Extracto
El
PSA-Cre; PTEN-loxP /loxP
pantallas modelo de cáncer de próstata de ratón claramente las etapas de la hiperplasia y cáncer definidos. A continuación, se estudian las etapas iniciales del desarrollo de la hiperplasia. La tinción inmunohistoquímica mostró que pAkt
+ células hiperplásicas acumulados sobreexpresan luminal CK8 marcador de células epiteliales, y marcadores de células epiteliales marcadores de células progenitoras CK19 y Sca-1, pero no basales. Por perfiles de expresión Se identificaron nuevos marcadores de células hiperplásicas, incluyendo Tacstd2 y Clu. Además se demostró que en próstatas de edad joven de objetivo
PTEN
ratones knock-out que figuran en la capa de células epiteliales luminales sola pAkt
+ células, que sobreexpresa CK8, Sca-1, Tacstd2 y Clu; las células epiteliales basales eran siempre pAkt
-. Es importante destacar que, en la capa de células epiteliales luminales de próstatas normales detectamos rara Clu
+ Tacstd2
+ Sca-1
+ células progenitoras. Estas nuevas células tumorales son células iniciadoras candidato en
PTEN
ratones knockout. Cabe destacar que todas las células epiteliales luminales en la región proximal de próstatas normales eran Clu
+ Tacstd2
+ Sca-1
+. Sin embargo, en
PSA-Cre; ratones loxP
PTEN-loxP /, la próstata proximal no contiene focos hiperplásicos. Pequeños focos hiperplásicos en próstatas de
PSA-Cre; PTEN-loxP /+ ratones
que se encuentran en la vejez, mostró completa
PTEN
inactivación y un perfil de marcador de las células progenitoras. Por último, presentamos un nuevo modelo de desarrollo y renovación de próstata, incluyendo las células progenitoras epiteliales luminales específicos de linaje. Se propone que
PTEN
deficiencia induce un cambio en el equilibrio de la diferenciación de la proliferación en estas células
Visto:. Korsten H, Ziel-van der Made A, Ma X, van der Kwast T, Trapman J (2009) la acumulación de células progenitoras en la célula de capa luminal epiteliales son tumor Candidato células iniciadoras de próstata en un modelo de cáncer de
PTEN
ratón knockout. PLoS ONE 4 (5): e5662. doi: 10.1371 /journal.pone.0005662
Editor: Stefan Wölfl, Universität Heidelberg, Alemania |
Recibido: 4 Febrero 2009; Aceptado: 28 de abril de 2009; Publicado: 22 de mayo de 2009
Derechos de Autor © 2009 Korsten y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por una beca de la Sociedad holandesa del cáncer KWF (Grant número: EMCR 2.006 a 3.592, www.kwfkankerbestrijding.nl). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es el tumor más frecuente en hombres en los países con un estilo de vida occidental, y una causa importante de mortalidad relacionada con el cáncer [1]. Completa
PTEN
inactivación se encuentra en ~ 20% de los tumores de próstata primarios y en hasta el 60% de las metástasis de cáncer de próstata [2]. Inactivación de un
PTEN
alelo es aún más común. Alta frecuencia de
PTEN
inactivación se encuentra también en el cáncer de endometrio y en glioblastoma [3]. Las mutaciones de la línea germinal de
PTEN ¿Cuáles son las causas de la enfermedad de Cowden y síndrome de Bannayan-Zonana, que se caracterizan por hamartomas y predisposición a tumores de mama y de tiroides [2], [3].
PTEN contrarresta phosphoinositide-3-quinasa (PI3K) de señalización mediante el equilibrio de los niveles de fosfatidilinositol (4,5) fosfato (PIP2) y fosfatidilinositol (3,4,5) fosfato (PIP3) en la célula [2] - [4]. PIP3 acumulación conduce a la fosforilación de abajo objetivos, entre ellos AKT. Como consecuencia de ello se modulan las actividades de otros efectores y funciones biológicas de células, incluyendo la proliferación, la apoptosis, el tamaño celular, la polaridad, el metabolismo, la adhesión, la migración y la angiogénesis se cambian [3] - [6]. Nuclear PTEN podría desempeñar un papel en el mantenimiento de la estabilidad genómica [7]. Por otra parte, recientemente se ha descrito que el PTEN puede controlar de células madre auto-renovación [6], [8], [9].
Completo
PTEN
inactivación en ratones es letal embrionaria.
