Extracto
Como el cáncer de próstata progresa a la enfermedad resistente a la castración, hay un aumento en la actividad de transducción de señales. La mayoría de los tumores de próstata resistentes a la castración continúan para expresar el receptor de andrógenos (AR), así como genes sensibles a andrógenos, a pesar de la casi ausencia de circulación de andrógenos en estos pacientes. La AR es regulada no sólo por su hormona esteroide emparentado, sino también por la interacción con una constelación de corregulación y moléculas de señalización. Por lo tanto, la actividad de señalización elevada que se produce durante la progresión a la resistencia a la castración puede afectar el crecimiento de células de cáncer de próstata, ya sea a través de la AR o independiente de la AR. Con el fin de identificar vías de señalización que regulan el crecimiento de células de cáncer de próstata, que exhibió un panel de shRNAs orientación 673 quinasas humanos contra las células de cáncer de próstata LNCaP cultivadas en presencia y en ausencia de hormona. La pantalla identifica múltiples clones ARNhc contra objetivos de genes conocidos y nuevos que regulan el crecimiento de células de cáncer de próstata. Sobre la base de la magnitud del efecto sobre el crecimiento, se seleccionaron seis quinasas para el estudio adicional: MAP3K11, DGKD, ICK, CIT, GALK2, y PSKH1. Desmontables de estas quinasas disminución del crecimiento celular tanto en células de cáncer de próstata andrógeno-dependientes y resistentes a la castración. Sin embargo, estas quinasas tenían diferentes efectos sobre la actividad transcripcional basal o inducida por andrógenos de AR genes diana. MAP3K11 desmontables alterado más consistentemente transcripción de genes diana AR, lo que sugiere que MAP3K11 afectó a su efecto inhibidor del crecimiento mediante la modulación del programa AR transcripcional. En consonancia con MAP3K11 que actúa sobre la AR, desmontables de MAP3K11 inhibida AR Ser 650 fosforilación, más el apoyo a la regulación de la fosforilación de la quinasa de estrés AR. Este estudio demuestra la aplicabilidad de shRNA basada en lentiviral para la realización de pantallas fenotípicas e identifica MAP3K11, DGKD, ICK, CIT, GALK2, y PSKH1 como reguladores del crecimiento de las células del cáncer de próstata. La evaluación exhaustiva de estos objetivos quinasa allanará el camino para el desarrollo de tratamientos más eficaces para el cáncer de próstata resistente a la castración
Visto:. Whitworth H, Bhadel S, M Ivey, Conaway M, Spencer A, Hernan R, et Alabama. (2012) La identificación de quinasas que regulan el crecimiento celular del cáncer de próstata mediante una pantalla de RNAi fenotípica. PLoS ONE 7 (6): e38950. doi: 10.1371 /journal.pone.0038950
Editor: Jindan Yu, de la Northwestern University, Estados Unidos de América
Recibido: 11 Enero, 2012; Aceptado: 15-may de 2012; Publicado: 27 Junio 2012
Derechos de Autor © 2012 Whitworth et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud de subvención R01 CA124706 a la DG y el Instituto del cáncer Urológico Paul Mellon de la Universidad de Virginia. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores han leído la política de la revista y tienen los siguientes conflictos: Andrea Spencer, Ronald Hernan, y Heather Holemon se emplearon en Sigma-Aldrich Biotecnología durante la pantalla de RNAi. Sigma-Aldrich vende la biblioteca misión que se utilizó en este estudio. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
El receptor de andrógenos (AR) es un regulador crítico de la progresión del cáncer de próstata y es cada vez más claro que la AR es regulada no sólo por su hormona esteroide emparentado, sino también por la interacción con una constelación de moléculas co-regulación y señalización [1] - [3]. Para los pacientes que presentan cáncer de próstata diseminado, el tumor depende típicamente en andrógenos para el crecimiento y, por lo tanto, inicialmente sensible a quirúrgico y /o el agotamiento farmacológica de andrógenos circulantes [4]. Sin embargo, el éxito terapéutico es temporal. El cáncer casi invariablemente se repite y progresa a una enfermedad metastásica y letal. La extensa charla cruzada entre las vías de señalización, tales como andrógenos y péptidos vías de señalización, múltiples mutaciones genéticas, y la plasticidad genética de cáncer, todo ello contribuye a la resistencia intrínseca y adquirida a la ablación de andrógenos [5].
