Extracto
cáncer de ovario (EOC) de los pacientes epiteliales serosos menudo sucumben a la enfermedad metastásica agresiva, sin embargo, poco se sabe sobre el comportamiento y la genética de la metástasis del cáncer de ovario. Aquí, nuestro objetivo es entender cómo las metástasis de epiplón difieren de los tumores primarios y cómo estas diferencias pueden influir en la quimioterapia. Se analizaron los perfiles de expresión de genes miARN de tumores primarios de EOC y sus respectivos metástasis del omento de 9 pacientes que utilizan matrices de miARN TaqMan qPCR. Encontramos 17 miRNAs con expresión diferencial en las lesiones de epiplón en comparación con los tumores primarios. miR-21, miR-150 y miR-146a tienen una baja expresión en la mayoría de los tumores primarios con un aumento significativo en la expresión de las lesiones de epiplón, con la concomitante disminución de la expresión de mRNA objetivos previstos sobre la base de la expresión del ARNm. Nos encontramos con que el miR-150 y miR-146a esferoide mediato tamaño. Tanto el miR-146a y miR-150 aumentan el número de células supervivientes residuales por 2-4 veces cuando se expusieron a concentraciones letales de cisplatino. Estas observaciones sugieren que al menos dos de los miRNAs, miR-146a y miR-150, hasta reguladas en las lesiones de epiplón, estimulan la supervivencia y aumentar la tolerancia a las drogas. Nuestras observaciones sugieren que las células del cáncer en los tumores expresan omental miRNAs clave diferente que los tumores primarios, y que al menos algunos de estos microRNAs pueden ser reguladores críticos de la aparición de la enfermedad resistente a fármacos
Visto:. Vang S, Wu HT , Fischer A, Miller DH, MacLaughlan S, Douglass E, et al. (2013) Identificación de cáncer de ovario metastásico miRNAs. PLoS ONE 8 (3): e58226. doi: 10.1371 /journal.pone.0058226
Editor: P. Jin Cheng, H.Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 21 Septiembre, 2012; Aceptado: 31 Enero 2013; Publicado: 12 Marzo 2013
Derechos de Autor © 2013 Vang y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Universidad de Brown centro de Biología Molecular Computacional, premio de la semilla del centro Nacional de la Universidad de Brown de Excelencia en Salud de la Mujer, y los Institutos nacionales de /centro Nacional de Salud para los Recursos de Ayuda de Investigación 5P41RR001395. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
seroso cáncer ovárico epitelial (EOC) es una enfermedad agresiva para los que hay pocos biomarcadores y terapias eficaces. COE se diagnostica a menudo después de las células tumorales han difundido dentro de la cavidad peritoneal [1]. A pesar del hecho de que las metástasis representan la mayor parte de las muertes relacionadas con la enfermedad, la metástasis del cáncer de ovario sigue siendo poco conocida [1].
El propósito de este estudio fue identificar características que pueden ser importantes para establecer metástasis y para determinar cómo estos factores pueden afectar a la respuesta de quimioterapia. enfermedad metastásica avanzada sigue siendo un desafío de enormes proporciones para tratar, lo más a menudo conduce a recurrentes, tumores resistentes a los fármacos. Las metástasis se pueden enriquecer para un espectro mutacional distinta en comparación con los tumores primarios [2], [3], [4]. La comparación de los tumores primarios y metastásicos ha generado importantes conocimientos sobre progresión de la enfermedad en ambos modelos animales [5] y en pacientes [2]. Para mejorar el tratamiento de la enfermedad metastásica, es vital para entender los genes y las vías emergentes en las metástasis que pueden no estar presentes en los tumores primarios. Aunque el potencial metastásico se puede predecir sobre la base del tumor primario [6], [7], esta observación no es mutuamente exclusiva con la posibilidad de que las características clave emergen en las metástasis que no se observan en tumores primarios. Por ejemplo, el nuevo microambiente puede inducir cambios fenotípicos importantes a las células cancerosas, incluyendo cambios en la actividad metabólica en el epiplón [8], y una mayor resistencia a los medicamentos [9].
