Extracto
Evidencias recientes sugieren que algunos tumores sólidos, incluyendo cáncer de ovario, contienen poblaciones distintas de células madre que son responsables de la iniciación del tumor, el crecimiento, la quimio-resistencia, y la recurrencia. La vía de Hipona ha atraído considerable atención y algunos investigadores se han centrado en las funciones de YAP para el mantenimiento de la diferenciación celular y la troncalidad. En este estudio, hemos aislado con éxito las células de cáncer de ovario iniciar (OCICs) y demostramos YAP promueve la auto-renovación de células iniciado el cáncer de ovario (OCIC) a través de su corriente abajo Tead co-activador. Se requieren las familias de YAP y Tead para el mantenimiento de la expresión de genes específicos que pueden estar implicados en la troncalidad y quimio-resistencia OCICs '. Tomados en conjunto, nuestros datos indican que la primera YAP /Tead co-activador regulado cáncer de iniciada la pluripotencia de células de ovario y quimio-resistencia. Se propone un nuevo mecanismo en la resistencia a fármacos en cáncer de células madre que la vía de señalización del Hipopótamo-YAP podría servir como dianas terapéuticas para el tratamiento del cáncer de ovario en clínica
Visto:. Xia Y, Zhang YL, Yu C, T Chang , Fan HY (2014) YAP /Tead co-activador regulado Pluripotencialidad y quimiorresistencia en células de cáncer ovárico Iniciado. PLoS ONE 9 (11): e109575. doi: 10.1371 /journal.pone.0109575
Editor: Hong Wanjin, Instituto de Biología Molecular y Celular, Biopolis, Estados Unidos de América
Recibido: 21 de junio de 2014; Aceptado: 1 de septiembre de 2014; Publicado: 4 de noviembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Xia et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81172473, 31371449), el Programa Nacional de Investigación Básica de China (2011CB944504, 2012CB944403 ), y Basic Scientific Financiación de la Investigación de la Universidad de Zhejiang (2011QN81001). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario es el más mortal de los cánceres ginecológicos, debido principalmente a la falta de detección temprana, lo que resulta en la mayoría de los pacientes ser diagnosticados en una etapa avanzada de la enfermedad [1], [2]. Los mecanismos que subyacen a la resistencia a fármacos contra el cáncer y la recurrencia siguen siendo inciertas. La evidencia reciente sugiere que algunos tumores sólidos, incluyendo cáncer de ovario, contienen poblaciones distintas de células madre que son responsables de la iniciación del tumor, el crecimiento, la quimio-resistencia, y la recurrencia [3] - [6]. Hay algunos pensaban que la resistencia a la quimioterapia por cáncer de ovario se debe principalmente a la existencia de pequeñas poblaciones de células madre del cáncer (CSC).
Algunos estudios informaron que la CSC, organizados, estructuras esféricas autónomas independientes de anclaje [7] . Estructuras similares se observaron en las células de ascitis de pacientes con cáncer de ovario, que incluía una pequeña subpoblación de células tumorales de propagación que eran capaces de organizarse en esferoides. Se sabe que los altos niveles de expresión de marcadores de células madre, tales como OCT-4, SOX-2, Nanog, y Notch-1, se pueden detectar en los CSC [8]. Algunos marcadores de superficie celular también son altamente expresado por células madre cancerosas, incluyendo CD44, CD117, CD133 y [9], [10]. Es bien aceptado que las células cancerosas con alta expresión de CD44 y CD117 se vuelven altamente tumorigénicas y pueden restablecer su jerarquía original del tumor [11].
Un grupo de células madre que incluye células madre del cáncer también está estrechamente regulada por las vías de señalización de el microambiente del nicho de células madre. Entre ellas, vía Hippo ha atraído considerable atención, y algunos investigadores se han centrado en las funciones de YAP para mantener la troncalidad y la diferenciación celular [12], [13]. YAP expresión ectópica impide la diferenciación de células ES
in vitro
y mantiene el fenotipo de células madre [14], [15]. Sin embargo, hasta la fecha, los miembros de la familia Tead, que están aguas abajo de YAP co-activadores, no se han investigado a fondo en las células madre del cáncer.
