Extracto
Aunque CD133 se ha informado de que un cáncer de colon marcador de células madre prometedor, las funciones biológicas de CD133
+ células de cáncer de colon siguen siendo controvertido. En el presente estudio, hemos investigado las diferencias biológicas entre CD133
+ y CD133
- las células de cáncer de colon, con un enfoque particular en sus interacciones con los fibroblastos asociados al cáncer, especialmente CD10
+ fibroblastos. Se utilizó 19 tejidos de cáncer de colon primario, 30 cultivos primarios de fibroblastos derivados de tejidos de cáncer de colon y líneas celulares de cáncer de colon 6. Se aislaron CD133
+ y CD133
- subpoblaciones de los tejidos de cáncer de colon y células cultivadas.
in vitro
análisis revelaron que las dos poblaciones mostraron comportamientos biológicos similares en su proliferación y quimiosensibilidad.
In vivo
análisis reveló que CD133
+ células mostraron significativamente mayor crecimiento del tumor que CD133
- células (
P
= 0,007). Por otra parte, en cocultivos con fibroblastos primarios derivados de tejidos de cáncer de colon, CD133
+ células exhiben comportamientos significativamente más invasivo que CD133
- células (
P
& lt; 0,001), especialmente en cocultivos con CD10
+ fibroblastos (
P Hotel & lt; 0,0001). Más
in vivo
análisis revelaron que CD10
+ fibroblastos mejoran el crecimiento tumoral de CD133
+ células significativamente más que CD10
- fibroblastos (
P Hotel & lt; 0,05) . Estos datos demuestran que el
in vitro
propiedades invasivas y
in vivo
crecimiento tumoral de CD133
+ células de cáncer de colon se han mejorado en presencia de fibroblastos específicos asociados con el cáncer, CD10
+ fibroblastos, lo que sugiere que las interacciones entre estas poblaciones de células específicas tienen un papel importante en la progresión del cáncer. Por lo tanto, estas interacciones específicas pueden ser dianas prometedoras para nuevas terapias contra el cáncer de colon
Visto:. Cui L, Ohuchida K, Mizumoto K, Moriyama T, Onimaru M, Nakata K, et al. (2010) de forma prospectiva aislados
+ fibroblastos asociados al cáncer CD10 tienen interacciones más fuertes con CD133
+ Las células del cáncer de colon que con CD133
- las células cancerosas. PLoS ONE 5 (8): e12121. doi: 10.1371 /journal.pone.0012121
Editor: Irene Oi Lin Ng, de la Universidad de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 8 de Marzo, 2010; Aceptado: July 15, 2010; Publicado: 12 Agosto 2010
Derechos de Autor © 2010 Cui et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Apoyado en parte por una subvención-en-Ayudas del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón, y una beca de la Fundación de Ciencias de Takeda, la Sociedad japonesa de Gastroenterología, la Fundación Uehara Memorial, y la Fundación de Nakajima. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal es la segunda causa principal de muerte por cáncer en el mundo occidental y su incidencia está aumentando en los países asiáticos, como resultado de los cambios hacia una dieta occidentalizada [1]. Recientemente, el concepto de células madre de cáncer (CSC) se ha centrado en en la biología del cáncer colorrectal. El cáncer de colon muestra un marcado grado de heterogeneidad morfológica y funcional en sus células. Entre estas poblaciones de células, se ha informado de los CAC, en particular, que poseen actividades tumorigénicas y resistentes al tratamiento [2]. Por lo tanto, el aislamiento y la caracterización de células madre cancerosas de colon pueden ayudar al desarrollo de nuevos procedimientos de diagnóstico y terapéuticos [3].