Los estudios previos han demostrado que las vías de señal de factor de crecimiento polipeptídico de transducción pueden estimular la activación de AR, lo que sugiere que el aumento de factor de crecimiento y la expresión del receptor podría ser causal en la progresión del cáncer de próstata a la resistencia a la castración. estimulación del factor de crecimiento ha sido reportado para hacer promotores AR-sensible hipersensibles a los andrógenos [6] - [14], y obligado a más de expresión de HER2 /neu en células de cáncer de próstata dependientes de andrógenos se ha demostrado para impulsar el crecimiento resistente a la castración [15] , [dieciséis]. Por otra parte, la inhibición de la señalización /HER2 EGFR puede inhibir el crecimiento de células de cáncer de próstata
e in vitro
in vivo
[17], [18], así como la actividad transcripcional de AR, estabilidad de la proteína, el ADN de unión y Ser 81 fosforilación [19]. La capacidad de las cascadas de señalización para influir en la función AR puede jugar un papel importante en el desarrollo y progresión del cáncer de próstata en el que el aumento de la actividad de transducción de señales se ha asociado con la adquisición de la enfermedad resistente a la castración. Esto sugiere que las estrategias terapéuticas dirigidas a cascadas de quinasas pueden superar los mecanismos de señalización de compensación que limitan la eficacia de la ablación de andrógenos.
Con el fin de identificar las vías de señalización que regulan el crecimiento de células de cáncer de próstata, que exhibió un panel de shRNAs que se dirigen la kinome humano contra las células de cáncer de próstata LNCaP cultivadas en presencia y en ausencia de andrógenos. Se realizaron búsquedas de quinasas que tenían efectos generales de crecimiento y quinasas que compensaron la ablación de andrógenos. La pantalla identifica múltiples clones ARNhc contra objetivos de genes que regulan tanto la sensibilidad de andrógenos y el crecimiento celular. Presentamos aquí los resultados de nuestra pantalla y la evaluación detallada de un subconjunto de quinasas identificados como reguladores del crecimiento de las células del cáncer de próstata.
Resultados
Antes de cribado de un panel de shRNAs que se dirigen a la humana kinome contra las células de cáncer de próstata LNCaP, se realizó la optimización cuidadosa de los parámetros, incluidas las condiciones de crecimiento celular, multiplicidad de infección, la selección de puromicina, el tratamiento de andrógenos, y mediciones de viabilidad celular (datos no presentados). Se identificaron clones ARNhc que disminuyeron y el aumento del crecimiento de células LNCaP tanto en la presencia y ausencia de andrógenos (Figura 1). La pantalla utiliza la biblioteca MISSION® con tres a cinco shRNAs para cada uno de los 673 objetivos quinasa; tres réplicas biológicas independientes se realizaron en días separados. Después de la precipitación, las alteraciones en el metabolismo celular LNCaP se determinaron utilizando alamarBlue como un sustituto para la proliferación celular. Se identificaron varios clones ARNhc contra objetivos de genes que afectan el crecimiento celular. Se transdujeron
células LNCaP por triplicado con tres a cinco shRNAs dirigidos contra 673 quinasas humanas. El crecimiento celular se midió por alamarBlue en el día 7. Plotted es el crecimiento celular relativo a pLKO control de vector vacío en respuesta a cada shRNA en presencia y ausencia de la hormona (0,05 nM R1881). Las líneas rojas y verdes demarcar los puntos de corte basado en los controles incluidos pLKO, NTC, medio solo, y AR shRNA. La línea roja indica la inhibición del crecimiento y el crecimiento de la línea verde.