Estudios recientes demostraron que las interacciones entre varias vías, incluyendo el erizo [16], Wnt [17] - [19], MAPK [20], PI3K [21], y las vías Hippo [22] - [24], han participado en la pluripotencia de células madre y la carcinogénesis regulación. Desmontables de los componentes centrales de la vía afectada Hippo la homeostasis del tejido en el gusano plano
Macrostomum Lignano
y causó la hiper-proliferación de las células madre [12]. LATS2, un supresor de tumores quinasa de la ruta de Hipona, post-transcripcionalmente reprime la reprogramación de células humanas [25]. YAP es funcionalmente importante para el tumor efectos supresores sobre LKB1, un supresor de cáncer de aguas arriba en la vía MAPK [26].
En este estudio, hemos aislado con éxito esferas de células madre a partir de xenoinjertos de tumores de ratón que se derivaron de ovario humano Células cancerígenas. Estas células de formación de esferas fueron altamente tumorigénico y en serie podrían propagarse con sus fenotipos tumorales originales. Con base en esta mejorada, tumorigenicidad reproducible, designamos estas células de formación de esferas células de cáncer de ovario (iniciar OCICs), de acuerdo con la terminología previamente aceptada. Esta subpoblación de células cancerosas también había mejorado la resistencia OCICs 'stemness y drogas a través de YAP /Tead la regulación de la expresión de genes específicos. Estos resultados apoyan las observaciones recientes, incluyendo el nuestro, que YAP-Teads determinaron los niveles de ovario de malignidad del cáncer y proporcionaron conocimientos mecánicos adicionales con respecto a las funciones de YAP y Teads en el cáncer de ovario.
Materiales y Métodos
el cáncer de ovario iniciar celda de aislamiento y (OCIC) cultura y
Para obtener células OCICs, se inyectan por vía subcutánea de la línea A2780 de células de cáncer de ovario en ratones desnudos (2 × 10
6 células por ratón). Después de un diámetro del tumor alcanzó alrededor de 1,5 cm (por lo general a las cuatro semanas después de la inyección), hemos eliminado el tejido tumoral, se corta en trozos pequeños y se digirió con colagenasa para preparar suspensiones de células individuales. A continuación, las células individuales recogidas se cultivaron en suero libre de DMEM-F12 (Invitrogen) suplementado con 5 g /ml de insulina (Sigma), 20 ng /ml de factor de crecimiento epidérmico recombinante humano (EGF; Invitrogen), 10 ng /ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico (b-FGF; Invitrogen), y 0,4% de albúmina de suero bovino (BSA; Sigma) en placas de fijación ultra bajo (Corning). OCICs y las células control estaban todos separados de otras células por medio de centrifugación en gradiente de densidad continua. Las células de control también se obtuvieron mediante la inyección de las células A2780 en ratones desnudos y los métodos de separación fueron similares a los utilizados para OCICs. Se cultivaron en placas de fijación ultra bajo (Corning) y el medio fue similar con OCICs la excepción de que el medio de cultivo incluye 10% de suero bovino fetal (FBS). Todos los medios de comunicación incluyen penicilina (10 unidades /ml) y estreptomicina (10 ng /ml) y las células se cultivaron en un incubador humidificado a 37 ° C con 5% de CO
2. El medio se cambió cada 3 días.
ratón desnudo modelo de xenoinjerto
Los ratones fueron tratados de acuerdo con la Guía del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, aprobado por el comité de ética de la Universidad de Zhejiang. Los animales fueron alojados en una habitación con temperatura controlada, con ciclos de luz-oscuridad adecuados, alimentados con una dieta regular, y se mantuvieron bajo el cuidado de la Unidad de Animales de Laboratorio de la Universidad de Zhejiang, China. Los ratones desnudos trasplantados de células de cáncer de ovario se inyectaron 2 × 10
6 celdas y examinaron diariamente durante unas tres semanas. Después de que el diámetro del tumor alcanzó 1,5 cm, los ratones se sometieron a eutanasia usando CO
2 método de inhalación antes de ser sacrificado. Para evaluar la capacidad de OCIC tumorigénico
in vivo
, se contaron esferoides, se resuspendieron en 100 l de PBS, y luego se inyectaron por vía subcutánea en los flancos izquierdos de 4 semanas de edad, los ratones hembra desnudos. Las concentraciones de células utilizadas variaron de 10
4-10
5 en OCIC y grupos de control y los ratones se dividieron en dos grupos y cuatro ratones en cada subgrupo. A partir de una semana después de la inyección, se observaron ratones injertados diario para masas tumorales y volumen. Un ratón fue sacrificado humanitariamente cuando un diámetro del tumor alcanzó 1,5 cm. tumores de xenoinjertos se diseccionaron, se fijaron en paraformaldehído al 4%, embebidos en parafina, y se seccionaron con un microtomo de rotación Leica (5 m de espesor). Las secciones se utilizan para H & amp;. E tinción, inmunohistoquímica, y evaluaciones histológicas
Inmunofluorescencia tinción
esferoides OCIC se recogieron y se colocaron en portaobjetos de vidrio, se fijaron en paraformaldehído (4 ° C, 30 min) , se permeabilizaron con PBS que contenía 0,3% de Triton X-100 (PBST), y se incubaron con tampón de bloqueo (PBST que contiene 5% de albúmina de suero bovino). Los esferoides se sondaron secuencialmente con los anticuerpos primarios y Alexa Fluor 594- o anticuerpos secundarios conjugados 488 (Molecular Probes). Las láminas fueron montados usando VectaShield con 4 ', 6-diamino-2-fenilindol (DAPI, Vector Laboratories). Las imágenes digitales se adquirieron usando un microscopio de epifluorescencia (Nikon Eclipse 80i) con 4-100X objetivos.
