Extracto
Introducción
Las células tumorales circulantes (CTC) podrían representar una fuente no invasivo de las células cancerosas utilizadas para el seguimiento longitudinal del estado de la mutación tumoral a lo largo del curso de la enfermedad. Los objetivos del presente estudio fueron investigar la detección de
KRAS
mutaciones en los CTC de pacientes con cáncer colorrectal metastásico (CCRm) y comparar su estado de mutación durante el tratamiento o la progresión de la enfermedad con el de los tumores primarios correspondientes.
Materiales y Métodos
identificación de la
KRAS
mutaciones en los codones 12 y 13 se llevó a cabo por ácido nucleico peptídico (PNA) a base de qPCR método más común de siete. Se determinó la sensibilidad del ensayo después del aislamiento de
KRAS
células de cáncer de mutantes de pinchos en sangre de donantes sanos ', utilizando el kit Cell CellSearch epitelial. detección coherente de
KRAS
mutaciones se logró en las muestras que contienen al menos 10 células tumorales /7,5 ml de sangre.
Resultados
La utilidad clínica del ensayo se evaluó en 48 Las muestras de sangre extraídas de 31 pacientes con cáncer colorrectal metastásico. Todos los pacientes tenían
PIK3C
A y
BRAF
tipo salvaje tumores primarios y 14
KRAS
tumores mutantes. se detectaron CTC en 65% de las muestras obtenidas a partir de 74% de los pacientes.
KRAS
análisis de mutaciones en las muestras enriquecidas-CTC mostró que el 45% y el 16,7% de los pacientes con tumores primarios de tipo mutante y salvaje, respectivamente, tenían mutaciones detectables en sus CTC. La evaluación de
KRAS
mutaciones en muestras seriadas de sangre revelaron que las CTC individuales del paciente exhibieron diferentes estatus mutacional de
KRAS
durante el tratamiento.
Conclusiones
El apoyo hallazgos actuales la justificación del uso de los CTC como una fuente dinámica de las células tumorales que, por la re-evaluación de su
KRAS
estado de mutación, podría predecir, para ser más exactos, la respuesta de los pacientes con CCRm a la terapia dirigida.
Visto: Kalikaki A, Politaki H, J Souglakos, Apostolaki S, E Papadimitraki, Georgoulia N, et al. (2014)
KRAS
genotípica cambios de células tumorales circulantes durante el tratamiento de pacientes con cáncer colorrectal metastásico. PLoS ONE 9 (8): e104902. doi: 10.1371 /journal.pone.0104902
Editor: Georgia Sotiropoulou, Universidad de Patras, Grecia
Recibido: Abril 29, 2014; Aceptado: July 16, 2014; Publicado: 19 Agosto 2014
Derechos de Autor © 2014 Kalikaki et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de investigación de la Asociación para la Investigación Biomédica de Creta (CABR), la Sociedad Helénica de Oncología Médica (Hesmo) y la Programa operativo "Competitividad & amp; Emprendimiento", Marco Estratégico Nacional de Referencia 2007-2013, Acción Nacional: "Cooperación", OncoSeed Diagnóstico: Biología de las células circulantes tumorales, metástasis a distancia & amp; El desarrollo de métodos de biopsia líquida; Secretaría General de Investigación y Tecnología de Grecia. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Profesor Adjunto John Souglakos actualmente sirve como un editor académico. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
La asociación entre el
KRAS
mutaciones y la respuesta a los inhibidores de EGFR ha sido establecida en múltiples estudios; en consecuencia,
KRAS
genotipificación se recomienda en todos los pacientes con cáncer colorrectal metastásico (CCRm) antes de cualquier terapia que utiliza el EGFR anticuerpos monoclonales, cetuximab o panitumumab [1]. Sin embargo, no todos los pacientes con
KRAS
tumores de tipo salvaje responden a las terapias dirigidas a EGFR y la mayoría de los pacientes que responden inicialmente experimentaron progresión de la enfermedad dentro de los 5 a 6 meses [2].