PTEN +/-
ratones son viables, pero desarrollan varias lesiones hiperplásicas y displásicas en diferentes órganos [10], [11]. Condicional
PTEN
modelos de ratón knockout confirmó que
PTEN
inactivación juega un papel importante en el desarrollo del cáncer y la progresión tumoral. Los ratones con prostático específico
PTEN
inactivación desarrollar hiperplasia, MPIN y, finalmente, el cáncer de próstata [12] - [15].
Como se identificó por primera vez para las células hematopoyéticas, que ahora se acepta generalmente que todos los tejidos contener células raras específicos de tejido madre que son capaces de auto-renovación y diferenciación a través de la división celular asimétrica [16], [17]. Estas células no sólo son esenciales para organogénesis durante el desarrollo, sino también para la renovación de los tejidos en la especie adultos. Como se muestra claramente en diferentes tipos de leucemia, los tumores pueden desarrollar mediante la modificación de las células madre hematopoyéticas o, alternativamente, a partir de células progenitoras multipotentes o linaje específicos que han adquirido vástago de características similares a las células [18]. Aunque menos claro, el mismo mecanismo se ha propuesto para el desarrollo de tumores sólidos, incluyendo cáncer de próstata. Según el modelo de células madre, cada tumor contiene un pequeño número de células con las propiedades relacionadas con las células madre normales, que son esenciales para el mantenimiento del tumor [16], [19] - [21]. Como complemento a la teoría de las células madre tumorales, el modelo de evolución clonal propone que los tumores pueden desarrollarse por la expansión de los clones dominantes [22] - [24].
Estudio del desarrollo de tumores en modelos de ratón de cáncer de próstata puede ser fundamental para la comprensión cáncer de próstata humano. En la próstata humana y de ratón normal, células y células progenitoras multipotentes, o células de tránsito de amplificación de tallo, son propuestos para estar presente en la capa de células epiteliales basales [21], [25] - [27]. Además, en ratones, la región proximal de la próstata se ha indicado como un nicho de células madre /progenitoras putativo [28] - [30]. Hasta ahora, nuestro conocimiento de los pasos iniciales en el desarrollo de tumores en modelos de ratón de cáncer de próstata se limita. En el
probasina (PB) -Cre
inducido
PTEN
modelo nocaut,
PTEN
inactivación en un p63
+ población celular del tallo /progenitoras en las células epiteliales basales capa ha postulado [31]. En una prostático específico
Trp53 /Rb
nocaut modelo, las células luminales /neuroendocrino progenitoras en la próstata proximal se han indicado como potenciales células iniciadoras de tumores [32].
En el presente estudio se investigó primeros pasos en el desarrollo de tumores de próstata en otro lugar llamado dirigido
PTEN
modelo de inactivación, basado en
PSA-Cre
expresión. Anteriormente, hemos descrito que en este modelo etapas claramente definidas de la hiperplasia de próstata y el cáncer pueden ser discriminados [13]. Aquí hemos demostrado que las células hiperplásicas en
PTEN
ratones knockout tienen un fenotipo de las células progenitoras epiteliales luminales, incluyendo la sobreexpresión de CK8, CK19 y Sca-1. Por la expresión se identificaron nuevos perfiles de marcadores de células hiperplásicas. La primera pAkt hiperplásico
+ en las células de la próstata joven
PTEN
ratones knock-out se encuentra en la capa de células epiteliales luminales. Es importante destacar que, también identificó a nuevas frecuencias bajas células progenitoras de linaje específico en la capa de células epiteliales luminales de próstatas normales. Estas células podrían representar las primeras células luminales que se ha postulado intermedios /tránsito de amplificación [33], [34]. Nuestros resultados indican que
Pten
inactivación en este modelo de ratón conduce a la acumulación de las nuevas células progenitoras epiteliales luminales identificados por un cambio drástico de la balanza diferenciación /proliferación de estas células. Aunque todas las células en la capa de células epiteliales luminales en la próstata proximal mostraron expresión de los nuevos marcadores específicos de linaje, focos hiperplásicos no se desarrollaron de esta región de la próstata.