Human prominin-1 (PROM1, CD133) es una glicoproteína transmembrana 5-de 865 aminoácidos con un peso molecular total de 120 kDa. Fue descrito inicialmente como un antígeno de superficie específico de células madre hematopoyéticas humanas [4], [5] y un marcador para las células neuroepiteliales murinos y varias otras células epiteliales embrionarias [6]. Aunque las funciones biológicas de CD133 siguen siendo desconocidos [7], CD133 solo o en combinación con otros marcadores se utiliza actualmente para aislar las células madre a partir de numerosos tejidos [4], [5], así como la próstata [8], el hígado [9 ] y el páncreas [10], [11]. Recientemente, se informó de CD133 ser un marcador CSC en el cáncer de colon [3], [12]. Ieta et al. [13] informó además que CD133
+ células derivadas de líneas celulares de cáncer de colon presentan mayor potencial tumorigénico de CD133
- células. Sin embargo, Shmelkov et al. [14] demostraron que CD133 se expresa ampliamente por las células epiteliales de cáncer de colon humanas primarias, y que tanto CD133
+ y CD133
- subpoblaciones tumorales metastásicas son capaces de tumorigénesis a largo plazo
in vivo
. Por lo tanto, las implicaciones de CD133 como un marcador CSC siguen siendo controvertidos.
Se ha sugerido que las interacciones entre las células cancerosas y los fibroblastos del estroma que rodean tienen un papel crítico en la invasión tumoral y la metástasis [15], [16]. Aunque los tumores a granel son conocidos por consistir en las células de cáncer heterogéneos con diferentes actividades de proliferación, invasión y metástasis, no existen informes que se centran en la heterogeneidad de los fibroblastos asociados con el cáncer. En la mayoría de los estudios anteriores [17], [18], [19], [20], sólo dos o tres cultivos primarios de fibroblastos asociados con el cáncer han sido utilizados para las investigaciones. Por lo tanto, para una mejor comprensión de las interacciones de las células del estroma de células cancerosas, es importante centrarse en la heterogeneidad de los fibroblastos asociados al cáncer, similar a la heterogeneidad de las células cancerosas, tales como células madre cancerosas
En el presente estudio. , que investigó las implicaciones biológicas de CD133
+ células de cáncer de colon mediante el análisis de la expresión de CD133 en tejidos de cáncer de colon humanas primarias y evaluar los comportamientos biológicos de CD133
+ y CD133
- células derivadas de líneas celulares de cáncer de colon
in vitro
y
in vivo
. Se encontraron diferencias significativas en la invasividad entre estas dos poblaciones en co-cultivos con fibroblastos primarios derivados de tejidos de cáncer de colon, especialmente en co-cultivos con fibroblastos positivos para CD10, un metaloendopeptidasa membrana. Tomados en conjunto, estos datos sugieren que CD133
+ células de cáncer de colon son más invasiva en presencia de fibroblastos asociados con el cáncer específicos, especialmente CD10
+ fibroblastos, y que estas poblaciones celulares pueden ser dianas prometedoras para la inhibición de la metástasis y tumor recurrencia.
resultados
expresión de CD133 en tejidos de cáncer de colon primario resecado quirúrgicamente
Hasta la fecha, se han presentado datos inconsistentes en relación con el CD133
+ y CD133
- poblaciones de células en los tejidos de cáncer de colon primarias [3], [14]. Se investigaron los porcentajes de la CD133
+ y CD133
- las poblaciones de células en tejidos de cáncer de colon primarios mediante citometría de flujo. Utilizamos 26 tejidos de cáncer de colon primario y 24 tejidos epiteliales normales de colon de 26 pacientes. Hemos analizado la CD133
+ poblaciones en estos tejidos de colon después de excluir CD45
+ células
+ y CD31. Todas las muestras de cáncer de colon contenían tanto CD133
+ y CD133
- células (Tabla 1; CD133
+ células: 2-54%). También se detectó CD133
+ células a 0-5% en los tejidos normales del colon. Para evaluar las implicaciones clínicas de la expresión de CD133, se investigó la correlación entre la expresión de CD133 y los hallazgos clínico-patológicos, tales como el grado del tumor, la clasificación de Dukes, metástasis en los ganglios linfáticos, invasión linfática y la invasión venosa (Tabla 2). Se encontraron correlaciones significativas entre la expresión de CD133 y clasificación de Dukes (
P
= 0,010) y entre la expresión de CD133 y la metástasis de los ganglios linfáticos (
P = 0,023
).