No hubo diferencias en el crecimiento cuando se comparan pLKO vector vacío con un control no-objetivo (NTC) (n = 82, los datos no presentados) . células de andrógenos tratados crecieron 3,2 veces mayor que las células tratadas con vehículo (n = 82). knockdown AR usando shRNA se utilizó como control positivo en la pantalla, la inhibición del crecimiento en más de un 60% en las células cultivadas en presencia de andrógenos (n = 41, los datos no presentados), pero que tiene un efecto mínimo sobre las células LNCaP cultivadas en ausencia de andrógenos (n = 41, datos no mostrados). En presencia de andrógenos, que anotó shRNAs que inhibieron el crecimiento de al menos un 75%, lo que representa menos del 1% de inhibición de crecimiento shRNAs, como shRNAs orientación quinasas que regulan positivamente el crecimiento de células LNCaP. En ausencia de andrógenos, que anotó shRNAs que inhibieron el crecimiento en un 50% o más, lo que representa menos del 2% de inhibición de crecimiento shRNAs, como shRNAs orientación quinasas que regulan positivamente el crecimiento de células LNCaP. Utilizando estos criterios, shRNA desmontables de 46 quinasas inhibe el crecimiento celular. Curiosamente, muy pocos shRNAs mostró un efecto que era dependiente de la presencia o ausencia de andrógenos. La mayoría de shRNAs inhibió el crecimiento en ambas condiciones, aunque la magnitud de la inhibición varió, lo que indica que esta pantalla no reveló quinasas que regulan específicamente el crecimiento de células LNCaP inducida por andrógenos. proteína ribosomal S6 quinasa (RPS6KA3), que ha sido implicado en la regulación de la actividad de AR y el crecimiento de células de cáncer de próstata [20] - [24], fue identificado en esta pantalla, el apoyo a un enfoque de detección RNAi para identificar quinasas que regulan el crecimiento de células de cáncer de próstata. También observamos 34 quinasas que representan al 1% más alto, cuya caída aumento del crecimiento celular LNCaP (Figura 1)
Se seleccionaron seis quinasas inhibidores para estudios posteriores en base a la magnitud del efecto de shRNA desmontables:. proteína activada por mitógenos quinasa quinasa quinasa 11 (MAP3K11), diacilglicerol quinasa delta (DGKD), quinasa de células intestinales (ICK), Rho quinasa interactuando cidra (CIT), galactokinase2 (GALK2), y la proteína serina H1 quinasa (PSKH1). Una predicción postula que si las quinasas que disminuyen el crecimiento cuando son derribados causal en la progresión del cáncer de próstata, a continuación, la actividad de estas quinasas debería aumentar durante la progresión del cáncer. Como un paso intermedio para examinar el estado de activación de las quinasas, se examinaron los niveles de mensajero de la quinasa en la base de datos Oncomine. Se encontró que en al menos dos estudios independientes de los niveles de ARNm para los seis quinasas aumentaron ya sea cuando el cáncer de próstata primario se compara con la próstata normal o cuando el cáncer de próstata metastásico se compara con enfermedad primaria o de la próstata normal (Figura S1).
Hemos validado el efecto crecimiento y la caída de nuestros seis quinasas seleccionadas utilizando el ensayo CyQuant, que mide el contenido de ADN como un sustituto para el número de células, y utilizamos esta técnica también extender nuestro análisis a la línea celular resistente a la castración, C4-2B. Las células fueron transducidas con partículas lentivirales que expresan dos específica shRNAs para cada quinasa de interés o pLKO control de vector vacío en presencia (0,05 nM R1881) o ausencia de andrógenos. Como se observa en la Figura 2, el crecimiento se redujo en ambas líneas celulares en respuesta a cada shRNA. En general, quinasa desmontables inhibe el crecimiento en presencia y en ausencia de andrógenos. Además, quinasa desmontables crecimiento afectada de manera equivalente tanto en la LNCaP dependiente de andrógenos y la línea celular C4-2B resistente a la castración.
El efecto relativo de dos shRNAs independientes por quinasa en el crecimiento celular en LNCaP (A) y C4- 2B células (B). CyQuant Ensayo de contenido de ADN medido como un sustituto para el número de células 7 días después de la transducción de shRNA. El experimento se realizó en presencia y ausencia de la hormona (0,05 nM R1881), n = 3-7, dependiendo de la quinasa. El crecimiento celular se comparó con el control sin tratar pLKO y los valores fueron promediados a través de repeticiones biológicos. Las barras de error representan el error estándar de la media. * Denota significación estadística.