anteriores estudios de expresión de ARNm que examina acertaron ovárica primaria y los tumores metastásicos de la misma paciente, apoyan un modelo 'predisposición tumor primario "[6], [10], [11], [12]. los datos de expresión de ARNm utilizando microarrays de primera generación sugieren que hay pocas diferencias de expresión significativas entre las lesiones de epiplón y los tumores primarios [13], [14], [15], la expresión diferencial sin embargo, numerosos estudios han descrito los factores clave de la reglamentación entre los tumores primarios y metástasis, incluyendo e-cadherina [16], las MMP [17], [18] y las integrinas [19]. Para hacer frente a esta aparente discrepancia y para obtener nuevos conocimientos sobre el estado de las células cancerosas en las metástasis, perfilamos miARN expresión en pares coincidentes de ovario seroso epitelial primaria (EOC) tumores y lesiones del epiplón. miARN perfiles de expresión de miR-150 identifica y miR-146a a ser hasta reguladas en las metástasis de epiplón. Nos encontramos con que el miR-150 y miR-146a promueven la formación de esferoides y aumentan la fracción de células supervivientes residuales después de la exposición cisplatino. Estas observaciones sugieren que el aumento de la expresión de miR-146a y miR-150 en las lesiones de epiplón puede conducir a, una enfermedad más agresiva quimioresistente.
Resultados
Se identificaron 9 Etapa IIIC serosas pacientes con cáncer de ovario epitelial pares de muestras de tumores metastáticos primarios y epiplón (Figura S1, el cuadro S1). Todos los pacientes eran post-menopáusicas (& gt; 55 años de edad al momento del diagnóstico) y tenía la enfermedad metastásica en el epiplón. Se midió la expresión de los genes miARN utilizando TaqMan qPCR tarjetas de matriz en los 9 pares de tumores. Cada tumor tenía & gt; células de cáncer de 70%, y de buena calidad de ARN (Agilent Bioanalyzer RIN & gt; 5). Nuestro objetivo es entender los cambios que se manifiestan durante la progresión de la enfermedad, y por lo tanto nos hemos centrado en la comparación de las metástasis de los tumores primarios y no tuvo en cuenta las células epiteliales de ovario normales.
Identificación de miRNAs expresados diferencialmente entre los tumores primarios y metastásicos
mide 377 miRNAs utilizando matrices ABI TaqMan qPCR, específico para miRNAs maduros [20], en 9 tumores humanos primarios y metastásicos emparejados. 180 miRNAs se expresan, en al menos dos tumores, sin arriba global o baja regulación de estos miRNAs entre los tumores primarios y metastásicos. Figura 1A se resumen los miRNAs con grandes diferencias de expresión recurrentes identificados por una prueba t pareada (Figura S2). Hemos probado la expresión de miR-146a y miR-150 en ensayos dirigidos sólo estos miRNAs en dos pares de pacientes para confirmar que los ensayos TaqMan son específicos para estos miRNAs sin diafonía de los otros 376 ensayos (Figura S3).
A. miARN perfiles de expresión mediante matrices TaqMan qPCR identifica 17 miRNAs expresados diferencialmente entre los 9 pares de tumores primarios y lesiones epiplón. Se seleccionaron 0,05 (prueba t pareada); miRNAs con p & lt. El nivel de expresión se presenta como la media de error +/- estándar de la media (s.e.m.) del factor de cambio mediante el? C
t con respecto al método de U6 snRNA. Rojo, una menor expresión en metástasis, azul, mayor expresión en metástasis. B. Izquierda, la agrupación jerárquica sin supervisión de las veces los cambios de los pacientes analizados. Derecho, análisis del gráfico de asociación de la expresión de los genes miARN miARN identifica grupos indicados en rojo. La agrupación se realizó en Gene-E] 50].
La agrupación jerárquica de las veces el cambio entre los tumores primarios y metastásicos para los 17 miRNAs muestra tres grupos distintos (Figura 1B). Los pacientes se agruparon con los cambios veces similares en la expresión de los genes miARN (Figura 1B, panel izquierdo). grupos distintos miARN se visualizan con mayor facilidad cuando los miRNAs se agrupan independiente de los pacientes (Figura 1B, panel derecho). Debido a que el miR-146a, miR-21 y miR-150 son representativos de los tres principales grupos de hasta reguladas, decidimos enfocar nuestros esfuerzos para comprender sus posibles funciones en el cáncer de ovario. Se encontró que la expresión de miR-21, miR-146a, miR-150 se correlaciona negativamente con sus objetivos de mRNA predichos (Figura S4), lo que sugiere que estos miRNAs están suprimiendo de forma activa la expresión de ARNm en las metástasis en comparación con los tumores primarios. Elegimos a centrarse en el miR-146a y miR-150 debido a que estos dos miRNAs previamente no se han examinado en el cáncer de ovario a nuestro conocimiento.