Resultados
células hiperplásicas en próstatas de PSA-Cre; ratones PTEN-loxP /loxP tienen un fenotipo de las células epiteliales luminales y expresan marcadores de células progenitoras epiteliales
Anteriormente, hemos descrito el desarrollo del cáncer de próstata en
PSA-Cre; PTEN-loxP /loxP
ratones [13]. En próstatas de 4-5 meses (4-5m) edad
PSA-Cre; PTEN-loxP /loxP
ratones células epiteliales hiperplásicas sobreexpresan fosfo-Akt (pAkt) y los marcadores epiteliales luminales citoqueratinas 8/18 (CK8 /18). hiperplasia de células fueron negativos para los marcadores epiteliales basales Las citoqueratinas 5/14 (CK5 /14). El receptor de andrógenos (AR) se expresa en niveles iguales en la normalidad y próstatas hiperplásicas [13]
En el presente estudio se caracterizó por QPCR e inmunohistoquímica hiperplásico células de la próstata de
PSA-Cre;. PTEN-loxP /loxP
ratones. En primer lugar, la expresión de progenitor adicional, basal y marcadores de células epiteliales luminales se analizó a 2 M y en 4-5m. En estas edades próstatas de
PSA-Cre; /loxP
ratones PTEN-loxP son de ~ 70% y & gt; 90% hiperplásico, respectivamente (Figura S1 A). La expresión de
probasina
y
Nkx3.1
, los marcadores de células luminales diferenciadas, fue mucho menor en próstatas hiperplásicas, pero
CK8
fue mayor expresa en estos tejidos. Baja expresión de los marcadores de células epiteliales basales
CK5
y
se detectó p63
. Curiosamente, la expresión del marcador de células progenitoras epiteliales
CK19
[35], [36] fue alta en próstatas hiperplásicas.
Nkx3.1
,
CK8
,
CK19
y
los datos de expresión de mRNA p63
fueron confirmados por inmunohistoquímica en próstatas normales y hiperplásicas (4-5m) (Figura S1 B-S1I). tinción nuclear Nkx3.1 se observó en las células epiteliales luminales de próstatas normales, pero los núcleos de las células hiperplásicas eran apenas positivo (Figura S1 B-S1C). Se observó una tinción débil CK8 en la parte apical de las células epiteliales luminales en próstatas normales, mientras que en próstatas hiperplásicas de
PSA-Cre; PTEN-loxP /loxP ratones
CK8 se sobreexpresa (Figura S1D-S1E). Es importante destacar que, CK19 fue claramente superior expresa en las células hiperplásicas que en las células epiteliales de próstata normales (Fig. S1F-S1G). hiperplasia de células fueron negativos para el marcador p63 basal de células epiteliales, sino una p63 aparentemente normal
+ capa de células epiteliales basales estuvo presente por debajo de una capa múltiple de células hiperplásicas (Figura S1H-S1I). A partir de estos datos se concluye que
PTEN
inactivación en próstatas de
PSA-Cre; PTEN-loxP /loxP
ratones da como resultado la acumulación de células hiperplásicas con características de células progenitoras luminal (Nkx3.1
+/- CK8
+ CK19
+ p63
-)
perfiles de expresión identifica nuevos genes con alta expresión en el epitelio de la próstata hiperplásica
se realizó perfiles de expresión. para identificar nuevos genes expresados diferencialmente en próstatas hiperplásicas de
PSA-Cre; /loxP
ratones PTEN-loxP (4-5m). Análisis de Componentes Principales (PCA) y la agrupación jerárquica sin supervisión (Figura 1A y 1B) del ADNc serie de datos mostraron un perfil de expresión génica diferencial clara entre próstatas hiperplásicas y próstatas normales.
(A) Análisis de componentes principales (PCA) de la expresión génica en próstatas normales (círculos azules) y próstatas hiperplásicas de
PSA-Cre; PTEN-loxP /loxP ratones
(círculos rojos) a 4-5m. (B) Agrupación jerárquica sin supervisión de los perfiles de expresión génica de cinco próstatas normales (PN) y cinco próstatas hiperplásicas (HP). El color verde indica la expresión génica inferior y rojo indica una mayor expresión. (C) Los veinte genes con la expresión diferencial más grande de HP en comparación con NP como se determina mediante el cálculo de la diferencia en el nivel de expresión media. Análisis (D) Importancia de Microarrays (SAM) de las mismas muestras como se muestra en C. Tenga en cuenta que por análisis de SAM esencialmente idénticos genes fueron identificados como mediante el cálculo de la diferencia en el nivel de expresión media. análisis (E) QPCR de los cinco genes con la más alta expresión de HP en comparación con NP y de los
Sca-1 |. Cada subgrupo se compone de cinco muestras de próstata. Los niveles de expresión en próstatas hiperplásicas de 2m y ratones viejos 4-5m y en próstatas de los compañeros de camada de control se muestran como nivel medio de expresión +/- SE relación a
HPRT
expresión. (M-H) El análisis inmunohistoquímico de nuevos marcadores de células hiperplásicas en el PN y HP de
PSA-Cre; PTEN-loxP /loxP
ratones (4-5m). (F) Tacstd2 NP, (G) Tacstd2 HP, (H) Clu NP, (I) Clu HP, (J) Ppp1r1b NP, (K) Ppp1r1b HP, (L) Sca-1 NP y (M) Sca-1 HP.