Teniendo en cuenta que la mayor parte de los estudios se han realizado utilizando tejido obtenido a partir del tumor primario mientras que los anticuerpos monoclonales de EGFR se han utilizado para tratar la enfermedad metastásica, es posible que la falta de eficacia y /o la aparición de resistencia posterior puede ser debido a la diversificación genética de las células metastásicas en comparación con sus homólogos de tumor primario o de variaciones dinámicas en el genotipo o fenotipo tumoral que emergen durante el tratamiento.
Varios estudios han mostrado el estado de mutación discordante entre tumores primarios y metástasis correspondiente en una proporción (5% -30% ) de los pacientes de CRC [3], [4], [5], [6]. Además, estudios recientes sugieren que la resistencia adquirida se logra en parte por la selección de los preexistentes menores sub-clones que albergan mutaciones que confieren resistencia a la terapia anti-EGFR [7], [8]. Debido biopsias invasivas de sitios metastásicos no son siempre factible y no se pueden realizar fácilmente en varias ocasiones, las células tumorales (CTC) que circula en la sangre periférica de pacientes con cáncer, que se cree que median la propagación hematógena de la enfermedad a sitios distantes, puede representar una fuente alternativa metástasis de las células tumorales.
está bien documentado que las CTC, tal como se define por el Sistema CellSearch aprobado por la FDA, podría servir como un marcador de la carga tumoral micrometástasis asociado con el pronóstico de los pacientes y puede predecir con exactitud la efectividad de la terapia en de mama metastásico, colorrectal, de próstata y cáncer de pulmón [9], [10], [11], [12]. Estudios previos en el cáncer colorrectal metastásico sugirieron que el número absoluto y las variaciones numéricas de CTC durante la progresión de la enfermedad o la terapia pueden proporcionar información valiosa para el resultado clínico y la eficacia de los tratamientos administrados [13] [14], [15], [16, ], [17], [18]. Sin embargo, no siempre CTC puede ser identificado en pacientes metastásicos, haciendo hincapié en la necesidad de desarrollar ensayos de detección de CTC específicas del tipo más sensibles y cáncer [19]. En este contexto, la identificación de mutaciones oncogénicas en CTC podría contribuir a la mejora de los métodos de detección existentes. Por otra parte, la genotipificación de los CTC podría mejorar el seguimiento de la respuesta a las terapias dirigidas mediante la identificación de los perfiles genómicos predictivos de recurrencia de la enfermedad antes de la progresión de la enfermedad clínica [20], [21], [22], [23], [24].
el objetivo de este estudio fue investigar la viabilidad de la detección de
KRAS
mutaciones en fracciones enriquecidas-CTC en pacientes con cáncer colorrectal metastásico. Otros objetivos fueron evaluar si
KRAS
estado de mutación de los CTC se correlaciona con la de los tumores primarios correspondientes y examinar la heterogeneidad genética de las CTC con respecto a
KRAS
estado de mutación durante el tratamiento.
Materiales y Métodos
los pacientes
Treinta y un pacientes con cáncer colorrectal metastásico se inscribieron en el estudio actual. En todos los pacientes, el diagnóstico fue confirmado por el examen histológico del tumor primario antes de la iniciación de cualquier terapia sistémica. Todos los pacientes excepto uno fueron tratados con combinada de primera línea de quimioterapia basada en 5-FU, con o sin un agente biológico (bevacizumab o panitumumab). Diecinueve (55%) pacientes recibieron una combinación basada en irinotecan y 11 (37%) de un régimen basado en oxaliplatino en el entorno de primera línea (un paciente no recibió ningún tratamiento). Además, 25 (83%) pacientes recibieron bevacizumab y dos (7%) panitumumab. En el momento del análisis, 19 pacientes presentaron progresión de la enfermedad al tratamiento de primera línea y 12 de ellos fueron tratados con un régimen de quimioterapia de segunda línea; cinco de estos 12 pacientes fueron tratados con panitumumab en combinación con la quimioterapia.