Para determinar si la expresión cambia originan a partir de células cancerosas o estroma, utilizando un ortogonal ensayo, se realizó un
In situ
hibridación (ISH). miR-21 se expresa tanto en las células cancerosas y estroma, y hasta reguladas en las lesiones de epiplón, en consonancia con la pantalla TaqMan qPCR (Figura 2A). Por ISH, se observa que los niveles de expresión absolutos son variables, pero los 8 lesiones omental espectáculo probados incremento en la expresión de células de cáncer miR-21 en comparación con el tumor primario correspondiente (Figura 2 y la Figura S5). En nuestras manos, la sensibilidad ISH es pobre y depende de la calidad de la sonda, y no se pudo obtener la señal fiable para otros miRNAs, incluso después de un examen exhaustivo de las variables clave, como temperatura de hibridación, concentración de proteinasa K, y la concentración de la sonda. Estas observaciones sugieren que el miR-21 se origina en el cáncer y las células del estroma, y que el miR-21 expresión aumenta en metástasis de epiplón en las células cancerosas.
a.
In situ
hibridación de miR-21. Las células cancerosas se tiñen de color rojo por Red Nuclear. mayor expresión en metástasis omental se observa en cada caso, incluso con tanto la expresión relativamente alta y baja miR-21 en el tumor primario. Las flechas indican las regiones de la expresión de miR-21 co-localización con tinción con rojo nuclear. B. Laser Capture Microdissection (LCM) de dos casos revela miRNAs probable expresadas en células de cáncer. El mapa de calor muestra el cambio veces para los 17 miRNAs identificados en la pantalla del tumor mayor. patrones similares de expresión diferencial se observan para los miRNAs expresados en células de cáncer como se observa en el tumor a granel. El color negro indica que el miARN no era detectable en las células cancerosas aisladas LCM
Con el fin de seguir un análisis más global, hemos enriquecido para las células cancerosas mediante microdisección de captura por láser (LCM) de H & amp;. E tiñó células de cáncer, y realizaron arrays Taqman qPCR a partir de dos casos. 11 de los 17 miRNAs, identificada en la pantalla tumor mayor (Figura 1A), se expresan en células de cáncer de LCM enriquecido, y la expresión diferencial entre tumores primarios y lesiones omental es cualitativamente la misma (Figura 2B, Figura S6). Estas observaciones sugieren que el cambio observado en la expresión probablemente se origina en las células cancerosas para estos 11 miRNAs (Figura 2B). miRNAs no se expresan en las células cancerosas, pero con grandes cambios de expresión en el tumor a granel, tales como el miR-124 y miR-370, pueden indicar la presencia de determinados tipos de células del estroma, tales como fibroblastos o células del sistema inmune. Estábamos intrigados inicialmente por el miR-509-3-5p, miR-508-3p, y miR-508-5p ya que éstos eran los únicos miRNAs abajo reguladas en las metástasis tumorales en las mediciones a granel. Sin embargo, estos tres miRNAs no se expresan en los LCM enriquecido poblaciones celulares de cáncer (Figura 2B), y no se expresan de manera significativa en las líneas celulares de cáncer de ovario ensayados (Figura S7), y por lo tanto no se consideraron adicionalmente.
Aunque LCM seleccionada células cancerosas no son 100% las células cancerosas, estas observaciones sugieren fuertemente que el miR-146a y miR-150 es probable que expresan en las células cancerosas y que su expresión es regulada hasta en las metástasis de epiplón. Es importante destacar que nos encontramos con la expresión de estos miRNAs en H & amp; E manchada, LCM enriquecido células cancerosas en los tumores primarios y metastásicos, en consonancia con su posible expresión en las células cancerosas. TCGA ha encontrado que el miR-150 y miR-146a se expresan en niveles bajos en la mayoría de los tumores primarios [21], en consonancia con nuestras observaciones.
miR-150 y miR-146a promueven la formación de esferoides
arrays Taqman qPCR reveló que 8 de los 17 miRNAs metastásicos (Figura 1A) se expresan en la proliferación de células OVCAR-8 y SKOV-3 (Figura S7) y en células de cáncer en los tumores humanos (Figura 2B). miR-146a se expresa en niveles relativamente bajos y miR-150 no se expresa de manera significativa, ya que sólo se detectó por encima de la recomendada C
t umbrales en las líneas celulares de cáncer de ovario en proliferación probadas.