las comparaciones de los comportamientos malignos entre ordenada CD133
+ y CD133
- las células de cáncer de colon
el uso de la citometría de flujo, se analizó la presencia de CD133
+ poblaciones en líneas celulares de cáncer de colon 6 . Se encontró que todas las líneas de células CD133 poseían
+ células (6-91%; Figura 1A). En particular, hemos detectado dos poblaciones distintas, una que consiste en solamente CD133
+ células y la otra que consiste en solamente CD133
- células, en células DLD-1, mientras que las otras líneas celulares parecían poseer una población que consiste en tanto CD133
+ y CD133
- células. Estamos ordenados células DLD-1 sobre la base de la expresión de CD133 y reanálisis mostró una selección eficaz (CD133
+: 98%; CD133
-: 100%; Figura 1B). Posteriormente, se investigaron los cambios dependientes del tiempo en la expresión de CD133 en DLD-1 células parentales no ordenados y clasificados CD133
+ y CD133
- células. Como se muestra en la Figura 1B, clasificado CD133
+ células mostraron cambios significativos en función del tiempo en el CD133
+ y CD133
- poblaciones durante el cultivo de largo plazo, mientras que los porcentajes de la CD133
+ y CD133
- poblaciones no cambiaron en las células de los padres y ordenados CD133
- células. A continuación, para comparar los comportamientos biológicos de ordenada CD133
+ y CD133
- células, se utilizaron células DLD-1 y HCT116 y investigaron su proliferación celular, la capacidad de formación de colonias y la quimiorresistencia a 5-fluorouracilo (5-FU) y doxorrubicina (DOX). No se encontraron diferencias significativas en estos comportamientos celulares entre CD133
+ y CD133
- células (figuras S1, S2, S3, S4): perfil
(A) CD133
+ poblaciones de una. panel de líneas celulares de cáncer de colon humano. La citometría de flujo se realizaron análisis para investigar el CD133
+ poblaciones en líneas celulares de cáncer de colon 6. (B) Análisis de la CD133
+ población de células y reanálisis de CD133 ordenada
+ células (98%) y CD133
parentales DLD-1 - células (100%) (paneles superiores). Los cambios dependientes del tiempo en el CD133
+ poblaciones en clasificar los padres y ordenados CD133
+ y CD133
- células DLD-1 también se muestran (panel inferior). La ordenada CD133
+ células muestran cambios significativos dependientes del tiempo en el CD133
+ y CD133
- poblaciones durante el cultivo de largo plazo, mientras que los porcentajes de la CD133
+ y CD133
- poblaciones no cambian en las células de los padres y ordenados CD133
- células. (C) El crecimiento del tumor se evaluó a 1 mes después de la inyección de 5 × 10
6 CD133
+ o CD133
- células DLD-1 en 6 ratones SCID, respectivamente. fotografías representativas se muestran en el panel superior (izquierda: CD133
- tumor derivado de las células; derecha: CD133
+ tumor derivado de las células). Barra de escala = 1 cm. El CD133
+ tumores derivados de células son significativamente más grande que el CD133
- tumores derivados de células (
P = 0,007
, panel inferior). Los datos representan la media ± SD
Para evaluar el potencial tumorigénico y
in vivo
crecimiento tumoral de CD133
+ y CD133
-. Células DLD-1, se trasplantaron números de serie de CD133
+ y CD133
- células en ratones con inmunodeficiencia combinada severa (SCID). Aunque hubo una tendencia hacia una detección más temprana de la formación de tumores en ratones inyectados con CD133
+ células en comparación con los ratones inyectados con CD133
- células, las diferencias no fueron significativas (tabla 3). A las 10 semanas después del trasplante, la inyección de más de 5 × 10
6 CD133
+ o CD133
- células generan tumores visibles en todos los ratones. Sin embargo, cuando se compararon los tamaños de los tumores, el CD133
+ tumores derivados de células fueron significativamente más grande que el CD133
- tumores derivados de células. (
P = 0,007
; Figura 1C)
fibroblastos asociados al cáncer aumentan la invasividad de CD133
+ células de manera más eficaz que la de CD133
- células
Para dilucidar los factores que causan las diferencias en el
in vivo
el crecimiento del tumor entre CD133
+ y CD133
- las células, se investigaron los efectos de co-cultivos con fibroblastos asociados al cáncer en la invasividad de estas células. Se encontró que no había diferencia en la capacidad de invasión entre CD133
+ y CD133
- cuando las células fueron cultivadas solas las células (Figura 2A). En contraste, cuando se cocultivaron las células con fibroblastos asociados con el cáncer, CD133
+ células mostraron significativamente mayor invasividad de CD133
- células y las células parentales (
P
& lt; 0,001 para ambos; figura 2A). Se examinaron los efectos de 12 cultivos primarios de fibroblastos en la invasividad de CD133
+ células, y se encontró que los efectos de las células cocultivadas en CD133
+ invasión de células varió de 0,88 veces a 1,76 veces (Tabla 4 ).