qPCR se utiliza para determinar la quinasa de derribo por shRNA en células LNCaP y C4-2B (Figura 3). La hormona se añadió a diversas concentraciones (vehículo, 0,05, 0,5, y 1 nM R1881) y el ARN se aisló a las 2 y 24 horas después del tratamiento hormonal. Estos tratamientos hormonales fueron los mismos que los utilizados para evaluar el efecto de la quinasa desmontables sobre la actividad transcripcional de AR, que se describe a continuación y se presenta en la Tabla 1. Cada quinasa fue derribado en ambas líneas celulares con dos shRNAs diferentes y se comparó con la pLKO vacía control de vectores. No se observó un efecto de la dosis de la hormona sobre la eficiencia de caída quinasa (Figura S2); Por lo tanto, los datos mostrados en la Figura 3 son los valores promedio de qPCR a través de repeticiones biológicos y concentraciones de la hormona para cada shRNA o el control pLKO a las 24 horas después de la estimulación hormonal. Los virus shRNA provocan mayor que 50% desmontables de ARNm quinasa diana en comparación con pLKO, con la mayoría de caídas mayor que 70% en ambos puntos temporales y en ambas líneas celulares. Esencialmente se hicieron observaciones idénticas para quinasa desmontables siguientes 2 horas de estimulación de la hormona (datos no mostrados).
niveles de transcripción quinasa en LNCaP (A) y C4-2B células (B) siguientes caída con dos shRNAs independientes por quinasa . Los niveles de transcripción se midieron por qPCR en día 4 después de la transducción y 2 horas después del tratamiento hormonal R1881 (vehículo, 0,05, 0,5, y 1 nM). Los niveles de transcripción se compararon con el control sin tratar pLKO y normalizado para la limpieza de genes, PSMB6. Los valores se calculan los promedios en las concentraciones hormonales y biológicos repeticiones. Las barras de error representan el error estándar de la media. * Denota significación estadística.
Hubo cierta caída del diferencial de ARNm de cinasa por shRNA, lo que puede explicar la caída del diferencial de crecimiento. Por ejemplo, en las células LNCaP, CIT shRNA-2 provocó una inhibición del crecimiento mayor que CIT shRNA-1, que es paralelo a el efecto sobre la caída mRNA quinasa, donde CIT shRNA-2 reduce los niveles de ARNm de CIT más que CIT shRNA-1. Sin embargo, el paralelismo entre la inhibición del crecimiento y caída mRNA no son evidentes para todos los quinasas específicas.
Con el fin de determinar si la inhibición del crecimiento inducida por la caída quinasa era específica para las células del cáncer de próstata, que mide el crecimiento de LHS y células MCF10A en respuesta a la orientación shRNA los siete quinasas (Figura 4). células LHS son no tumorigénicas células epiteliales de la próstata humana inmortalizadas generados por la expresión ectópica de antígeno T SV40 grande, pequeño, y la telomerasa humana [25]. MCF10A es un no tumorigénicos, línea de células epiteliales de mama inmortalizada espontáneamente [26]. células LNCaP sirvieron como control, con experimentos paralelos que demuestran la inhibición del crecimiento de células LNCaP y de expresión quinasa (datos no mostrados). En general, los shRNA dirigido contra las quinasas tuvo un efecto mínimo sobre el crecimiento celular y LHS MCF10A, lo que sugiere la selectividad hacia las células de cáncer de próstata (Figura 4). La caída de mensaje quinasa en las células MCF10A LHS y era variable (datos no presentados). En las células LHS, MAP3K11 fue eliminado eficazmente hacia abajo (inhibición del 75 al 90%) y PSKH1 (inhibición 50%); sin embargo, la caída fue ineficiente para las otras quinasas. En las células MCF10A, se inhibió CIT (80%) y PSKH1, DGKD, y GALK2 se inhibe por cada aproximadamente 50%. La incapacidad para inhibir la expresión de la quinasa en un grado similar como en LNCaP, C4-2B, (Figura 3) y células CWR22Rv1 (datos no presentados), lo que complica la interpretación de la importancia de estas quinasas en el crecimiento normal de las células y la supervivencia. Sin embargo, los seis quinasas fueron derribados en al menos una de las líneas celulares normales probados. Por lo tanto, estos resultados son consistentes con la existencia de selectividad para la orientación de estas quinasas en células de cáncer más de las células normales.
el efecto relativo de dos shRNAs independientes por quinasa en el crecimiento celular en LHS (A) y MCF10A células (B) . CyQuant Ensayo de contenido de ADN medido como un sustituto para el número de células 7 días después de la transducción de shRNA. n = 2 para las células LHS y n = 3 para las células MCF10A. El crecimiento celular se comparó con el control pLKO y los valores fueron promediados a través de repeticiones biológicos. Las barras de error representan el error estándar de la media.