La hipótesis de que los miRNAs hasta reguladas en las lesiones de epiplón estimularía el crecimiento como parte de su capacidad para promover la enfermedad agresiva. Hemos probado miRNAs expresados en células de cáncer en los tumores (Figura 2B), que también se expresan modestamente en líneas celulares de cáncer de ovario para evitar la sobre-expresión de miRNAs en concentraciones suprafisiológicas incluyendo el miR-150, miR-146a, miR-708, y miR -193a-5p. Para modelar la más alta expresión de miARN observado en las lesiones de epiplón, expresamos ectópica sintética pre-MIR y se realizó ganancia de las pantallas de función de la viabilidad celular y ensayos de sensibilidad a cisplatino. La transfección de pre-MIR llevar a una alta sobreexpresión de miR-146a (Figura S8, mientras que el miR-150 se expresa moderadamente en comparación con U6 snRNA (? C
t ~ 3). La expresión ectópica de miR-150 aumentó ligeramente el número de viables células en Skov-3 y IGROV-1 durante cuatro días, pero no en las células OVCAR-8 (Figura 3). Ninguno de los otros pre-MIR indujo efectos significativos sobre el crecimiento y reproducibles en más de una línea celular.
24 horas después de la transfección con 50 nM pre-MIR, las células se sembraron en placas de 96 pocillos y se cultivaron durante 4 días. Las células viables se determinaron por WST-1 normalizaron a las células transfectadas con el control negativo pre-miRs barras de error. (sem) representar a los triplicados biológicos indendent cada réplica consistes de que consta de tres pozos en una placa de 96 pocillos **, p & lt;.. 0,01, *, p & lt; 0,05 mediante la prueba t de Student
modelo esferoides agregados multicelulares. en la ascitis de pacientes con cáncer de ovario que establecen las metástasis [22]. los esferoides son una representación más precisa de los tumores y el aumento de la evidencia sugiere que las respuestas de drogas son mejores modelados en esferoides que en monocapa cultura [23], [24], [25], [26]. la formación de esferoides típicamente requiere un número mínimo de células, seguido de agregación espontánea, la supervivencia en condiciones independientes de anclaje, y la compactación para reforzar la supervivencia del agregado [27]. Para evaluar la función de los genes miARN en esferoides, formamos esferoides uniformes de la siembra de células en agarosa micromoldes [28]. Curiosamente, todos los miRNAs expresados son regulados hasta en esferoides 3D en comparación con monocapa utilizando una tarjeta matriz TaqMan (figura S4). Hemos probado el miR-146a y miR-21 por la expresión TaqMan qPCR, utilizando cebadores dirigidos sólo a estos dos miRNAs, y reproducible observamos sobre regulación de estos dos miRNAs en esferoides (Figura 4A). Para probar si la sobre regulación de miR-146a es importante para la formación de esferoides, inhibimos miR-146a con un inhibidor de ácido nucleico cerrado (LNA). la inhibición de miR-146a causa esferoides amorfos, de manera más flexible formados en ambas células Skov-3 y OVCAR-8 después de dos días (Figura 4B), en comparación con los esferoides más compactos formados en los controles negativos. El efecto es más dramático en SKOV-3 de OVCAR-8. Debido a la naturaleza amorfa de estas primeras forman esferoides día 2, no hemos podido determinar de forma fiable sus tamaños. Esta observación sugiere que la formación de esferoides temprana se ve afectada por una reducción de la actividad de miR-146a. Después de 4 días, cuando esferoides de control se han formado más completamente después de someterse a la compactación, la inhibición de miR-146a con un inhibidor de LNA reduce el tamaño del esferoide, en comparación con un LNA control negativo, en SKOV-3, pero sólo modestamente en OVCAR-8 (Figura 4C ). 45 esferoides se midieron en cada réplica, y se realizaron tres repeticiones independientes. El tamaño de cada esferoide se determinó mediante ImageJ y la distribución del tamaño de esferoides está representado con diagramas de caja (Figura 4C y 4D). la formación de esferoides puede ser un reto debido a ligeras diferencias en el número de células utilizadas para sembrar cada esferoide. Con moldes de agarosa, se evalúa un gran número de esferoides para superar las preocupaciones con errores en el número de células utilizadas para sembrar los esferoides en el que se observa cada pocillo con las diferencias que dependen de distintos miARN.