La sangre periférica se analizó la presencia de CTC antes de iniciar el tratamiento de primera línea en 12 pacientes, en el momento de la progresión en la primera línea tratamiento en 9 y en cualquier momento durante el tratamiento en 18 pacientes
.
a todos los pacientes, así como de 16 donantes de sangre sanos, que no tenían la enfermedad conocida y sin antecedentes de enfermedad maligna, se ensayaron para determinar la presencia de CTC utilizando el Kit de la célula epitelial CellSearch (Veridex LLC). La sangre periférica se obtuvo de pacientes con CCRm (7,5 ml) y donantes sanos (23 ml, para su uso en experimentos de adición) por la vena de la punción en los tubos CellSave específicos; con el fin de evitar la contaminación de las muestras con las células epiteliales se descartó los primeros 5 ml de la sangre. Todas las pruebas se llevaron a cabo dentro de las 72 horas desde la extracción de sangre de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células que eran CK (+) /CD45 (-). Y había un núcleo intracelular DAPI-positivos se caracterizaron como CTC por biólogos con experiencia (EP y SA)
Dado que este estudio fue un estudio piloto de viabilidad, no había hay una colección de estimación del tamaño y la muestra estadísticamente muestra se basa en la disponibilidad de los cartuchos CellSearch.
Ética declaración
Todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito para participar en el estudio, que ha sido aprobado por la ética y Científicas Comisiones del hospital general Universitario de Heraklion, Creta, Grecia; el manuscrito se preparó de acuerdo con los criterios OBSERVACIÓN [25]
Las líneas celulares
líneas de células cancerosas que alberguen
KRAS
mutaciones [LS174T, adenocarcinoma de colon humano, c.35G & gt.; A (p.G12D); HCT116, adenocarcinoma de colon humano, c.38G & gt; A (p.G13D); HUP-T3, el adenocarcinoma de páncreas humano, c.34G & gt; C (p.G12R); KYSE410, carcinoma esofágico de células escamosas humano, c.34G & gt; T (p.G12C); A549, adenocarcinoma alveolar humano, c.34G & gt; A (p.G12S); SW403, adenocarcinoma de colon humano, c.35G & gt; T (p.G12V) y RPMI8226, mieloma humano, c.35G & gt; C (p.G12A)] o de tipo salvaje para
KRAS gratis (HT-29, Human adenocarcinoma de colon)] se originó a partir de la American Type Culture Collection (ATCC, EE.UU.) y fueron amablemente proporcionados desde el Prof. A. Jung (Instituto de Patología de la Ludwig-Maximilian-Universität, Munich, Alemania). Todas las líneas celulares se cultivaron en matraces de acuerdo con las recomendaciones del proveedor, antes de la cosecha posterior usando 0,25% de tripsina y 5 mmol /L EDTA (GIBCO-BRL). La autenticación se realiza mediante la determinación de la
KRAS
estado mutacional de cada línea celular mediante secuenciación de Sanger. Todas las líneas celulares excepto SW403 eran heterocigotos para
KRAS mutaciones
y revelaron el genotipo esperado.
aislamiento de ADN a partir de fracciones y tejidos
Después de conteo de CTC, las células capturadas enriquecidos-CTC fueron transferidos desde la cámara a un tubo de 2 ml y se sometieron a una digestión de proteinasa K a 65 ° C durante 2-5 h; aislamiento de ADN se realizó utilizando el ADN & amp completa Epicentre MasterPure; Kit de purificación de ARN (Epicentro biotecnologías, Madison, WI, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y el ADN extraído se cuantificó utilizando un NanoDrop ND1000 (NanoDrop Technologies, EE.UU.) y se almacenaron a -20 ° C hasta su utilización. El rendimiento promedio de ADN era ~ 1,5 g; sin embargo, la cuantificación de ADN por espectroscopía UV no es precisa debido a la detección de ADN de cadena sencilla, los nucleótidos libres o ARN en la muestra.
embebido en parafina fijado con formalina (FFPE) tumor de tejido primario se evaluó histológicamente por se realizó un patólogo (MT) y micro-disección para aumentar el porcentaje de células tumorales. Tres 5 micras secciones de tejido se deparaffinised por xileno y etanol lavados y se sometieron a una digestión de proteinasa K durante la noche a 56 ° C de ADN entonces se purificó utilizando un Kit QIAamp DNA Micro (Qiagen, Alemania).
análisis de la mutación en primaria tumores
en los pacientes que consienten, se evaluaron los tumores primarios para las mutaciones en
KRAS
,
PIK3CA
y
BRAF fotos: por tanto secuenciación de Sanger y metodologías con alta sensibilidad como se describe anteriormente [26].