() se midieron las células invasoras A después de 48 h de monocultivo o cocultivo con fibroblastos asociados al cáncer (f11). CD133
+ células cocultured con fibroblastos asociados al cáncer muestran significativamente mayor invasividad de CD133
- las células y las células parentales (
P Hotel & lt; 0,001). Barras de escala = 100 m. (B) Los porcentajes de la CD10
+ población celular y las actividades de estas células para inducir la invasión de células de cáncer de colon cocultivadas se investigaron en 12 cultivos primarios de fibroblastos. Existe una correlación positiva significativa entre la mejora de CD133
+ invasividad de las células y el porcentaje de la CD10
+ población de células (
P
& lt; 0,0001). (C) La citometría de flujo análisis se realizaron para investigar la CD10
+ poblaciones en los tejidos de cáncer de colon primario. Existe una correlación significativa entre los porcentajes de la CD133
+ y CD10
+ poblaciones en tejidos de cáncer de colon (
P = 0,015
).
las correlaciones entre los porcentajes de poblaciones positivas al marcador de la superficie celular de los fibroblastos asociados con el cáncer y su mejora de la invasión del cáncer
Para la caracterización de los cultivos primarios de fibroblastos asociados al cáncer, se examinaron las expresiones de la superficie asociada a las células del estroma marcadores CD10, CD105, CD44 y CD54 en 32 cultivos primarios de fibroblastos por citometría de flujo (Tabla 4). Luego investigó la correlación entre la mejora de CD133
+ invasividad de las células y los porcentajes de poblaciones positivas para estos marcadores de la superficie. Se encontró una correlación significativa entre el aumento de CD133
+ invasividad de las células y el porcentaje de la CD10
+ población (
P Hotel & lt; 0,0001; ρ = 0,928; Figura 2B; Tabla 5). Como se muestra en la Tabla 4, el porcentaje de la CD10
+ población en cultivos primarios de fibroblastos asociados con el cáncer establecidas a partir de los tumores de colon variaba de 0,39% a 73,33%. También se encontró una correlación inversa significativa entre los porcentajes de la CD10
+ y CD105
+ poblaciones (
P Hotel & lt; 0,0001; Tabla 5), así como una significativa correlación inversa entre la mejora de CD133
+ invasividad de las células y el porcentaje de la CD105
+ población (
P = 0.0268
; Tabla 5).