24 horas después de la transfección con anti- inhibidores de miR LNA o imita pre-miR como se indica, 700 /l SKOV-3 o 600 /l OVCAR-8 células fueron sembradas en 35 micromoldes bien agarosa con un esferoide formando en cada pocillo. A. miR-21 y miR-146a son regulados hasta en 4 día Skov-3 y OVCAR-8 esferoides detectados utilizando TaqMan qPCR tarjetas de matriz en dos repeticiones. Las barras de error son s.e.m. B. Inhibición de miR-146a con 10 nM retrasos LNA formación de esferoides y conduce a esferoides formados más amorfas y más flexibles en Skov-3 y OVCAR-8 después de 2 días. barra roja es de 400 micras. C. diagrama de caja y bigotes muestran que la inhibición de miR-146a con LNA reduce significativamente el tamaño del esferoide después de 4 días en Skov-3, y modestamente en OVCAR-8. expresión representativo mostrado a partir de cuatro repeticiones. D. La expresión ectópica de miR-150 y miR-146a mejora significativamente la formación de esferoides después de 4 días. células Skov-3 y OVCAR-8 fueron transfectadas con 50 nM de pre-MIR miR-150 y miR-146a pre-MIR antes de la formación de esferoides. SKOV-3 o OVCAR-8 células fueron transfectadas como se indica. se muestran esferoides representativos. barra roja es de 400 micras. Caja y bigote parcelas de la distribución de tamaños de 45 esferoides de un experimento representativo. El experimento se reprodujo tres veces. P-valores determinados por la prueba t de Student.
En consonancia con el aumento de expresión de miRNAs en esferoides que son críticos para la formación de esferoides, mayor de miR-150 y miR-146a expresión promover esferoides más grandes en Skov-3 y OVCAR-8 (Figura 4D). Introducción de miR-150 y miR-146a muestran los efectos más consistentes y más grandes en esferoides en comparación con el control negativo y los otros pre-MIR probadas. Para el miR-146a, observamos esferoides pequeños cuando se inhibe el miR-146a (Figura 4C) y esferoides mayores previa expresión ectópica (Figura 4D) después de 4 días de formación de esferoides. En conjunto, estas observaciones, apoyan el miR-146a promover la formación de esferoides.
miR-150 y miR-146a tolerancia aumento cisplatino
Una vez que se establecen las metástasis, el cáncer de ovario es muy difícil de tratar como resistentes recurrente tumores a menudo reaparecen después de la quimioterapia inicial. Los cambios en la expresión de los genes miARN pueden indicar un estado fisiológico diferente para las células cancerosas en las metástasis que afectan a la forma en que estas lesiones podrían responder a la quimioterapia. Hemos probado el efecto de aumento de la expresión de miRNAs cuatro, hasta reguladas en las lesiones de epiplón, sobre la sensibilidad a cisplatino. estudios dependientes de la dosis utilizando WST-1 ensayos revelan que una mayor expresión de miR-150 incrementa modestamente el cisplatino IC
50 en SKOV-3, pero no OVCAR-8 y IGROV-1 (Figura 5A). Otros miRNAs, como miR-146a, ya sea afectada Skov-3 o IGROV-1, pero no tanto de una manera estadísticamente significativa.
a. El tratamiento de células con pre-miR-150 imitan incrementa modestamente el IC50 cisplatino en SKOV-3 y IGROV-1, pero no OVCAR-8 células. ensayos de WST-1 se llevaron a cabo 48 horas después del tratamiento con cisplatino. El gráfico muestra promedio de 3 repeticiones biológica. Las barras de error representan s.e.m. B. Esquema de ensayo de supervivencia de cisplatino. Las células se tratan dos veces con altas concentraciones de cisplatino que conduce a la supervivencia en aproximadamente un 1% de las células. C. miR-150 y miR-146a son hasta reguladas en las células que sobreviven después de 6 días de 50 M cisplatino en Skov-3 y 7 días de 30 M cisplatino en células OVCAR-8 en comparación con las células no tratadas, en proliferación. Los datos están en duplicados y las barras de error son s.e.m. El factor de cambio para el miR-150 es muy grande, porque el miR-150 no era detectable en la proliferación de las células. C
t se ajusta al máximo el ensayo de ciclos 40, para estimar el factor de cambio. D. Inhibición de miR-146a con 10 inhibidor de LNA nM reduce significativamente el número de células residuales en SKOV-3 y modestamente reduce las células supervivientes en OVCAR-8 después de 6 días de 50 M de cisplatino en SKOV-3 y 7 días de 30 micras cisplatino en células OVCAR-8. Las células viables que sobreviven se determinaron por el ensayo de exclusión de azul de tripano. Se muestran los experimentos por triplicado Biológicas. Las barras de error son s.e.m. E. La transfección de 50 nM pre-miR-146a y pre-miR-150 aumenta la supervivencia a largo plazo después de 6 días de 50 M cisplatino en Skov-3 y 7 días de 30 M cisplatino en células OVCAR-8.