Inmunohistoquímica
xenoinjertos de tumor se fijaron durante la noche en 10% PBS tamponado 4% de paraformaldehído y, a continuación embebido en parafina. Las secciones se cortaron con un microtomo Leica RM2235 a 5 m de espesor y se tiñeron con los anticuerpos primarios indicados para inmunohistoquímica utilizando un kit Vector ABC (Vector Laboratories). Brevemente, las secciones se deparaffinized, rehidratada, y se incubaron en 0,3% H
2O
2. Después de la recuperación de antígenos usando citrato de sodio 10 mM (pH 6,0), las secciones se incubaron en suero de cabra normal. Estas muestras se sondearon con los anticuerpos primarios. Después de lavar con PBS que contenía 0,05% de Tween-20 (PBS-T), las muestras se incubaron con un anticuerpo secundario y se lavaron de nuevo con PBS-T antes de la incubación con solución de ABC. El color se desarrolló con sustrato de diaminobencidina (DAB) (kit de sustrato DAB, Vector Laboratories). Las secciones se lavaron, a contratinción, se deshidrataron y se montaron con medio de montaje Vectamount permanente (Vector Laboratories). Se observaron las secciones bajo un microscopio Nikon Eclipse 80i (Nikon Corporation). El control negativo se sustituyó el anticuerpo primario con PBS incubación.
Lentiviral del shRNA infección y formación clon de ensayo
Lentivirus que codifica para
Yap
y
Tead1 /3 /4
ARN corto horquilla (shRNAs) u oligonucleótidos no objetivo como un control eran de GenePharma (Shanghai, china). Breve RNAs de interferencia para
Yap
y
Tead1 /3/4
seleccionado de diferentes secuencias diana se insertaron en vectores /GFP + Puro LV-3. Las células en las esferas fueron infectados con
Yap
y /o
Tead1 /3/4
shRNA lentivirus durante 48 h.
Yap
shRNA específicos de fueron: 5'-CCCAGTTAAATGTTCACCAAT-3 '(shYAP#1) y 5'-GCCACCAAGCTAGATAAAGAA-3' (shYAP#2). Dos shRNAs se utilizan para orientar
Tead1
,
Tead3
, y
Tead4
juntos: 5'-ATGATCAACTTCATCCACAAG-3 'y 5'-GATCAACTTCATCCACAAGCT-3'. eficiencia de interferencia se verificó por RT-PCR y Western Blot. Lentivirus infectado OCICs se sembraron por triplicado en placas de 12 pocillos (1.000 células /pocillo) durante 14 días. El medio se reemplazó cada 48 horas y las colonias visibles se contaron por microscopía de luz.
evaluaciones de diferenciación esferoide
esferas de células se cultivaron en condiciones de diferenciación estándar (DMEM /F12 suplementado con 10% FBS) y en placas Ultra Low fijación (Corning). Después de 14 días en cultivo, morfología celular se evaluó mediante un microscopio invertido Zeiss Axiovert 40 con el software de Axio-Vision. marcadores de superficie celular (CD44 y CD117) se detectaron mediante tinción de inmunofluorescencia. Una diferenciación marcador de epitelio, citoqueratina-7 (CK-7), y cáncer de ovario antígeno-125 (CA125) se utilizaron para la tinción de inmunofluorescencia, seguido de incubación con una cabra marcado con FITC anti-ratón o anti-IgG de conejo. Los núcleos se counterstained con 4, 6-diamino-2-fenilindol (DAPI; Santa Cruz).