a continuación, se determinó la expresión de CD10 en resecado quirúrgicamente tejidos primarios y se encontró que 0,4 a 25% de las células derivadas de tejidos de cáncer de colon eran CD10
+ (Tabla 1). A continuación, examinó las correlaciones entre el porcentaje de la CD10
+ de la población y los hallazgos clínico-patológicos. Encontramos tendencias hacia una correlación positiva entre el porcentaje de la CD10
+ población y la clasificación de Dukes y entre el porcentaje de la CD10
+ población y la metástasis de los ganglios linfáticos, aunque no fueron estadísticamente significativas (Tabla 2). También se investigó la correlación entre los marcadores de superficie celular en los mismos pacientes y se encontró una correlación significativa entre los porcentajes de la CD133
+ y CD10
+ poblaciones (
P = 0,015
; ρ = 0,4063 ;. Figura 2C)
CD10
+ fibroblastos mejorar los
Tarjetas telefónicas invasión
in vivo
crecimiento tumoral de CD133
+ células cancerosas in vitro y
Para investigar las diferencias funcionales entre CD10
+ y CD10
- fibroblastos, nos lo solucionaron CD10
+ y CD10
- fibroblastos (Figura 3 a) a partir de cultivos primarios de fibroblastos asociados al cáncer. Los niveles de
CD10
mRNA en estas dos poblaciones fueron consistentes con los niveles de expresión de la proteína de la superficie celular CD10 (Figura 3A). El uso de estas dos poblaciones de fibroblastos, investigamos sus efectos sobre la capacidad de invasión de CD133
+ y CD133
- las células cancerosas. CD10
+ fibroblastos mejoran la invasividad de CD133
+ células de cáncer significativamente más que CD10
- fibroblastos (
P Hotel & lt; 0,0001; células HCT116, la figura 3B; DLD-1 células, la figura 3C). CD10
+ fibroblastos también mejoraron ligeramente la invasividad de CD133
- las células cancerosas más que CD10
- fibroblastos, pero mucho menos que su efecto sobre la invasividad de CD133
+ células cancerosas (
P
& lt; 0,001; Figura 3C). Para evaluar los efectos de CD10
+ y CD10
- fibroblastos en
in vivo
el crecimiento del tumor, que cotransplanted CD133
+ o CD133
- las células cancerosas HCT116 y CD10
+ o CD10
- fibroblastos en ratones SCID. CD10
+ fibroblastos mejoran el crecimiento tumoral de CD133
+ células de cáncer significativamente más que CD10
- fibroblastos (
P Hotel & lt; 0,05; Figura 3D)
(. A) Análisis de cultivos primarios de fibroblastos asociados con el cáncer de colon (panel izquierdo) y reanálisis de CD10 ordenados
+ células (panel superior medio) y CD10
- células (panel inferior medio). El
CD10
niveles de mRNA en el CD10 ordenada
+ y CD10
- fibroblastos se midieron mediante qRT-PCR (panel derecho). (B, C) La invasión de CD133
+ y CD133
- las células cancerosas cocultured con CD10
+ o CD10
- se evaluó fibroblastos. fotografías representativos se muestran (B, las células HCT116; C, las células DLD-1). Barras de escala = 100 m. CD10
+ fibroblastos mejorar la capacidad de invasión de CD133
+ células de cáncer significativamente más que CD10
- fibroblastos (
P Hotel & lt; 0,0001). (D) Los efectos de CD10
+ y CD10
- fibroblastos en
in vivo
el crecimiento del tumor fueron evaluados a las 4 semanas después de cotransplantation de CD133
+ o CD133
- cáncer HCT116 y células CD10
+ o CD10
- fibroblastos en ratones SCID (
n
= 6 para cada grupo). fotografías representativas se muestran (panel superior). Barra de escala = 1 cm. CD10
+ fibroblastos aumentar el crecimiento tumoral de CD133
+ células cancerosas HCT116 significativamente más que CD10
- fibroblastos (
P Hotel & lt; 0,05; panel inferior). Los datos representan la media ± SD.
Efecto de CD10 caída en CD10
+ fibroblastos en la invasión de células de cáncer de colon cocultivadas
Para examinar si la proteína CD10 en los fibroblastos contribuye funcionalmente a la mejora de la invasión de células de cáncer de cocultivadas, fibroblastos transfectados con
CD10
-targeting pequeños RNAs de interferencia (siRNAs) (siRNA-1 y siRNA-2) o una siRNA de control se utilizaron para ensayos de invasión. Tanto de la
CD10
siRNAs -targeting inhibió el 90% de los
CD10
la expresión del ARNm. Desmontables expresión de CD10 en CD10
+ fibroblastos redujo notablemente la invasividad de cocultured CD133
+ células cancerosas HCT116 (
P Hotel & lt; 0,001; Figura 4), pero tuvo un efecto limitado en la invasividad de CD133 .