KRAS
ensayo de mutación
Un ensayo de mutación que combina el ácido nucleico peptídico (PNA) mediada por PCR con abrazadera de discriminación alélica TaqMan-MGB los ensayos se han desarrollado previamente para detectar los siete más común
KRAS mutaciones
[6] .Las condiciones térmicas de PCR mediada PNA de sujeción para cada uno de los siete
KRAS: plantillas mutantes se optimizaron aún más mediante el uso de un PNA marcado con un colorante fluorescente como tanto de sonda de sensor y la abrazadera de PCR de acuerdo con Luo JD et al [27]. El mayor selectividad, es decir, alto valor de Ct en la sonda de tipo salvaje y bajo valor Ct en la sonda mutante se logró a los 62 ° C con 200 nM PNA para el c.35G & gt; A (p.G12D), c.38G & gt; A (p.G13D) y c.35G & gt; T (p.G12V) y 150 nM para el PNA c.34G & gt; C (p.G12R), c.34G & gt; T (p.G12C), c.34G & gt; a ( p.G12S) y c.35G & gt; C (p.G12A)
KRAS: plantillas mutantes, respectivamente. Las reacciones se realizaron en Applied Biosystems 7900HT sistema de PCR en tiempo real en placas de 384 pocillos en un volumen total de 5 l, que contenía 2 l (aproximadamente 1/8 de ADN extraído total a partir de muestras enriquecidas-CTC y 20 ng de ADN extraído de FFPEs ) DNA, 2,5 l de 2X mezcla maestra TaqMan de genotipificación (Applied Biosystems, EE.UU.), 0,25 l de mezcla de ensayo de genotipificación y 150 o 200 nm PNA; en paralelo, se realizó una reacción no PNA-abrazadera. Las condiciones de PCR fueron 95 ° C durante 10 min, seguido por dos etapas de ciclo: 50 ciclos de 92 ° C durante 15 s, y 62 ° C durante 90 s. Todas las muestras se realizaron al menos por duplicado. Los valores de Ct se obtuvieron de software en tiempo real PCR recogida de datos del instrumento utilizando 0,2 umbral manual. Un control positivo para cada
mutación KRAS
(muestras modelo que comprendían mezclas de líneas de células mutadas con relaciones de tipo salvaje /1/100 y 1/500) y un control negativo (
KRAS tipo salvaje
línea celular) en la entrada total de 50 ng fueron incluidos en cada corrida
El Ct = Ct
sonda mut (+ ANP) -. Ct
sonda en peso (-PNA) valor se calcula para cada muestra; Ct
sonda mut (+ ANP) y ct
sonda en peso (-PNA) denota el Ct (ciclo umbral Ct, que se denomina como el ciclo en el cual se detecta una señal de fluorescencia por encima del fondo) valores para el mutante y sondas de WT de las reacciones con y sin PNA, respectivamente. El Ct
sonda mut (+ ANP) refleja la cantidad de
KRAS
ADN mutante dentro de la muestra, mientras que el Ct
sonda en peso (-PNA) refleja la cantidad de plantilla amplificable derivado de los diferentes números de contaminación de leucocitos en CTC fracción [28].
ensayo validez
validez del resultado de ensayo para cada muestra se determina por el valor Ct
sonda en peso (-PNA) que debe estar 24≤Ct
sonda en peso (-PNA) & lt; 32; Si el Ct
sonda en peso (-PNA) en una muestra es mayor que 32, el resultado del ensayo no es fiable debido a una baja cantidad de ADN o amplificación de la diana fallado. Eficiente de sujeción PCR ANP fue confirmada por un valor & gt Ct
wtprobe (+ ANP); 45. El
KRAS
estado de la mutación se determinó mediante la comparación de los valores Ct se ha definido previamente para los valores de corte? Ct para cada uno de los siete más común
KRAS
mutaciones. Los valores de corte para cada ensayo de mutación se han determinado a partir del análisis de muestras de sangre de 16 donantes sanos 'CellSearch siguiente análisis. Como valor de corte se definió el Ct correspondiente a la máxima especificidad; es decir, ninguna mutación detectada en el 100% (16/16) de donantes sanos (Tabla 1, Figura 1).