Quimioterapia ensayos de sensibilidad agente
esferoides celulares fueron disociadas y se sembraron a 4.000 células /pocillo en 96- así placa de ultra bajo Adjunto (Corning) y se cultivaron con DMEM /F12 sin suero suplementado con factores de crecimiento. OCICs y control de las células de cáncer de ovario fueron tratados con cisplatino (20 a 60 micras), taxol (2-20 mM), o bleomicina (20 M to100 mu M) durante 48 h. Después de cultivo durante 48 h, la viabilidad celular se evaluó mediante un recuento de células kit-8 (Dojndo, Japón), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. las tasas de supervivencia de la célula se define como el porcentaje de células supervivientes tratados con fármaco, dividido por las células de control no tratadas. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
PCR cuantitativa análisis de microarrays y en tiempo real de RT-PCR
Cáncer Resistencia a las Drogas humano RT
2 Profiler matriz PCR (QIAGEN#330231) se utilizó para determinar los perfiles de expresión de 84 genes implicados en la regulación de la quimioterapia. Los cebadores para 84 genes de prueba y 5 genes de mantenimiento (
B2m
,
HPRT1
,
Rpl13a
,
Gapdh
, y
Actb
) se incluyeron en cada placa de 96 pocillos. Un kit de la primera cadena (QIAGEN#330401) y SYBR Green qPCR Mastermix (QIAGEN#330500) eran de SABiosciences. qPCR se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante (SABiosciences RT
2 Sistema de Arreglo Profiler PCR) usando un dispositivo de Bio-Rad CFX96TM Real-Time PCR. El análisis de datos se realizó mediante el análisis de datos de matriz en línea SABiosciences PCR, como se describe en el protocolo del fabricante.
células esferoide células diferenciadas esferoide, o células tumorales primarias fueron colocadas en microtubos ARNasa-libres. La extracción total de ARN y la transcripción inversa se realizaron con RNAiso Plus y un kit de transcripción inversa Mix (Takala), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN total (0,5 g) se invirtió transcrito utilizando un Kit de Síntesis de ADNc (Bio-Rad). En tiempo real las reacciones de PCR se realizaron utilizando un sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 (Bio-Rad). Cada muestra de ADNc se analizó por triplicado. Para cuantificar cambios de expresión génica, se utilizó el método △△ Ct para calcular los factores de cambio relativos después de la normalización de
Actb
(β-actina) los niveles de ARNm. Las secuencias de los cebadores de RT-PCR de genes específicos se muestran en la Tabla S1.
extracción de proteínas y análisis de transferencia de Western
Las células se lisaron con tampón de lisis celular (Beyotime) que incluía un volumen apropiado de una cóctel inhibidor de la proteasa (Roche). Las proteínas totales se separaron por SDS-PAGE y después se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno (Millipore, EE.UU.). sitios de unión no específicos se bloquearon con leche desnatada 5% en TBST a temperatura ambiente durante 1 h. Después de sondeo con anticuerpos primarios, las membranas se incubaron con anticuerpos anti-conejo unido a la peroxidasa de rábano picante (Tecnologías de Señalización Celular, Danvers, MA) y después se lavó. Los anticuerpos unidos se visualizaron usando un kit de detección de quimioluminiscencia (Amersham). Los anticuerpos primarios fueron: anti-YAP, anti-OCT-4, anti-Notch-1, anti-actina, todos los cuales eran de Cell Signaling Technology. Un anti-TEAD1 (1:1000; 5178-1) de anticuerpos fue de Epitomics. Anti-TEAD2 (1:1000; LS-C119063) y anti-TEAD3 (1:1000; LS-C30406) anticuerpos fueron de Vida útil Biosciences. Anti-TEAD4 (1:1000; ab97460) de anticuerpos fue de Abcam. Las proteínas se visualizaron utilizando un sustrato Dura Super Señal (Millipore, EE.UU.).
