de microarrays en SMF con la estimulación CCCM, el azul es SMF sin estimulación CCCM, el verde es FPS con la estimulación CCCM, y la plata es sin FPS estimulación CCCM. representación tridimensional de un análisis de componentes principales (PCA) Componente 1, 2 y 3. (B) Dos representación tridimensional de los componentes de PCA 1 y 2 (parte superior), y los componentes de PCA 1 y 3 (inferior). Los fibroblastos forman grupos independientes, dependiendo del sitio histoanatomical y la presencia de estimulación CCCM. (C) el análisis de conglomerados supervisada en fibroblastos también reveló grupos distintos en función de sitio histoanatomical y la presencia de estimulación CCCM. análisis (D) Gen ontología de genes upregulated en comparación con SPF SMF. análisis (E) de Gene ontología de genes regulados positivamente en FPS con la estimulación CCCM, en comparación con la estimulación con SMF CCCM. La mayoría de los genes con el aumento de expresiones en FPS fueron retenidos después de la estimulación CCCM; Sin embargo, hubo algunas diferencias, y el orden de los grupos de anotación se cambiaron después de la estimulación CCCM.
A continuación, se compararon los perfiles de expresión de genes en estos fibroblastos con y sin estimulación CCCM, por separado (Figura 3D-E ). Los datos de FPS sin estimulación CCCM fueron enriquecidos por la ontología de genes (GO) "matriz extracelular" y "matriz extracelular proteica", que se formó clúster anotación 1. Mayor expracellular matriz (ECM) componentes de colágeno (COL1A1, COL4A1, COL4A2, COL5A1 y COL16A1), laminina, fibronectina o fueron incluidos en este grupo. Además, la expresión de genes relacionados con los componentes que se unen a la ECM también se upregulated en PESA y formó anotación grupo 2. clúster Anotación 3 se enriqueció para GO términos asociados con "gránulos" o "vesículas" (Figura 3D y Tabla S3). Este resultado sugiere el perfil de expresión de genes asociados con la función básica en los fibroblastos es diferente entre PESA y SMF dentro de la pared del colon. Los 20 genes altamente expresados en FPS también incluyeron varios componentes de ECM. Los genes asociados con la fibrogénesis o la diferenciación de miofibroblastos FLI1 y NOX4 también fueron encontrados en los 20 genes (Tabla S4). Entre otros genes altamente expresados en FPS sin estimulación CCCM, encontramos POSN, SPARC, o COL4A1, que son conocidos por ser altamente expresado en el estroma del cáncer; y muchos de estos son factores pronósticos [11], [16], [17]
La mayoría de los genes con el aumento de expresiones de FPS sin estimulación CCCM también fueron retenidos en presencia de estimulación CCCM.; Sin embargo, hubo algunas diferencias (Figura 3D-E, Tabla S5-6). En GO análisis de FPS con la estimulación CCCM, el orden de los grupos de anotación se han cambiado en comparación con la observada en FPS sin estimulación CCCM. Entre los 20 genes, 13 genes se conservaron y fueron reemplazados 7 genes. Estos resultados sugieren una diferencia en la reacción a la estimulación CCCM entre PESA y SMF. La existencia de PESA específicas de los genes que se upregulated después de la estimulación se estimó CCCM.
A continuación, analiza estos genes para establecer las características biológicas del SPF después de la exposición a la CCCM. Un diagrama de Venn reveló 193 genes regulados positivamente en PESA y 59 en SMF después de la estimulación CCCM. De estos, 51 fueron comúnmente regulados positivamente tanto en el PESA y SMF, 142 eran específicos del PESA, y sólo 8 eran SMF específica (Figura 4A). A continuación, también se centró en los genes regulados negativamente, y descubrimos 215 en el PESA y 146 en SMF. De éstos, 138 se downregulated comúnmente tanto en PESA y SMF, 77 eran específicos del PESA, y sólo 8 eran SMF específica (Figura 4B). Estos resultados sugieren que SPFs mostraron alteración más variable en la expresión génica después de la estimulación CCCM. GO término análisis de los genes específicos SPF-downregulated después de la estimulación CCCM no reveló ninguna agrupación anotación más de 3,0 de la puntuación de enriquecimiento (datos no mostrados). En contraste, análisis GO plazo de genes PESA-específicos regulados positivamente después de la estimulación CCCM reveló que términos como "actina", "fibra contráctil" "citoesqueleto proteína de unión", "dominio LIM", "pieza de fibra contráctil", "sarcómero" y "miofibrillas" formada clúster anotación de 1-3 (Figura 4C). La mayoría de estos genes eran conocidos por estar relacionados con la contracción de la célula. Entre los 20 genes fueron muchos genes del citoesqueleto o la contractilidad asociados. Sorprendentemente, ACTA2 que codifica α-SMA se reguló específicamente en SPF después de la estimulación CCCM (Figura 4D). Este resultado se confirmó mediante inmunocitoquímica (Figura 4E-F). Los análisis morfométricos en la expresión inmunocitoquímica reveló que la expresión de α-SMA se reguló específicamente y de manera significativa en FPS después de la estimulación CCCM en el nivel de proteína (Figura S2,
P Hotel & lt; 0,05). la regulación positiva variable y regulación a la baja de los genes después de la estimulación CCCM era una característica significativa en FPS. ACTA2 codificación de α-SMA se incluyen en este conjunto de genes upregulated SPF-específica. fibroblastos asociados con el cáncer (CAF) incluyen miofibroblastos activados α-SMA-positivas. Junto con el resultado de microarrays de tejidos específicos de la zona, marcada expresión α-SMA en CMPI se dependía en el carácter sensible de SPF que puede asociados con la diferencia de microambiente del cáncer.