Gráficos mostró los valores Ct (
y
eje y) frente al CTC muestras enriquecidas (
x
ejes) de los pacientes con CCRm (n = 31), individuos sanos (n = 16) y las muestras de modelo se dispararon con 100 y 10 células de líneas celulares (LS174T, SW403, HCT116 y KYSE410) que alberga punto de acceso
KRAS mutaciones
c.35G & gt; A; p.G12D (A), c.35G & gt; T; p.G12V (B), c.38G & gt; A; p.G13D (C) y c.34G & gt; T; p.G12C (D). umbral de corte es representado por punto-línea; los especimenes con Ct por debajo del umbral se consideran mutante; Ct = Ct
sonda mut (+ ANP) - Ct
sonda en peso (-PNA); NVD, ninguna variante detectada.
especificidad y sensibilidad analítica
La especificidad analítica de los siete ensayos fue evaluada de forma individual utilizando ADN genómico (ADNg) aislado de
KRAS
línea de células de tipo salvaje (HT29) o positivo para la específica
KRAS
mutaciones; el límite inferior de detección para todos los ensayos fue de 0,015 ng. Para evaluar la sensibilidad de análisis, cada uno de los siete
KRAS
línea celular mutante gDNA se diluyó en serie en un intervalo de tres concentraciones diferentes (100 ng, 50 ng y 20 ng) de tipo salvaje gDNA proporcionada por el HT- 29 línea celular para dar proporciones de mutación /de tipo salvaje de 100%, 50%, 10%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1% y 0%. Todos los ensayos tienen una sensibilidad de 0,1%, manteniendo constante la entrada total a 20 ng, excepto los ensayos para la detección de p.G13D y p.G12V que tiene una sensibilidad de 0,5% (Tabla 1).
la reactividad cruzada
pruebas de reactividad cruzada se realizaron para todos los ensayos de mutación que potencialmente identifican plantilla de otro ensayo debido a la imperfecta apareamiento de bases y la lectura a través. Los resultados indican que el ensayo G12D muestra significativa de reactividad cruzada con las plantillas G12V y mutantes G12A, el ensayo G13D con la plantilla mutante G12S, el ensayo G12R los G12C y G12S plantillas mutantes y el ensayo G12C con la plantilla mutante G12S (Tabla 2).
intra e inter-ensayo de precisión
la precisión intra-ensayo se ha evaluado mediante el análisis de muestras modelo realizaron por triplicado en el mismo experimento usando una dilución en serie (100%, 50%, 10%, 2%, 1%, 0,5% y 0,1%) de
KRAS
ADN mutantes, como se mencionó anteriormente, en 20 ng de fondo
KRAS
tipo salvaje de ADN. Los coeficientes de variación? Ct para el
KRAS
ADN mutado oscilaron entre el 0,3% y el 2,5%. reproducibilidad entre ensayos se ha medido de manera similar mediante el cálculo de los coeficientes? Ct de variación de las muestras por triplicado ejecutar en diferentes días usando las mismas diluciones seriadas de ADN mutado. Los coeficientes de variación? Ct para el
KRAS
ADN mutado oscilaron entre el 0,4% y el 2,5%. Por otra parte, en las muestras de modelo con una relación de tipo mutado /salvaje 0,5%, el porcentaje total de fallos ensayo de mutación fue del 0%.
Resultados
Mutación optimización ensayo
La sensibilidad de nuestro enfoque experimental para determinar con precisión la
KRAS
estado de la mutación en un número limitado de CTC presentes entre las células sanguíneas normales en la sangre circulante fue validado por la adición
KRAS
células de cáncer mutante en la sangre de donantes sanos . Aproximadamente 100 y 10 células tumorales se enriquecieron en 7,5 ml de sangre en tubos de CellSave y se analizaron por CellSearch el plazo de 2 días, en al menos 3 experimentos independientes. La recuperación promedio por ciento para los 100 y 10 células de púas [LS174T, c.35G & gt; A (p.G12D), n = 5 experimentos; HCT116, c.38G & gt; A (p.G13D), n = 4 experimentos; SW403, c.35G & gt; T (p.G12V), n = 4 experimentos y KYSE410, c.34G & gt; T (p.G12C), n = 3 experimentos] fue del 95% (rango, 70% -100%) y 92,5 % (rango, 25% -130%), respectivamente. La amplia gama de recuperación se puede atribuir a que el error asociado con bajos números de pico-a de células. Después de CTC enumeración por el kit de la célula epitelial CellSearch, el ADN se extrajo de las células capturadas y las muestras se analizaron para todos los siete
KRAS
mutaciones. Por este ensayo,
KRAS
mutaciones pudieron ser identificados consistentemente a partir de 10 células tumorales con púas.