Dado que la AR es un importante regulador del crecimiento de las células del cáncer de próstata, quisimos determinar si alguno de los seis seleccionados quinasas podría afectar el crecimiento a través de la regulación del transcriptoma AR . Para examinar el efecto de la quinasa desmontables en el blanco AR transcripción de genes, qPCR se utilizó para medir los niveles de transcripción de dos genes diana AR, TMPRSS2 y SGK, en las células LNCaP y C4-2B con dos shRNAs independientes utilizados para inhibir la expresión de quinasa (Tabla 1) . Examinamos la transcripción de estos genes a las 2 y 24 horas para evaluar el efecto de la caída de quinasa en los niveles de respuesta y de estado estable inmediatamente temprano de la actividad transcripcional de AR. El análisis estadístico indica que no hubo efecto de la dosis de la hormona de la capacidad de quinasa caída para afectar a la transcripción AR; quinasa desmontables transcripción alterada de forma equivalente, o no tuvo ningún efecto, a cada dosis de andrógenos. se observó Mantenimiento de la inducción de andrógenos en pLKO en todos los experimentos analizados. Exponen en la Tabla 1 son los cambios estadísticamente significativos en la transcripción AR de TMPRSS2 y SGK en respuesta a quinasa desmontables por dos shRNAs independientes a las 2 y 24 horas después de tres tratamientos de dosis de andrógenos diferentes. Tanto shRNAs tuvo que alterar la transcripción de genes significativamente en la misma dirección para informar en la tabla.
No hubo disminución constante en la actividad transcripcional de AR en respuesta a la caída de los seis quinasas a través de ambas líneas celulares, genes diana AR examinados , y los dos puntos de tiempo ensayados (Tabla 1). Desmontables de MAP3K11 disminución de la transcripción de TMPRSS2 en células LNCaP a las 24 horas y en las células C4-2B a las 2 horas después de la adición de andrógenos. Sin embargo, MAP3K11 caída aumenta la transcripción de SGK en células C4-2B 2 horas después de la adición o de la hormona. Desmontables de DGKD disminución de la transcripción de TMPRSS2 en células C4-2B y de SGK en las células LNCaP a las 24 horas. No hubo cambio en TMPRSS2 o transcripción SGK en cualquiera de las líneas de células como resultado de la caída de ICK o PSKH1. CIT caída tiene efectos dispares en la transcripción AR. Curiosamente, el efecto más consistente en la transcripción AR era de GALK2 desmontables, lo que provocó un aumento de la SGK a las 24 horas después de la adición de la hormona en ambas líneas celulares y en 2 horas en las células C4-2B. Sin embargo, examinando solamente TMPRSS2 y SGK como objetivo genes AR representante podrá crear un sesgo de selección; Por lo tanto, hemos ampliado nuestro análisis de los genes AR-regulado.
Se analizaron 14 genes adicionales, incluyendo el PSA genes AR-activado, FKBP51, ORM1, macho, Nkx3.1, FASN, AQP3, KLK2, y UGT2B ; los genes reprimidos AR-DKK y FST; y los genes de cáncer de próstata AR-regulada resistentes a la castración CDC20, CDK1, y UBE2C. La transcripción en células LNCaP siguientes knockdown MAP3K11 se examinó a las 24 horas después del tratamiento de andrógenos. Como era de esperar, los andrógenos inducido o la transcripción de todos los genes diana de AR en las células de control pLKO reprimida. El efecto de la caída en la transcripción MAP3K11 AR depende de destino. transcripción de TMPRSS2, SGK estimulado por andrógenos, y ORM1 se redujo en respuesta a la caída MAP3K11 (Figura 5A). El inverso es cierto para los genes reprimidos andrógenos DKK y FST. MAP3K11 knockdown estimuló la expresión de genes y la disminución de la cantidad de la represión inducida por andrógenos (Figura 5B). PSA, FKBP51, macho, Nkx3.1, FASN, AQP3, KLK2, y UGT2B no cambiaron en respuesta a MAP3K11 caída. En la medida en este subconjunto de AR genes diana representa el transcriptoma AR, estos datos sugieren que la inhibición del crecimiento celular en respuesta a MAP3K11 quinasa desmontables puede ser debido a la regulación de la actividad transcripcional de AR en un subconjunto de los genes regulados-AR. La AR regula de forma selectiva del ciclo celular genes regulados como CDC20, CDK1, y UBE2C para promover el crecimiento celular [27]. Se encontró que MAP3K11 caída condujo a una reducción leve pero estadísticamente significativa en la transcripción de estos genes AR-regulada de la fase M (Figura 5C).