Un examen cuidadoso de las células en cultivo en monocapa durante el tratamiento con cisplatino sugiere que las células sanas sobrevivieron con mayor expresión de miR-146a y miR-150 en concentraciones altas de cisplatino. El rango dinámico de las células restantes está por debajo del límite de detección del ensayo WST-1. Estudios recientes han identificado células quiescentes tolerantes drogas reversibles que sobreviven concentraciones letales de drogas [29]. Por lo tanto, el examen de las células supervivientes representa un modelo alternativo para examinar cómo las células cancerosas sobrevivan quimioterapia. Para probar si los miRNAs metastásicos promueven la supervivencia en dosis letales de cisplatino, se analizó la expresión de los genes miARN en las células supervivientes residuales en cultivo en monocapa expuestos a dosis letales de cisplatino durante 6-7 días. Nos encontramos con que el miR-150 y miR-146a son significativamente hasta reguladas en las células supervivientes en comparación con la población en proliferación (Figura 5C). miR-150 es indetectable en las células OVCAR-8 y por debajo del umbral de ABI recomienda en SKOV 3-células (C
ciclos t~36) en la proliferación de células, pero se convierte expresó significativamente en células supervivientes residuales en ambas líneas celulares, lo que sugiere una posible papel en sobrevivir cisplatino. Para probar si miR-146a afecta a la capacidad de las células de cáncer de ovario para sobrevivir el tratamiento con cisplatino de larga duración, la inhibición de miR-146a con LNA reduce el número de viable sobrevivir las células residuales modestamente en OVCAR-8, y más significativamente en células SKOV-3 (Figura 5D). En consonancia con su mayor expresión en las células supervivientes, nos encontramos con que el aumento de la expresión de miR-150 o miR-146a aumenta significativamente el número de células supervivientes viables mediante el ensayo de exclusión de azul de tripano, seis (Skov-3) o siete (OVCAR-8) días después de la adición de las concentraciones letales de cisplatino (Figura 5E). Trypan azul es un indicador del número de células viables y refleja el aumento del número de células supervivientes se observó visualmente. No todos los miRNAs ectópica expresó mejoran la supervivencia lo que sugiere que los efectos de miR-150 y miR-146a son específicos. Estas observaciones sugieren que el aumento de la expresión de miR-150 y miR-146a promueven la supervivencia, o al menos, retrasar la muerte celular inducida por cisplatino, en las células de cáncer de ovario.
Discusión
Nuestros resultados demuestran que la clave tumores metastásicos hasta de regular miRNAs específicos en comparación con sus tumores primarios y que, entre estos miRNAs, miR-146a y miR-150 promueven la formación de esferoides 3D y aumentar la tolerancia al cisplatino en las células de cáncer de ovario, lo que sugiere un papel para estos miRNAs para la supervivencia en específica condiciones. Observamos recurrencia común significativa de la regulación diferencial de 17 miRNAs, lo que sugiere que los requisitos para adaptarse al epiplón son muy similares en la mayoría de los pacientes con EOC. En conjunto, estos datos apoyan la idea de que las lesiones omental se enriquecen para las características de la enfermedad agresiva, que también median en la respuesta del paciente a la quimioterapia. Algunas de estas características, como miR-146a y la expresión de miR-150 puede ser único para las metástasis, ya que se expresan muy humilde de la mayoría de los tumores primarios en nuestra base de datos y, en TCGA [21]. Baja expresión de estos miRNAs en los tumores primarios se asocia a peor supervivencia global del paciente [21]. Debido a que estos miRNAs son a menudo hasta reguladas en las lesiones de epiplón y altamente correlacionada con la expresión en tumores primarios (Pearson = 0,7 para el miR-150 y 0,78 para el miR-146a), predecimos que una mayor expresión en metástasis se asocia con menor supervivencia global y progresión de la enfermedad.