Caracterización y evaluación de los CTC
demográficos del paciente, se enumeran las características clínicas y patológicas de los pacientes en la Tabla 3
KRAS
se identificaron mutaciones en los tumores primarios del 45% de los pacientes; ocho tumor primario (57%) de los pacientes albergaba el c.35G & gt; A (p.G12D) mutación, tres (21%) la c.35G & gt; T (p.G12V), uno (7%) del c.38G & gt; A (p.G13D), uno (7%) del c.34G & gt; T (p.G12C) y uno (7%) del c.35G & gt; C (p.G12A). Todos los tumores fueron
PIK3CA
y
BRAF
tipo salvaje. La mediana de tiempo entre la resección quirúrgica del tumor primario y el análisis de los CTC fue de 6 meses (rango 1 a 134).
Se obtuvieron un total de 48 muestras de sangre de 31 pacientes para CTC enumeración utilizando CellSearch ( Tabla 4). Doce (39%) de los pacientes habían recibido quimioterapia ingenuo en el momento de la primera extracción de sangre. Doce (71%) y 11 (79%) pacientes con
KRAS
tipo salvaje y mutantes tumores primarios, respectivamente, tenían CTC detectables; una mediana de 9 (intervalo de 2 a 660) y 7 (rango de 1 a 865) se detectaron CTC en pacientes con
KRAS
tipo salvaje y mutantes tumores primarios, respectivamente. En total, 1 o más CTC podría ser detectada en 31 muestras (65%) de sangre obtenidas de 23 (74%) pacientes (Tabla 4).
KRAS
análisis de mutaciones en los codones 12 y 13 se realizó en todas las muestras con CTC detectables (Figura 1).
KRAS
mutaciones en los pacientes CTC-enriquecido muestras
KRAS
mutaciones pudieron ser identificados en el CTC de cada cinco (45%) pacientes cuyos tumores primarios habían mutado
KRAS
. En particular, antes de la iniciación de 1
línea de quimioterapia st sólo dos de los pacientes no tratados previamente de seis quimioterapia (# 1 y#5) albergaron CTC con mutaciones detectables, mientras que en el momento de la progresión de la enfermedad, las mutaciones podrían ser identificados en una (# 8) de los dos pacientes; También se detectaron mutaciones durante el seguimiento de 1
ª línea de tratamiento en dos pacientes (# 6 y#10) (Tabla 4).
también podría ser identificado mutaciones KRAS
en los CTC de dos (17%) pacientes (# 15 y#16) cuyos tumores primarios no tenía mutaciones detectables; en ambos pacientes, se recogieron las CTC durante el seguimiento de la quimioterapia de 1ª línea (Tabla 4).
KRAS
estado mutacional de los CTC en las muestras de sangre en serie
Cuatro muestras de sangre en serie de los pacientes#1 tenía CTC detectables;
KRAS
mutaciones fueron documentadas, incluso después de la administración del primer ciclo de quimioterapia a pesar de la importante disminución del número de CTC; la continuación del tratamiento (después del ciclo de rd 3
) resultó en mayor disminución del número CTC e indetectable
KRAS
mutaciones en muestras enriquecidas-CTC mientras que la evaluación de la respuesta al tratamiento reveló una respuesta parcial; después de la 8
º ciclo de quimioterapia, se incrementó el número de CTC y
KRAS
mutaciones se pudo detectar otra vez mientras el paciente todavía permanecía en respuesta parcial (Tabla 4).
En el paciente#15 que tenía un
KRAS
tumor primario tipo salvaje, sin
KRAS
mutaciones puede ser detectada en las muestras enriquecidas-CTC cuando el paciente se encontraba en respuesta parcial y bajo tratamiento con panitumumab mantenimiento; Sin embargo, después de 4 meses de tratamiento, en el momento de la progresión de la enfermedad, según lo documentado por el empeoramiento radiológico de las lesiones hepáticas y el aspecto clínico de la ascitis, se incrementó el número de CTC y
KRAS
mutaciones podría ser identificado en los CTC fracción celular enriquecida.