- las células cancerosas
Desmontables expresión de CD10 en CD10
+ fibroblastos reduce notablemente la invasividad de cocultured CD133
+ células cancerosas HCT116 (
P Hotel & lt; 0,001) , pero tiene un efecto limitado en la invasividad de CD133
- células cancerosas. Se muestran fotografías representativas (paneles superiores) y gráficos (panel inferior). Las barras de escala = 100 micras
Expresión diferencial de perfiles de CD10
+ y CD10
-. fibroblastos
Para dilucidar las moléculas clave que participan en el CD10
+ mejora de fibroblastos mediada de la
in vitro
células invasión y
in vivo
crecimiento tumoral de CD133
+ cáncer de colon, se realizan análisis de microarrays utilizando CD10
+ y CD10
- fibroblastos primarios-cultivadas derivadas de tumores de colon. Las comparaciones de los datos de microarrays entre CD10
+ y CD10
- fibroblastos primarios-cultivadas identificaron 20 genes que se upregulated por & gt; 2 veces en CD10
+ fibroblastos (Tabla S1). Para validar estos datos de microarrays, se realizó QRT-PCR. Seleccionamos
ALDH1A1
,
GPNMB
,
MMP 3 Opiniones y
IGFBP2 En venta los genes que figuran en la Tabla S1 porque se han reportado estos genes para participar en también se informó de la invasión de células cancerosas y las células madre del colon para expresar ALDH1 [21], [22], [23], [24], [25]. Los datos validados fueron consistentes con los datos de microarrays (Figura S5).
Para evaluar los efectos de
CD10
caída en las expresiones de los cuatro genes asociada a la invasión (
MMP 3
,
ALDH1A1
,
GPNMB
y
IGFBP2
) en CD10
+ fibroblastos, CD10
+ fibroblastos se transfectaron con
CD10
se evaluaron -targeting o de control de siRNAs, y las expresiones de los cuatro genes asociada a la invasión. No hubo cambios significativos en la expresión de estos cuatro genes (Figura S6).
Discusión
En el presente estudio, los
in vitro
experimentos revelaron que CD10
+ fibroblastos derivados de tejidos de cáncer de colon mejora de forma significativa la invasión de CD133
+ células de cáncer de colon en comparación con CD10
- fibroblastos. También se encontró que desmontables de CD10 en CD10
+ fibroblastos reducen parcialmente la invasividad de las células CD133
+ cocultivadas cáncer de colon. Por otra parte, nuestro
in vivo
análisis demostraron que cotransplantation de CD10
+ fibroblastos aumentó significativamente el crecimiento tumoral de CD133
+ células de cáncer de colon en comparación con cotransplantation de CD10
- fibroblastos. Tomados en conjunto, estos datos sugieren que un subconjunto específico de células de cáncer de colon, CD133
+ células, tiene importantes interacciones con un subconjunto específico de los fibroblastos asociados al cáncer, CD10
+ fibroblastos. Este es el primer informe para describir las interacciones de células de cáncer de células del estroma entre prospectivamente ordenados subconjuntos específicos de células de cáncer de colon y los fibroblastos asociados con el cáncer
.
CSC han sido aislados de cáncer de colon en la base de su expresión de la célula marcador de superficie CD133 [3], [12], [26]. Aunque varios investigadores han publicado recientemente informes sobre CD133
+ células de cáncer de colon [3], [12], [26], no hubo datos inconsistentes con respecto a la capacidad iniciadoras del tumor de CD133
+ células de cáncer de colon. En el presente estudio, encontramos potencial tumorigénico en tanto CD133
+ y CD133
- las células de cáncer de colon, en consonancia con los resultados de Shmelkow et al. [14]. Por otra parte, no se encontraron diferencias significativas entre estas dos poblaciones de células en su
in vitro
la proliferación celular, la formación de colonias y quimio-resistencia. Sin embargo, la presente
in vivo
análisis revelaron que CD133
+ células generadas tumores significativamente más grandes que CD133
- células. Para entender las implicaciones de los resultados inconsistentes entre el
in vitro Opiniones y
in vivo
experimentos, nos centramos en las interacciones célula-célula estromal de cáncer, que se sabe que tienen un papel crucial en la progresión del cáncer [ ,,,0],27]. En co-cultivos con varios cultivos primarios de fibroblastos asociados al cáncer, la invasividad de CD133
+ células de cáncer de colon fue significativamente aumentado en comparación con la de CD133