niveles (A) transcripción de genes diana AR andrógenos inducida por eso cambió en respuesta a MAP3K11 caída en células LNCaP transducidas con dos shRNAs independientes y de control pLKO. Se aisló el ARN 24 horas después de la adición de R1881 en 1 nM. Los niveles de transcripción se midieron por qPCR, en comparación con pLKO y normalizado para la limpieza de genes, GUS. (B) Los niveles de transcripción de los genes diana de andrógenos AR-reprimido y niveles (C) de transcripción de los genes regulados de la fase M-AR se describe en [27]. (B) y (C) se procesaron como se describe para (A). Los valores se promediaron a través de repeticiones biológicos, n = 3. Las barras de error representan el error estándar de la media. * Denota significación estadística.
Anteriormente, hemos demostrado que las quinasas de estrés podrían regular AR Ser 650 fosforilación [28]. Por lo tanto, para explorar más a fondo el mecanismo de regulación MAP3K11 del crecimiento celular del cáncer de próstata y la transcripción AR, hemos probado si MAP3K11 caída regulada AR Ser 650 fosforilación desde MAP3K11 es un regulador aguas arriba de la actividad de JNK. PMA inducida por AR Ser 650 fosforilación en las células LNCaP y C4-2B más de 3 veces (Figura 6). En estos experimentos, tanto shRNAs disminución de la expresión de proteínas MAP3K11, con MAP3K11 shRNA-1 expresión disminución en un grado mayor que MAP3K11 shRNA-2. No se observaron alteraciones similares en la fosforilación de c-Jun, lo que sugiere que la MAP3K11 shRNA inhibe la señalización de la quinasa de estrés inducida por PMA. En estas condiciones, AR Ser 650 fosforilación disminuyó tanto en las células LNCaP y C4-2B. Se observó una disminución paralela de AR total. La cuantificación de la cantidad relativa de Ser 650 fosforilación total AR mostró una reducción en fosfo-Ser 650 (Figura 6 histograma), lo que sugiere un cambio estequiométrico en AR Ser 650 fosforilación en respuesta a MAPK3K11 caída. MAP3K11 shRNA-1 tuvo el mayor impacto en la AR Ser 650 fosforilación, en paralelo con el efecto sobre la expresión de la proteína MAP3K11 y la fosforilación de c-jun. Estas observaciones son consistentes con nuestros resultados anteriores que sugieren que la señalización de estrés quinasa regula AR Ser 650 fosforilación [28] y además sugieren que MAP3K11 caída puede provocar la inhibición del crecimiento a través de la interrupción de la AR.
LNCaP y C4-2B Las células fueron transducidas con dos independientes shRNAs orientación MAP3K11 o control pLKO. Las células se trataron con vehículo o PMA. AR total se inmunoprecipitó y borró de fosfo-S650 y los niveles de AR totales. El lisado celular se transfirió a MAP3K11 total, el total de JNK, fosfato JNK, y tubulina. Plotted es la señal de fosfo-S650 normalizado a AR totales, n = 3. Se realizó la cuantificación en el sistema de formación de imágenes Odyssey LICOR. Las barras de error representan el error estándar de la media.
Discusión
Nuestro estudio demuestra la aplicabilidad de shRNA basado en lentiviral para la realización de pantallas fenotípicas para identificar los objetivos implicados en el crecimiento del cáncer de próstata. Las vías de señalización que regulan el crecimiento de células de cáncer de próstata y la actividad AR desempeñan un papel fundamental en la transición de cáncer de próstata dependiente de andrógenos a la enfermedad resistente a la castración [29]. Con el fin de identificar las quinasas dentro de estas redes, se examinó cómo RNAi desmontables de las quinasas afecta el crecimiento de células de cáncer de próstata LNCaP. Hemos previsto la búsqueda de los dos nuevos y conocidos reguladores de crecimiento. Las quinasas de pantalla identificado previamente demostrado para regular el crecimiento de células de cáncer de próstata y la actividad AR, incluyendo el ribosomal S6 quinasa (RPS6KA3 o RSK) [30]. RSK se encuentra aguas abajo de la MAPK y aumenta la transcripción de PSA. La inhibición química de RSK disminución de la expresión de PSA y el crecimiento de células de cáncer de próstata [30]. RSK parece mediar la activación transcripcional AR a través de su propia función de quinasa, así como las interacciones con p300, un AR co-regulador con actividad HAT. La identificación de RSK en nuestra pantalla es compatible con las pantallas de genética hypomorphic para identificar quinasas que regulan el crecimiento de células de cáncer de próstata.