KRAS
mutaciones eran más detectable después de la 2
º ciclo de quimioterapia de rescate a pesar de la disminución del número de CTC (Tabla 4).
Discusión
Las mutaciones en
KRAS
resultado en la activación constitutiva de la vía RAS /MAPK y predecir la falta de respuesta a los anticuerpos monoclonales anti-EGFR. Hasta la fecha, las decisiones terapéuticas se basan principalmente en
KRAS
estado de mutación del tumor primario; Sin embargo, los cambios genéticos que ocurren durante la progresión de la enfermedad y la resistencia adquirida al tratamiento pueden alterar la biología del tumor. Por lo tanto, una cuestión importante se refiere a la posibilidad de utilizar CTC como una alternativa no invasiva de una nueva biopsia que podría ser más representativo de la situación biológica actual de las células tumorales y puede ser utilizado como un marcador biológico de cualquiera de sensibilidad o resistencia adquirida a EGFR dirigidos la terapia.
los resultados del presente estudio indican claramente la viabilidad para determinar el
KRAS
estado de la mutación en muestras de sangre enriquecida con CTC en el contexto de la práctica clínica habitual, a raíz de las CTC enumeración por el CellSearch sistema. Los datos presentados apoyan firmemente la hipótesis de que CTC puede representar una fuente en tiempo real de la biopsia de líquido que se puede permitir la determinación del genotipo dinámica de las células tumorales durante el tratamiento. Los datos también indican que el ensayo establecido proporciona una sensibilidad de detección de aproximadamente 10 células mutadas /7,5 ml de sangre, sin la necesidad de la amplificación de todo el genoma, y ofrece la posibilidad de una supervisión de serie no invasivo, rápido y de bajo coste de la
KRAS
estado de la mutación en los codones 12 y 13 durante el curso del tratamiento.
KRAS
mutaciones fueron identificadas incluso en muestras clínicas que contienen tan bajo como 3 CTC /7,5 ml de sangre; no podemos excluir que esto puede ser debido a la presencia de
KRAS
mutaciones en fragmentos de CTC que no son considerados como los CTC reales durante la documentación y el recuento de CTC por el sistema CellSearch y /o ADN libre de células (cfDNA) adsorbido a la superficie de los leucocitos contaminantes [29]. Es de destacar que estudios previos han demostrado que tanto los CTC y fragmentos de CTC se correlacionan con los resultados de los pacientes en el cáncer de próstata [30].
A pesar del tamaño pequeño de la muestra y la población de pacientes heterogénea analizado, el presente estudio proporciona evidencia de que
KRAS
estado de mutación de los CTC pueden diferir sustancialmente de la del tumor primario correspondiente. CTC sin detectable
KRAS
mutaciones se obtuvieron de seis de los 11 pacientes con tumores primarios mutantes; esto podría explicarse por la heterogeneidad intra-tumoral y /o el enriquecimiento de clones preexistentes menores con el aumento de potencial metastásico durante la progresión de la enfermedad. Sin embargo, en tres de los seis casos discordantes, la resección y el examen del tumor primario para
KRAS
mutaciones se realizó sólo un mes antes del análisis de los CTC (datos no mostrados), indicando posiblemente un modelo de evolución paralela del tumor primario y la metástasis. Estudios anteriores han demostrado que el estado de la mutación de los CTC no refleja siempre la de la metástasis correspondiente [31]; Por lo tanto, la comparación de la
KRAS
estado de mutación del tumor primario, metástasis correspondientes y las muestras de sangre enriquecida-CTC serie podría arrojar luz sobre el origen de las metástasis.