Genes (A) upregulated por la estimulación CCCM . (B) Los genes regulados negativamente por la estimulación CCCM. (C) Top 3 grupos de anotación en el análisis de la ontología de genes de los genes específicos del PESA-regulados positivamente por la estimulación CCCM. (D) Top 20 genes upregulated específicamente en SPF después de la estimulación CCCM. (E) Inmunocitoquímico α-SMA expresión en SMF después de la estimulación CCCM. expresión (F) Inmunocitoquímico α-SMA en SPF después de la estimulación CCCM. la expresión de α-SMA se reguló específicamente en SPF después de la estimulación CCCM (véase también la figura S2).
FPS mejorar el crecimiento tumoral, metástasis tumoral y Formación de Capacidad con más fuerza que haga SMF
Para dilucidar las diferencias funcionales de los fibroblastos en la pared del colon, se inyecta líneas celulares de cáncer colorrectal humano Caco-2 o DLD-1 pb, solo o junto con cualquiera de FPS o SMF, en ratones SCID. A las 7 semanas después de la inyección, todos los ratones demostraron la formación de tumores. El crecimiento de los tumores derivados de las células cancerosas inyectadas junto con el PESA creció más rápido que el que surge de la inyección de las células cancerosas por sí solos o co-inyección con SMF (Figura 5A). Los pesos finales de los tumores derivados de células de cáncer de co-inyectados con FPS eran también más grande que los derivados de la inyección de células de cáncer solo o de co-inyección con SMF (Figura 5B). Aunque la diferencia no fue estadísticamente significativa, los tumores derivados de la co-inyección de células DLD-1 con un factor con más frecuencia dieron lugar a metástasis de ganglios linfáticos que aquellos formados a partir de la co-inyección de células DLD-1 con SMF (Figura 5C).
(a, izquierda) el crecimiento del tumor de xenoinjerto en ratones inyectados con DLD-1 células de cáncer colorrectal humana por sí sola (línea azul, 840,7 ± 112,6 mm
3 de cada 7 semanas), co-inyectados con DLD-1 células y fibroblastos de la submucosa (SMF; línea roja, 1178.0 ± 177.6 mm
3 de 7 semanas), y co-inyectados con células DLD-1 y fibroblastos subperitoneales (PESA; línea verde, 1672.8 ± 214.7 mm
3 en 7 semanas). Las diferencias de volumen del tumor entre las células DLD-1 solo y células DLD-1 con el PESA, y entre las células DLD-1 solo y células DLD-1 con SMF fueron estadísticamente significativas (
P Hotel & lt; 0,05). (A la derecha) el crecimiento de xenoinjerto de tumor en ratones inyectados con Caco-2 células de cáncer colorrectal humana por sí sola (línea azul, 308.6 ± 127.7 mm
3 en 9 semanas), co-inyectados con 2-Caco células y SMF (línea roja , 1363.1 ± 284.3 mm
3 en 9 semanas), y co-inyectados con células Caco-2 y PESA (línea verde, 2595.1 ± 349.5 mm
3 en 9 semanas). Las diferencias de volumen del tumor entre Caco-2 células solas y células Caco-2 con un factor (
P Hotel & lt; 0,01), y entre el 2-Caco células con SMF y células Caco-2 con un factor (
P Hotel & lt; 0,05) fueron estadísticamente significativas. tumores de xenoinjertos derivados de co-inyección de las células cancerosas y PESA crecieron más rápido que los derivados de la inyección de las células cancerosas solo, o co-inyección de las células cancerosas y SMF. (B, izquierda) el peso del tumor de xenoinjerto en ratones inyectados con células DLD-1 solo fue de 0,71 ± 0,11 g, co-inyectados con células DLD-1 y SMF fue 1,27 ± 0,19 g, y co-inyectados con células DLD-1 y PESA fue 1,82 ± 0,28 g en 8 semanas. Las diferencias de peso del tumor entre las células DLD-1 células solas y DLD-1 con un factor (
P Hotel & lt; 0,01), y entre DLD-1 células solas y células DLD-1 con SMF (
P Hotel & lt; 0,05) fueron estadísticamente significativas. (B, derecha) xenoinjerto peso del tumor en ratones inyectados con células Caco-2 sola fue 0,53 ± 0,24 g, co-inyectado con células Caco-2 y SMF fue 1,91 ± 0,34 g, y co-inyectados con 2 Caco-células y PESA fue 3,66 ± 0,45 g en 10 semanas. Las diferencias de peso del tumor entre las células DLD-1 células solas y DLD-1 con un factor (
P Hotel & lt; 0,01), entre DLD-1 células solas y células DLD-1 con SMF (
& lt; 0,05), y entre DLD-1 células con un factor y las células DLD-1 con SMF (
P Hotel & lt; 0,05) fueron estadísticamente significativas. Los pesos de los tumores de xenoinjertos derivados de co-inyección de células de cáncer con SPF fueron más altos que los de los tumores derivados de la inyección de las células cancerosas solo, o co-inyección de las células cancerosas y SMF (izquierda: DLD-1, a la derecha: Caco-2) . (C) A pesar de que el valor no alcanzó significación estadística, los xenoinjertos de tumores derivados de co-inyección de células DLD-1 y FPS mostraron el doble de la frecuencia de metástasis en los ganglios linfáticos (n = 4) en comparación con las derivadas de la co-inyección de DLD- 1 en las células y SMF (n = 2).