- células, mientras que los cultivos primarios de otros fibroblastos asociados al cáncer no parecen tener tal potencial para mejorar la invasividad de las células cancerosas. Por lo tanto, hemos caracterizado estos cultivos primarios de fibroblastos asociados al cáncer, y se encontró que CD10
+ fibroblastos jugaron un papel importante en la mejora de CD133
+ invasión de células de cáncer en
in vitro y en
in vivo
experimentos
en el presente estudio, hemos utilizado CD133
+ y CD133
- células aisladas de líneas celulares cultivadas porque no fuimos capaces de obtener resultados reproducibles para los ensayos de carcinogénesis y experimentos de cocultivo cuando utilizamos CD133
+ y CD133
- células aisladas de los tumores de los pacientes en un estudio preliminar. Sin embargo, es importante investigar los comportamientos biológicos de CD133
+ y CD133
- subpoblaciones aisladas de los tumores de los pacientes. Por lo tanto, se necesitan más exámenes para aclarar la relación entre CD133 derivado del tumor primario
+ células cancerosas y CD10
+ fibroblastos. Sin embargo, tenemos que mejorar nuestros métodos de cultivos primarios de células de cáncer antes de que dichos exámenes se pueden realizar. Además, se utilizaron modelos subcutáneos en el presente estudio debido a las dificultades encontradas en la evaluación del tamaño del tumor en modelos ortotópico. Sin embargo, teniendo en cuenta la importancia del microambiente del tejido, los estudios que utilizan modelos ortotópico deben realizarse como el siguiente paso.
CD10 es una superficie celular metaloproteasa dependiente de cinc 90 a 100 kDa que se expresa ampliamente por las células en diversos tejidos, tales como células linfoides progenitoras, células mioepiteliales y células del estroma de la médula ósea normal y el endometrio [28], [29], [30], [31]. Además, CD10 se informó a ser un marcador para la clasificación de las leucemias agudas y linfomas malignos subclasificar [32]. Los estudios inmunohistoquímicos recientes revelaron que la frecuencia de expresión del estroma CD10 positivo en los tumores fue significativamente correlacionado con el pronóstico de pacientes con cáncer de mama [18], así como la invasión y la metástasis de los cánceres gástricos [19]. Ogawa et al. [31] realizó un estudio inmunohistoquímico de cáncer colorrectal y informaron que la expresión de CD10 en las células del estroma se ha detectado con mayor frecuencia en tumores invasivos que en los tumores no invasivos. Los resultados de estos estudios inmunohistoquímicos anteriores son consistentes con los de nuestro estudio funcional presente.
Los presentes resultados demuestran que desmontables de expresión de CD10 en CD10
+ fibroblastos parcialmente, pero de manera significativa, disminución de la capacidad invasiva de cocultured CD133
+ células de cáncer de colon. Nuestros datos de microarrays identificado varios genes que están involucrados en la invasión de las células cancerosas, pero desmontables expresión de CD10 no afectaron a las expresiones de estos genes. Los datos pueden sugerir que CD10
+ fibroblastos tienen ambos mecanismos CD10-dependiente y CD10-independiente para promover la invasión de cocultured CD133 células
+ cáncer de colon, aunque se requieren exámenes adicionales para dilucidar los mecanismos detallados de estas interacciones.
en conclusión, el presente análisis funcionales sugieren que las interacciones entre CD133
+ células cancerosas de colon y cáncer asociados CD10
+ fibroblastos tienen un papel importante en la progresión del cáncer de colon. Estas interacciones pueden ser objetivos prometedores para terapias contra el cáncer de colon.
Materiales y Métodos
Ética declaración
El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Kyushu (número de autorización, 19 -13) y llevado a cabo de acuerdo con las directrices éticas para Genoma humano /Gen promulgadas por el Gobierno japonés. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado firmado la aprobación del uso de sus tejidos con fines de investigación no especificados. Para todos los experimentos con ratones, los animales fueron alojados en gabinetes de flujo laminar en condiciones libres de patógenos específicos en instalaciones aprobadas por la Universidad de Kyushu (número de autorización, A020-018-0).