Uno de los objetivos de este estudio fue comprender cuán similares o diferentes tumores primarios de ovario son de metástasis epiplón. Los esfuerzos previos que comparan estos tumores han aplicado tecnologías de microarrays para examinar los niveles de expresión de ARNm. El uso de umbrales estrictos, se informó de diferencias relativamente pequeñas entre los tumores primarios y metastásicos [15]. Sin embargo, una serie de estudios informan diferencias significativas por otros métodos, incluyendo inmunohistoquímica de E-cadherina [19], MMPs [17] y el reciente hallazgo de la señalización de los adipocitos afectar a las células cancerosas en el epiplón [8]. miRNAs se han convertido en los principales reguladores de destino celular y numerosos estudios de perfiles de miARN sugieren que los miRNAs pueden tener un rango dinámico más amplio en sus diferencias de expresión a través de los tejidos que permitan la identificación de tejido distinto y firmas de expresión específicos del tumor.
Debido a que la células del estroma difieren entre los dos tumores, algunas de las grandes diferencias de expresión de miRNA podrían estar originados por estas células. Para identificar que, en su caso, las diferencias de expresión de los genes miARN se originan a partir de células de cáncer, se realizó dos experimentos. Hemos sido capaces de detectar el miR-21 por ISH, que muestra aumento de miR-21 expresión en H & amp; E manchadas las células cancerosas (Figura 2A y la Figura S5). Estos datos también muestran que algunos aumento de la expresión de miR-21 en algunos pacientes se originan a partir de células del estroma. Para realizar un análisis más exhaustivo, se combinaron las matrices TaqMan qPCR con LCM para examinar una población enriquecida de células cancerosas. Estos datos ponen de manifiesto que algunos de los miRNAs identificados en la pantalla mayor (miR-370, miR-124, miR-508, miR-509) es probable que no se expresa en las células cancerosas, ya que no se detectaron fácilmente en la población enriquecida LCM. Por otro lado, 11/17 de los miRNAs, incluyendo el miR-146a y miR-150, identificado en el tumor de mayor se expresan y mantienen las diferencias de expresión similares en las células de cáncer de LCM enriquecido.
De perfiles de expresión tanto de mayor poblaciones celulares de cáncer de LCM enriquecido, así como datos ISH tumor y sugieren importantes sobre regulación de miR-21 en las metástasis en comparación con los tumores primarios. miR-21 es bien conocido por ser un anti-apoptóticos y pro-supervivencia miARN en muchos tipos de cáncer, incluyendo el de ovario [30], y nuestras observaciones preliminares también apoyan el papel de miR-21 en la promoción de la formación de esferoides (datos no mostrados). Estas observaciones apoyan la idea de que las metástasis omental pueden ser seleccionados para ser más resistentes a la quimioterapia haber sobrevivido escape del tumor primario.
miRNAs menudo regulan por disminución la expresión mediante la unión de la 3'UTR de los ARNm. El efecto sobre la estabilidad del ARNm y los niveles de ARN total es a menudo modesto [31], [32], la evaluación de los cambios de expresión de ARNm puede ser difícil de observar. Para conocer mejor cómo hasta reguladas miRNAs metastásicos están mediando la proliferación y la respuesta cisplatino, evaluamos sus objetivos previsto. Nos encontramos con que el miR-21, miR-146a objetivos y miR-150 de ARNm son significativamente reducido regulado en comparación con los conjuntos seleccionados al azar de tamaño equivalente de genes (Figura S4), en consonancia con estos miRNAs reprimir activamente ARNm en tumores metastásicos.
miR-150 es la más conocida por su papel en la regulación de la diferenciación de células B y el momento de expresión es fundamental para su propio papel en la promoción del desarrollo de las células B [33], [34]. Informes recientes sugieren que el miR-150 puede promover o inhibir los tumores [35], [36], [37], [38], destacando el tema común de funciones dependientes del contexto de miRNAs [39], [40]. No observamos correlación inversa con la expresión de que anteriormente se habían P2RX7 miR-150 objetivos [41] o EGR2 [35] en nuestros datos de tumor primario /metastásicos.