El análisis estadístico
Todos los ensayos se realizaron por triplicado. el software GraphPad Prism (GraphPad Prism, San Diego, CA) se utilizó para comparar los resultados del grupo de pruebas de Chi-cuadrado o ANOVA, según el caso. Las diferencias se consideraron significativas para p. & Lt; 0,05
Resultados
esferas de cáncer de ovario son tumores iniciados propiedades de células madre del cáncer
células de cáncer de ovario primarios se disocian y se colocaron en frascos de cultivo sin recubrimiento en medio libre de suero suplementado con EGF, b-FGF, la insulina, y BSA. Después de una semana en cultivo, se observaron agrupaciones esféricas no adherentes de células en la parte inferior de estos matraces. En un mes más tarde, esferas con aumento de tamaño se observaron claramente (Fig. 1A). Por lo general, 5 × 10
6~1 × 10
7 digieren las células de xenoinjertos se pusieron en la cultura, y aproximadamente el 2-4% de ellos se convirtieron en OCICs en las condiciones privadas de suero. Real-time RT-PCR y los resultados de transferencia Western mostraron que los marcadores de células madre Oct-4, SOX-2, nestina, Notch-1, y Nanog fueron altamente expresado por estas células en esferas (Fig. 1B).
R: Las imágenes de grupos de células esféricas no adherentes derivadas de células de cáncer de ovario en cultivo primario. Barras de escala = 100 m. B: Western Blot y en tiempo real RT-PCR resultados que muestra la expresión de los genes indicados en OCICs mejoradas. los niveles de ARNm relativas se determinaron mediante la normalización de los niveles endógenos de ß-actina mRNA (utilizado como control interno), utilizando Microsoft EXCEL. Para cada gen se ha indicado, el nivel de transcripción relativa de la (barra de la izquierda de cada gráfico) muestra de control se fijó en 1. Los niveles de transcripción relativos de otras muestras se compararon con el control, y los factores de cambio se muestran en el gráfico. C-D: resultados de la tinción de inmunofluorescencia representativas de la expresión CA125, CK7, CD44, CD117 y en OCICs indiferenciadas y diferenciadas. Los núcleos se tiñeron con DAPI. Barra de escala = 100 M para todos los paneles.
A continuación, se investigó si estas células tenían esfera independiente de anclaje de auto-renovación. Hemos cultivado esferoides durante 14 días en condiciones de diferenciación (factores de crecimiento retirados y medianas que contenían FBS al 10%). Las células esferoide cambiado a partir de células adherentes flotante para las células, adquirieron una morfología epitelial, y CA125 y CK-7-positivo colonias simétricas (Fig. 1C) formado. (CA125 y CK-7 son marcadores de la superficie celular de células de cáncer de ovario epiteliales diferenciadas bien establecidas.) Además, los informes anteriores marcadores de superficie celular de las células madre epiteliales de ovario, CD44 y CD117, se expresaron en niveles mucho más altos en las células de la esfera que en células planas diferenciadas (Fig.1D).
células de formación de esferas son fuertemente tumorigénico
Hemos examinado si estas células de formación de esferas identificadas fueron tan fuertemente tumorigénico como otras células que inician el cáncer epitelial reportados. comparables número de células esfera y control de las células fueron inyectadas por vía subcutánea en los costados de ratones desnudos. A las dos semanas más tarde, los tumores se encontraron en tres de cuatro ratones desnudos atímicos que habían sido inyectados con 10
4 células esfera. Sin embargo, los tumores no se encontraron en ratones que habían sido inyectados con células tumorales de ovario diferenciadas, incluso a 10
5 células por injerto (Fig. 2A). La concentración de células se muestra en la Fig. 2A es 10
4 por ratones y otros resultados de las concentraciones no han sido mostrados
A:. Imágenes de ratones desnudos que muestran la formación de tumores de ovario xenoinjerto después de inyectar esferas OCIC. Las concentraciones de células utilizan 10
4 en cada grupo. B: H & amp; E tinción resultados que muestran la histología de los tumores derivados de esferoides por vía subcutánea trasplantado OCIC. C: Los resultados representativos de IHC para CA125 y expresión YAP en xenoinjertos de tumores humanos derivados de OCICs. expresión de la proteína específica se indica por el color marrón y los núcleos (azul) se contratiñeron con DAPI. D: Los resultados representativos de IHC para la expresión de los marcadores de pluripotencia Oct4, Sox2, y NANOG en tumores de ovario de xenoinjerto derivados de esferoides OCIC. E: Los resultados representativos de IHC para AKT fosforilada y pMAPK (/2 ERK1) expresión en los tumores de xenoinjertos derivados de OCICs. Barra de escala = 200 M para paneles BE
H & amp;.. E resultados de la tinción mostró que los tumores derivados de las células de formación de esferas inyectados tenían un histológica similar a la de los tumores de células inyectado A2780 (Fig 2B ). Estos tejidos tumorales expresan altos niveles de YAP y fueron positivas para el CA-125, un marcador de adenocarcinoma de ovario (Fig. 2C). Estos resultados mostraron que las células de formación de esferas que habíamos identificados fueron altamente tumorigénico y en serie podrían propagarse a su fenotipo tumor original. Con base en esta mejorada, tumorigenicidad reproducible, designamos estas células de formación de esferas células de cáncer de ovario (iniciar OCICs), de acuerdo con la terminología previamente aceptada. Además, también detectó los marcadores de células madre (Oct4, SOX2, y Nanog) de expresión y los niveles de fosforilación de Akt /MAPK en estos tejidos tumorales de diferente origen celular (Fig. 2D-E). Los resultados también mostraron que estos genes tienen unas mayores niveles de expresión de lo que en los controles.