Células y reactivos
líneas celulares de cáncer de colon humano (DLD-1, RCM1 y COLO201) se adquirieron de la Colección japonesa de Recursos Biológicos de investigación (Osaka, Japón). Las líneas de células LOVO y Colo205 se obtuvieron de RIKEN (Tsukuba, Japón) y la línea celular HCT116 se obtuvo de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). Establecimos 32 cultivos primarios de fibroblastos asociados con el cáncer de colon derivados de tumores de colon resecado de 26 pacientes como se ha descrito anteriormente [33]. Las células se cultivaron en DMEM complementado con estreptomicina (100 mg /ml), penicilina (100 U /ml) y suero bovino fetal al 10% (FBS) a 37 ° C en un ambiente humidificado de 90% de aire y 10% de CO
2. Todos los experimentos se realizaron con células cultivadas en medio suplementado con 10% FBS. Todas las muestras de tejido se obtuvieron en el momento de la cirugía en el Departamento de Cirugía I, Hospital de la Universidad de Kyushu (Fukuoka, Japón). patólogos experimentados realizaron exámenes histológicos de todos los tejidos adyacentes a los especímenes.
5-Fu y DOX fueron amablemente proporcionados por Wako Pure Chemical Industrias (Osaka, Japón) y Nippon Roche K.K. (Kamakura, Japón), respectivamente.
La citometría de flujo
Las muestras de tejido se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS), picado en aproximadamente 1 mm
3 cubos con unas tijeras y se disocia en células individuales por digestión con colagenasa (Wako Pure Chemical Industries). se pasaron las células disociadas a través de un filtro. Las células primarias derivadas de los tejidos resecados y se disociaron células DLD-1 se suspendieron en helado de FBS al 1% en PBS a 1 × 10
6 células /100 l. Cada suspensión se incubó con un anticuerpo en hielo durante 40 min. Se analizaron las células marcadas usando un citómetro de flujo EPICS ALTRA (Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA) equipado con dos láseres que proporcionaron las longitudes de onda de excitación de 488 nm para el isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE) y yoduro de propidio (PI) señales y 635 nm para las señales de aloficocianina (APC). Se recogieron las emisiones de fluorescencia resultantes utilizando conjuntos de filtros de paso de banda a 525 ± 15 nm para FITC, 575 ± 10 nm para el PE, 610 ± 12 nm para PI y 675 ± 25 nm para APC. software de citometría de flujo EXPO32 (Beckman Coulter Inc.) se utilizó para cuantificar las señales de fluorescencia y para establecer los parámetros de gating electrónicos lógicos. Los anticuerpos primarios utilizados para los análisis FACS se enumeran en la Tabla S2.
QRT-PCR
ARN total fue extraído a partir de células cultivadas y /o ordenados usando un kit de aislamiento de ARN de alta Pure (Roche Diagnostics , Mannheim, Alemania) con DNasa I (Roche Diagnostics) de tratamiento, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Hemos diseñado cebadores específicos (Tabla S3) y se realizó BLAST busca para asegurar las especificidades de estos cebadores. Un solo paso QRT-PCR se realizó utilizando un Kit QuantiTect SYBR Green transcripción inversa-PCR (Qiagen KK, Tokyo, Japón) y una previamente Sistema de Detección de PCR Chromo4 Real-Time (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), como se describe [ ,,,0],34]. Cada muestra se realizó por triplicado y la expresión de cada gen se presenta como la relación entre la expresión de ARNm de cada gen diana y el de
18S rRNA
.
CD10
siRNAs
la inhibición de
CD10
la expresión de genes se logró por la interferencia de ARN con siRNAs contra
CD10 gratis (siRNA-1: sentido, 5'-GGUUGAAUUUCACAAAUGATT-3 ', antisentido, 5'-UCAUUUGUGAAAUUCAACCAG-3 '; siRNA-2: sentido, 5'-GUGUGGUGUGGAACCUAUATT-3', antisentido, 5'-UAUAGGUUCCACACCACACCT-3 '; Qiagen, Poison Information Center Mainz, Alemania) como se describe anteriormente [35]. Para verificar la especificidad de los efectos desmontables, se utilizó un control de siRNA (Qiagen). [39].