miR-146a se ha identificado como un supresor de tumores a través baja regulación de la NFkB activadores IRAK1 y TRAF6 [42], [43]. Sin embargo, nos encontramos con que IRAK1 y TRAF6 no se expresan en SKOV-3 o OVCAR-8 por qPCR (datos no mostrados). En algunos contextos, el miR-146a es oncogénico, mediante la supresión de los genes BRCA1 [44] o FAS [45]. No se observó una reducción significativa de los genes BRCA1, BRCA2, o la expresión de FAS en el miR-146a expresión ectópica (datos no mostrados). Supresión de los genes BRCA1 no tendría sentido con el aumento de la supervivencia, como la disminución de BRCA1 /BRCA2 funciones de reparación del ADN mediada están asociados con una mayor sensibilidad a cisplatino [46]. Por lo tanto, miR-146a parece trabajar a través de un nuevo mecanismo en las células de cáncer de ovario para aumentar la supervivencia.
La hipótesis de que los cambios en la expresión de los genes miARN en las metástasis en comparación con los tumores primarios pueden indicar funciones en el entorno metastásico que difieren de la ambiente del tumor primario. Para empezar a modelar cómo estos miRNAs pueden apoyar el crecimiento sostenido y la supervivencia de los tumores metastásicos, nos embarcamos en una serie de experimentos funcionales utilizando líneas celulares de cáncer de ovario establecidos. Se utilizó la ganancia y pérdida de función de los estudios en ensayos de viabilidad celular cisplatino para encontrar efectos significativos de miR-146a y miR-150 sobre la sensibilidad a las drogas o el crecimiento de células de cáncer de ovario. Los estudios preliminares ensayos de migración no reveló efectos dependientes de miARN significativas (datos no mostrados). Sin embargo, nos encontramos con que el miR-146a y miR-150 mediar en la formación y el tamaño de esferoides. Como las células cancerosas se escapan del tumor primario y entren en la cavidad peritoneal, que a menudo forman agregados de 50 a 750 micras de tamaño. Los esferoides se parecen a estos agregados aisladas de pacientes [47] y se asemejan a tumores de xenoinjertos mejor que un cultivo monocapa [48]. Algunos de los cambios tales como aumento de la expresión de las integrinas visto en las metástasis establecidas también se observan en estos esferoides (datos no mostrados), y pueden reflejar el efecto de la comunidad recuerda más a la enfermedad humana [19], [47], [49]. Nuestras observaciones que el miR-146a es regulada hasta en las metástasis de epiplón humanos, con la consecuente disminución de mRNA objetivos previstos, y esferoides en conjunción con la ganancia y la pérdida de ensayos de la función, sugieren un papel importante para el miR-146a en la formación y el mantenimiento de las metástasis . Estos datos también apoyan el papel de miR-150, aunque sin pérdida de datos de la función, las conclusiones basadas en los experimentos funcionales no son tan fuertes. Junto con el ensayo de tolerancia a cisplatino, estos datos apoyan la posibilidad de que el miR-146a y miR-150 se necesita para apoyar la supervivencia bajo condiciones de estrés tales como el crecimiento de esferoides, altas concentraciones de tratamiento con cisplatino, y la adaptación a las nuevas condiciones del ambiente durante la difusión en los pacientes.
Una advertencia de este estudio es que estas líneas celulares pueden no recapitular las características clave de las células cancerosas en los tumores, incluyendo la expresión de miR-150 se ve en tumores de ovario. Nuestra incapacidad para modelar correctamente el cáncer de ovario
in vitro
o
in vivo
pueden ocultar funciones adicionales de estos miRNAs hasta reguladas en las metástasis de epiplón. cultivos a corto plazo de las líneas celulares derivadas de reciente o el examen de la función de los genes miARN en modelos animales pueden ser necesarios para identificar las funciones adicionales de estos miRNAs en la metástasis. Estos datos ponen de relieve cómo algunos miRNAs pueden ser importantes para la supervivencia en condiciones específicas y por lo tanto es seleccionado para una mayor expresión en las metástasis. Futuros estudios que examinan el miR-146a y miR-150 utilizando
in vivo y modelos y sistemas de co-cultivo pueden ayudar a proporcionar información sobre las funciones de estos miRNAs.
Uno de los mayores desafíos en el tratamiento avanzado