Varios objetivos fueron identificados en nuestra pantalla de RNAi, lo que sugiere que múltiples vías de señalización regulan el crecimiento celular del cáncer de próstata quinasa. Se seleccionaron seis quinasas para su posterior estudio, incluyendo MAP3K11, DGKD, ICK, CIT, GALK2, y PSKH1. Se encontró Desmontables de los seis quinasas para disminuir el crecimiento celular tanto en células de cáncer de próstata andrógeno-dependientes y resistentes a la castración. Para determinar si el efecto de crecimiento fue mediada a través de la AR, examinamos inicialmente transcripción de dos genes de respuesta AR bien caracterizados, TMPRSS2 y SGK. No se observó un efecto consistente a través de los puntos de tiempo y las líneas celulares de la prueba en la transcripción de AR TMPRSS2 y SGK cuando los seis quinasas fueron derribados. Sin embargo, cuando hemos ampliado nuestro análisis de 16 genes en total AR-reguladas en respuesta a MAP3K11 desmontables, se encontró que un subconjunto de los genes diana de AR fue alterado. Esto sugiere que MAP3K11 caída puede modular la actividad transcripcional de AR y puede mediar sus efectos sobre el crecimiento a través de la AR. Además, estos datos se suman a la evidencia de que la AR se puede regular de una manera selectiva promotor, lo que le permite servir como un integrador de múltiples señales extracelulares. Nuestro laboratorio y otros han informado de esto en los estudios anteriores [31], [32]. Otros experimentos que involucran genes diana AR adicionales serán necesarios para evaluar plenamente los efectos de la caída de estos seis quinasas en la transcripción AR.
MAP3K11, también llamado de linaje mixto quinasa (MLK3), es un miembro de la serina /treonina familia quinasa que activa preferentemente MAPK8 /JNK quinasa y funciona como un regulador positivo de la señalización de JNK [33]. Además, esta quinasa puede fosforilar y activar directamente IkappaB quinasa y está implicado en la actividad transcripcional de NF-kappaB mediada por la familia Rho GTPasas. MAP3K11 se requiere para la proliferación celular estimulada por suero y por mitógeno y de citoquinas de activación de p38, ERK, y JNK1. MAP3K11 también juega un papel en la fosforilación y activación de BRAF estimulada por mitógenos, sin fosforilar directamente BRAF. Por lo tanto, las funciones MAP3K11 como un nodo en las vías de mitógeno y estrés de señalización. Hemos demostrado previamente que la activación de la vía de la MAP quinasa se correlaciona con la progresión del cáncer de próstata en una variedad de entornos y determinado que la señalización de estrés quinasa regula AR Ser 650 fosforilación [28], [34]. En este estudio, hemos confirmado que la señalización de estrés quinasa regula AR Ser 650 fosforilación; desmontables de MAP3K11 disminuyó estequiométricamente inducida por PMA AR Ser 650 fosforilación. La modulación de la fosforilación de Ser 650 puede ser regulando AR actividad transcripcional de los genes diana AR que se han alterado en MAP3K11 desmontables, incluyendo TMPRSS2, SGK, ORM1, DKK y FST. También se encontró que los resistente a la castración AR cáncer de próstata reguladas genes de la fase M Cdc20, CDK1, y UBE2C [27], se redujeron en respuesta a MAP3K11 caída, aunque la disminución en la transcripción de estos genes puede reflejar la inhibición del crecimiento provocada por MAP3K11 desmontables y no representan la actividad transcripcional AR alterados. Nuestra pantalla también identificó otras quinasas de estrés, incluyendo MAP3K7, MAP4K3, y MAPKAPK5 (datos no presentados), lo que subraya la naturaleza crítica de la señalización de estrés quinasa en la regulación del crecimiento de células de cáncer de próstata.