Se requieren
YAP y Tead para el mantenimiento de la pluripotencia OCIC
Un informe anterior mostró que YAP participó en células iPS el mantenimiento en condiciones indiferenciadas [14]. Por lo tanto, postulamos que YAP también podría mantener la pluripotencia de células madre del cáncer de ovario. miembros de la familia de YAP y Tead, a excepción de TEAD2, fueron expresadas a niveles significativamente más altos por OCICs que por las células de cáncer de ovario diferenciadas (Fig. 3A-C). Además, los niveles de mRNA de los genes diana conocidos YAP /Tead, incluyendo
Runx2
,
ITGB2
, y
ErbB4
, se incrementaron significativamente en todas las células OCIC, lo que sugiere que YAP /Tead actividad fue alta en estas células (Fig. 3D). Estos resultados fueron consistentes con los de un informe anterior [27]
AC:. En tiempo real RT-PCR (A), la tinción de inmunofluorescencia (B) y Western Blot resultados (C) para YAP y TEAD1- 4 niveles de expresión en células primarias de cáncer de ovario (control) y OCICs. Los núcleos se tiñeron con DAPI. D: En tiempo real RT-PCR para los niveles de mRNA de los genes diana conocidos YAP /Tead, incluyendo
Runx2
,
ITGB2
, y
ErbB4
, en el cáncer de ovario primario células (control) y células OCIC. EF:. En tiempo real RT-PCR para la eficiencia de RNAi agotamiento de YAP, TEAD1, TEAD3, y TEAD4, después de usar dos shRNAs diferentes para cada gen
Para investigar si los miembros de la familia de YAP y Tead estaban involucrados en el mantenimiento de la pluripotencia OCIC, hemos derribado
Yap
y
Tead1 /3/4
expresión en OCICs usando shRNAs. RT-PCR resultados confirmaron la eficacia de la precipitación de la shRNAs se indica (Fig. 3E-F). Inmunofluorescencia tinción resultados mostraron que OCT-4 expresión era más débil en shYAP y shTEAD OCICs tratadas que en las células control (Fig. 4A). Además de OCT-4, la expresión de otros marcadores de células madre también se redujo, como se determina por RT-PCR y Western Blot (Fig. 4B-C). En un ensayo de formación Clony, cuando las células de formación de esferas fueron tratados con
Yap
shRNA, los esferoides fueron más pequeñas (Fig. 4D). cambios morfológicos similares se observaron también para sh
Tead1 /3/4
OCICs tratadas (datos no mostrados). Estos resultados mostraron que era necesario un /Tead co-activador YAP para el mantenimiento de la pluripotencia OCIC
A:. Resultados de la tinción de inmunofluorescencia representativos para OCT-4 expresión en
Yap CD - y
Tead1 /3/4
-silenced OCICs. BC: Real-time RT-PCR (B) y los resultados de Western Blot (C) muestran que los genes indicados se redujeron regulado en OCICs después de RNAi agotamiento de los
Yap
y
Tead1 /3/4
. D: Las imágenes de los cúmulos esféricos sin OCIC (paneles superiores) y con (paneles inferiores) sh
Yap
-tratamiento de 200 veces de aumento
YAP-Tead confiere resistencia al fármaco quimioterapéutico. OCICs
Una de las propiedades de las células madre del cáncer es su resistencia a los agentes quimioterapéuticos convencionales. Por lo tanto, se determinó la sensibilidad OCICs 'al cisplatino, taxol y bleomicina tratamientos. células tumorales primarias mostraron sensibilidad a estos fármacos quimioterapéuticos de una manera dependiente de la dosis (Fig. 5A). En comparación con las células tumorales primarias, OCICs exhibieron resistencia a cisplatino, taxol y bleomicina (Fig. 5A) mejorada. Sin embargo, OCICs con
Yap
y las tasas de supervivencia
Tead1 /3/4
caída había disminuido (Fig. 5B). Estos resultados apoyan la hipótesis de que YAP-Tead mejoró la resistencia a los medicamentos de las células madre como en el cáncer de ovario.