A pesar de las condiciones y la tasa de conversión genotipo no se comprenden bien, el estudio actual sugiere que pueden surgir CTC de diferente estado de mutación durante el tratamiento en el mismo paciente (pacientes#1 y#15). De hecho, podría ser la hipótesis de que el tratamiento, con o sin agentes dirigidos, mediante la eliminación de algunos clones de quimioterapia sensible puede permitir la aparición de otros clones de baja frecuencia que difieren de las células tumorales predominantes con respecto a la estado de la mutación. Esta hipótesis se sugiere fuertemente por la presencia de
KRAS
mutaciones en los CTC de dos de los 12 pacientes con
KRAS
tumores primarios de tipo salvaje que fueron tratados con regímenes que incorpora panitumumab o bevacizumab (pacientes#15 y#16). Sin embargo, el fracaso de la detección de mutaciones en las muestras enriquecidas-CTC también podría atribuirse a la baja frecuencia de CTC que albergan mutaciones, así como a las limitaciones metodológicas; la FDA aprobó CellSearch epitelial Cell Kit, que se informó a ser inferiores a CellSearch epitelial kit de teléfono del perfil en términos de caracterización molecular CTC '[32]. Sin embargo, se ha demostrado que las CTC capturadas con el Kit de la célula epitelial CellSearch pueden ser analizadas con éxito por metodologías de secuenciación de nueva generación [33]. Además, una subpoblación de CTC no se pudo detectar por CellSearch debido a la insuficiente expresión de EpCAM y /o citoqueratinas; sin embargo, un estudio reciente demostró que en el CPCP CTC, que expresan EpCAM, capturado con el sistema CellSearch puede formar tumores en ratones inmunodeprimidos [34].
Los estudios anteriores han utilizado diferentes metodologías con el fin de aislar y caracterizar molecularmente los CTC. En el cáncer de mama y de próstata metastásico, el perfil genómico de CTC aisladas por enriquecimiento inmunomagnética y fluorescencia clasificación de células activadas reveló nuevos cambios genómicos que ocurren durante la progresión de la enfermedad [35], [36]. El uso de un dispositivo de captura de CTC microfluidos, el
TMPRSS2-ERG sobre Fusion, el ITC sensibilizar a
EGFR
mutaciones activantes y el
EGFR T790M
TKI-mutación de resistencia fueron detectados en los CTC de pacientes con cáncer de próstata y la enfermedad metastásica del cáncer de pulmón, respectivamente, mientras que las mutaciones de la
AR
,
KRAS
y
BRAF
genes han sido identificados en muestras enriquecidas-CTC aisladas de la próstata y pacientes con CCRm, respectivamente, utilizando el kit de CellSearch Perfil [24], [37], [38], [39]. El genotipado de los CTC individuales aisladas por el CellSearch o el sistema IsoFlux en pacientes con cáncer colorrectal metastásico confirmó un paciente heterogeneidad intra e inter basado en el
PIK3CA
y
KRAS
estado de mutación [22], [ ,,,0],31]; Por otra parte, diferentes alteraciones genéticas en los CTC individuales ya han sido reportados en pacientes con cáncer de mama y el cáncer de esófago [23], [40].
informes previos han sugerido una relación entre la presencia de CTC y el ADN libre de células (cfDNA ) en el suero o plasma de pacientes con cáncer [41].
han propuesto KRAS
mutaciones detectadas en el suero de pacientes con cáncer colorrectal metastásico para monitorizar la respuesta al tratamiento antes de la aparición clínica de progresión de la enfermedad, mientras que en pacientes con CPNM se ha informado de una mayor sensibilidad para la detección de mutaciones de EGFR en cfDNA que en CTC [7], [8], [42]. Sin embargo, el origen de cfDNA no se entiende bien, ya que podría ser derivado de las células tumorales apoptóticas, leucocitos apoptóticos producidos por la terapia citotóxica, así como por exosomas o CTC liberadas de las células tumorales en el torrente sanguíneo. Aunque el aislamiento y análisis de cfDNA es más simple y más reproducible que el aislamiento y la genotipificación de los CTC, la caracterización molecular de los CTC, además de ser útil para el fracaso del tratamiento de seguimiento o recaída de la enfermedad también puede proporcionar información para guiar la selección del tratamiento óptimo y /o el desarrollo de la novela terapias.
en conclusión, los datos presentados describen una metodología sencilla basada en el uso diario de la plataforma CellSearch para la identificación de
KRAS
estado mutacional de los CTC de pacientes con cáncer colorrectal metastásico y proporcionan una razón para considerar la re-evaluación de los
KRAS
estado mutacional de CTC con el fin de predecir mejor la respuesta a la terapia anti-EGFR.