DGKD es una enzima que fosforila diacilglicerol (DAG) para producir el ácido fosfatídico (PA). DGK cataliza la fosforilación de DAG mediante la conversión a PA, intercambiando así uno segundo mensajero para otro y la activación de la proteína quinasa C (PKC) [35]. Hay evidencia creciente que sugiere que DGKD está implicado en la regulación de los niveles de DAG y PA en respuesta a varios factores de crecimiento y hormonas [35]. DGKD se informó de interactuar con RACK1, una proteína que habíamos demostrado previamente como una proteína que regula la interacción AR AR fosforilación y la actividad transcripcional [36], [37]. Por lo tanto, DGKD puede contribuir a la regulación AR a través RACK1. Sin embargo, desmontables de DGKD no tenía un efecto significativo sobre la actividad transcripcional de AR. La investigación anterior ha demostrado que en ausencia de DGKD, la señalización de EGFR se disminuye debido a que tanto la expresión y la actividad quinasa se inhiben [38]. Este efecto sobre EGFR es el resultado de una disminución de un deubiquitinase, USP-8, y por lo tanto aumentó la ubiquitinación y la degradación de la EGFR [38]. señalización del factor de crecimiento es un regulador conocido de crecimiento celular del cáncer de próstata [29]. Por tanto, es posible que el efecto de crecimiento que se corresponde con DGKD caída es el resultado de la señalización del receptor de tirosina quinasa alterada.
ICK es una quinasa serina /treonina que contiene un sitio de fosforilación doble que se encuentra en las proteínas quinasas mitógeno activar cuya actividad está regulada por la quinasa relacionada con el ciclo celular (CCRK) y fosfatasa humana proteína 5 (PP5) [39]. ICK se relaciona con la proteína asociada a las células de germen de quinasa macho (MAK). MAK es un co-regulador AR que se une directamente a la AR en experimentos de co-inmunoprecipitación y mejora la transcripción AR dependiente de una manera quinasa dependiente de [40]. La inhibición de la MAK, ya sea con ARNi o una forma-quinasa muertos disminuyó el crecimiento de células LNCaP. El efecto de MAK caída en el crecimiento es paralelo a nuestras observaciones con ICK aunque no hemos observado un efecto de ICK en la transcripción AR que sugiere un mecanismo alternativo de regulación del crecimiento. ICK puede fosforilar Guadaña, una proteína antiapoptótica y por tanto puede regular la supervivencia de las células [39], [41].
CIT es una proteína quinasa de especificidad dual que es un RHO putativo y el efector RAC, que puede jugar un papel en citocinesis [42]. CIT caída puede interrumpir la citocinesis y por lo tanto el crecimiento celular. GALK2 es una quinasa N-acetilgalactosamina (GalNAc), que también tiene actividad galactoquinasa en concentraciones de galactosa alta [43]. La regulación del metabolismo de hidratos de carbono es necesaria para el crecimiento celular y GalNAc es crítico para la glicosilación ligada a O y la regulación correspondiente de la señalización celular [44]; GALK2 caída puede interrumpir estos procesos celulares fundamentales. PSKH1 es una quinasa poco estudiada que puede ser un compartimento asociado a serina quinasa factor de empalme con un papel en snRNP no trata intranuclear factor de empalme y el procesamiento de pre-ARNm [45]. La ausencia de un efecto importante en las células LHS próstata no tumorigénicas y células de mama MCF10A puede ser debido a diferencias en la eficacia relativa de la caída y /o la necesidad de estas quinasas en estos procesos celulares fundamentales. Es plausible que el requisito de CIT, GALK2, y PSKH1 varía dependiendo del estado tumorigénico ya que los niveles de mRNA de estas quinasas aumenta a medida que avanza el cáncer de próstata (Figura S1). Se requieren más estudios para determinar el mecanismo de regulación del crecimiento de estas quinasas en el cáncer de próstata.
En este estudio se examinaron un grupo de shRNAs orientación del kinome humana contra las células de cáncer de próstata LNCaP cultivadas en presencia y ausencia de andrógenos para identificar las vías de señalización que regulan el crecimiento de células de cáncer de próstata. Se identificaron varios clones ARNhc contra quinasas que regulan tanto el crecimiento andrógeno-dependiente y resistente a la castración de células de cáncer de próstata. Este estudio demuestra aún más la aplicabilidad de lentiviral basado shRNA para la realización de pantallas fenotípicas para identificar dianas implicadas en una variedad de procesos biológicos, y establece MAP3K11, DGKD, ICK, CIT, GALK2, y PSKH1 como reguladores de crecimiento de células de cáncer de próstata.