A. Las tasas de supervivencia de las células primarias de cáncer de ovario (de control) y OCICs después del tratamiento con cisplatino (CDDP), taxol, o bleomicina a las concentraciones indicadas. OCICs y células de control se trataron con fármacos durante 48 h. *, P & lt; 0,01, en comparación con el grupo de control correspondiente. **, P & lt; 0,001, en comparación con el grupo de control correspondiente. B. tasas de supervivencia de OCICs con o sin
Yap
y
Tead1 /3/4
caída después del tratamiento con CDDP, taxol, o bleomicina a las concentraciones indicadas durante 48 h. ns: no significativo; *, P & lt; 0,01; **, P & lt; 0,001. C-D: en tiempo real RT-PCR resultados que muestran que los genes indicados se expresaron en OCICs en niveles más altos que en las células de cáncer de ovario primarios (C). los niveles de expresión de los genes indicados 'en OCICs fueron significativamente regulados hacia abajo con
Yap
y
Tead1 /3/4
RNAi (D). *, P & lt; 0,01; **, P & lt; 0,001. E. Western Blot resultados para los niveles de AKT y pAKT en OCICs con o sin
Yap /Tead1 /3/4
shRNA tratamiento.
YAP hasta regula la expresión de ABCB1 GSK3A y para mejorar resistencia a los medicamentos OCICs '
para determinar los genes resistentes a los fármacos implicados en la regulación de OCICs, se utilizó el análisis de microarrays de genes resistentes a los medicamentos para OCICs y múltiples genes relacionados con la quimio-resistencia-putativos identificados que fueron altamente expresado en OCICs. Una sinopsis tabular de los resultados de microarrays con los respectivos cambios veces se presenta en la Tabla S1. Los genes ABCB1 relacionada con el fármaco-resistencia, ABCC1 GSK3A, había significativamente más altos niveles de expresión en OCICs que en las células de cáncer de ovario primario (Fig. 5C). Además, investigó si estos genes fueron regulados por YAP-Teads en OCICs. Entre estos genes, ABCB1 y GSK3A fueron significativamente reguladas en el
Yap /Tead
-agotadas OCICs, mientras que la expresión ABCC1 no se vio afectada significativamente (Fig. 5D)
.
Además,
Gsk3a
,
GSK3b, España y
expresión de p53
gen también se detectó en OCICs (Fig. 5C). Entre estos,
Gsk3a
y
p53
fueron notablemente las reguladas en
Yap /Tead
-agotadas OCICs y
GSK3b
pocos cambios (Fig. 5D ). Estos resultados sugieren que YAP y Teads mejorada resistencia a los medicamentos OCICs 'por
celular arriba y abajo de la regulación de los genes implicados en el metabolismo de fármacos y la supervivencia celular. La vía de señalización de PI3K se conoce a cooperar con la vía Hippo para regular crecimiento y la proliferación [28]. los niveles de AKT fosforilada fueron altas en OCICs y disminuyeron con el
Yap y
o
Tead1 /3/4
agotamiento /. Curiosamente, los niveles totales de AKT también fueron regulados a la baja en
Yap Tead1 /3/4 & Co-agotado OCICs /. Estos resultados también demostraron que se requerían YAP /Teads para mantener la actividad de la vía PI3K /AKT en OCICs (Fig. 5E).
genes de la vía MAPK están involucrados en YAP mantiene la pluripotencia OCIC
Los resultados de el análisis de microarrays qPCR (Tabla S2) demostró que varios genes implicados en las vías de MAPK, incluyendo
c-Fos
,
Egfr
, y
Igf2r
, tenían mayores niveles de expresión en OCICs que en las células primarias de cáncer de ovario (Fig. 6A). Su expresión se había reducido regulado después de
Yap
y
Tead1 /3/4
tratamiento shRNA (Fig. 6B). Debido a c-jun y c-fos forman el complejo y la función de AP-1 juntos, se examinaron
c-Jun
la expresión génica en estas muestras y encontramos resultados similares (Fig. 6A-B). La
Egfr
y
Igf2r
genes codifican para el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y el receptor del factor de crecimiento similar a la insulina 2 (IGF2R), respectivamente. Estos son importantes receptores de membrana celular que transmiten señales extracelulares clave para el núcleo mediante la activación de cascadas de MAP quinasa. MAP quinasas fosforiladas y activadas se translocan desde el citoplasma al núcleo para mediar C-fos y activación de la transcripción C-jun. Algunos estudios mostraron que YAP regulado genes Tead hasta de regular la
Areg
gen, que interactúa con el receptor /TGF-alfa EGF para promover el crecimiento de células epiteliales normales [29], [30]. Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que estos genes en las vías de MAPK pueden estar involucrados en YAP mantienen pluripotencia OCIC.
A. resultados en tiempo real de RT-PCR que muestran que los genes indicados se expresaron en OCICs en niveles más altos que en las células de cáncer de ovario primarios (de control). B. En tiempo real RT-PCR resultados muestran que los niveles de expresión de los genes indicados 'fueron significativamente reguladas en OCICs con
Yap
/
Tead1 /3/4
RNAi.
Discusión
aparición y progresión del tumor están estrechamente relacionados con el desarrollo de células somáticas y diferenciación anormal. Hay un pequeño número de células específicas o llamada de células madre en nuestro cuerpo incluyeron tejido ovárico que son capaces de auto-renovación y diferenciación direccional [31] - [33]. Como parte de estas células, las células madre de cáncer han atraído recientemente la atención. Un estudio previo demostró que una población de células madre de cáncer mucho más pequeña de hecho existía en algunos tejidos de cáncer, que inició el desarrollo de las células cancerosas y se relacionan con el mantenimiento de células madre propiedad, tumorigénesis, metástasis maligna, y la recurrencia [34]. células madre de cáncer tienen varias características importantes, incluido clon capacidad de formación, la expresión de marcadores de células madre y marcadores de superficie celular específicos, la diferenciación celular y la identificación morfológica, y una fuerte capacidad tumorigénico.
En este estudio, hemos aislado con éxito de ovario las células madre, como el cáncer de los ratones portadores de tumor y demostró que estas células tenían las características de las células madre de cáncer descritos anteriormente. Después de aproximadamente un mes en la cultura, OCICs formaron agrupaciones que figuran numerosas células y tenían un diámetro de hasta 500 micras. OCICs no sólo tenía una fuerte capacidad clonogénico sino que también expresan marcadores de células madre del cáncer en niveles altos. resultados de diferenciación de la célula mostró que los esferoides que aislamos de hecho tenían las características de cáncer de ovario epitelial. Las tarifas de tumorigénicas de estos OCICs fueron significativamente mayores que los de las células de cáncer de ovario primarios y estos datos no se ha mostrado en la Figura 2.
Muchas vías de señalización, tales como el Wnt, PI3K, MAPK vías de señalización, se han informaron estar estrechamente asociado con células madre y la vía Hippo [18], [19]. La vía Hippo también ha recibido considerable atención en lo que respecta a frenar los mecanismos de regulación celular y tumorigénesis [23], [35], [36]. Algunos estudios muestran que el gen YAP regula la reparación del epitelio de células madre y células madre intestinales y la función de células madre hematopoyéticas [37] - [40]. las células tumorales y la actividad de propagación contribuyeron a la progresión tumoral y la metástasis de pulmón en CD24-dependiente y /Yap vías Taz-dependientes [41]. YAP fue inhibida por catenina durante la proliferación de células madre epidérmicas y desarrollo del cáncer de piel a través de la vía de señalización Wnt [42]. Por el contrario, YAP restringido señales de Wnt durante la regeneración intestinal. En nuestro estudio, los niveles de fosforilación de AKT y MAPK eran mucho más altos de expresión no sólo en los tejidos tumorales OCIC, sino también en OCICs.
La expresión transgénica de YAP reduce la expresión de genes diana de Wnt y dio lugar a la rápida pérdida de criptas intestinales. Además, una pérdida de YAP dio lugar a la hiperplasia y la expansión de las células intestinales madre (SICS) y células de nicho [38].