Para identificar los genes expresados preferentemente en las células prostáticas hiperplásicas, se calcularon las diferencias en los niveles de expresión de medias. El progenitor del ratón /vástago marcador de células
Sca-1 | era uno de los mejores veinte genes con la más alta expresión en próstatas hiperplásicas (Figura 1C);
CK19
fue en los cincuenta mejores genes expresados diferencialmente (datos no mostrados). Los genes que mostraron alta expresión en próstatas hiperplásicas mediante el cálculo de las diferencias en el nivel de expresión media (Figura 1 C), como
EXPI, WFDC2, Tacstd2 (Trop2), Clu, Ppp1r1b
,
Sca-1 | y
CK19
, también se encontraron sobreexpresa por Importancia Análisis de microarrays (SAM) (Figura 1D). Los nombres completos de los veinte primeros genes sobreexpresados se enumeran en la Tabla S1. Una lista más amplia de todos los genes regulados positivamente o regulación a la baja de manera significativa identificados por SAM análisis se proporciona en la Tabla S2. Tenga en cuenta que
CK19
está en los veinte primeros de los genes upregulated.
Los perfiles de expresión de los cinco genes con mayor sobreexpresión en próstatas hiperplásicas de
PTEN
ratones knockout dirigidos,
eXPI, WFDC2, Tacstd2, Clu
y
Ppp1r1b gratis (Figura 1C), y de
Sca-1 |, fueron verificados por QPCR en próstatas de
PTEN
ratones knockout y en próstatas normales en 2m y al 4-5m (Figura 1E). QPCR mostró que la expresión de
EXPI
y
Tacstd2 Hoteles en
PSA-Cre; PTEN-loxP /loxP
ratones era ya elevado a 2m;
Clu
y
Sca-1 | mostraron un nivel de expresión aumentando gradualmente. Sin embargo, para los
WFDC2
y
Ppp1r1b
se observó el aumento agudo en la expresión en la próstata completamente hiperplásicas (4-5m).
A continuación, la expresión de marcadores para que los anticuerpos adecuados estaban disponibles, Tacstd2, Clu, Ppp1r1b y Sca-1, se estudió mediante inmunohistoquímica en próstatas normales y hiperplásicas (Figura 1 F-1M). Tacstd2 inmunohistoquímica mostró tinción de membrana en los tejidos hiperplásicos, de acuerdo con su ubicación conocida como una proteína transmembrana [37]. Clu estaba presente principalmente en el citoplasma de las células hiperplásicas. Como se predijo a partir de los datos QPCR, el patrón de expresión de Ppp1r1b en las células hiperplásicas era más heterogénea. De acuerdo con la tinción CK19 (Figura S1), Sca-1 tinción indica que las células hiperplásicas tienen un fenotipo de células progenitoras
Los genes con una menor expresión en próstatas hiperplásicas de
PSA-Cre;. PTEN-loxP /loxP
ratones también se identificaron tanto por el cálculo de la diferencia de nivel de expresión media y por SAM (Figura 1C y 1D). Los perfiles de expresión de genes con la expresión más baja en próstatas hiperplásicas,
Hs3st3b1, Ccdc16, Mcoln2, C1r
y
, fueron confirmados por QPCR (Figura S2) Mt1 gratis (Figura 1C). La expresión de todos los genes ya era baja en próstatas hiperplásicas a 2m en
PSA-Cre;. PTEN-loxP /loxP ratones
inicial pAkt
+ células hiperplásicas en la capa de células epiteliales luminales en próstatas de PSA-Cre; PTEN-loxP /loxP ratones expresan Clu, Tacstd2 y Sca-1 |
Para recopilar información de tumor de células candidato iniciación, se analizó en detalle el desarrollo temprano de la hiperplasia de próstata de
PSA-Cre; PTEN-loxP /loxP ratones
, que comienza a las 4-5 semanas (4-5w). Próstatas de ratones de tipo salvaje en 4-5w eran la mitad del tamaño de los de los ratones adultos (de 2 m y 4-5m) (Figura 2A). A diferencia de peso de la próstata de los ratones más viejos (2m y 4-5m), peso de la próstata de joven
PSA-Cre; PTEN-loxP /loxP
ratones (4-5w) no fueron diferentes de los compañeros de camada de control (Figura 2A ). En 4-5m los pesos de la próstata de
PSA-Cre;. PTEN-loxP /loxP
ratones eran ~ 3 veces mayor que los de los controles, causada por el aumento del número y tamaño de las células hiperplásicas
(a) peso de la próstata (media +/- SE) de ratones de tipo salvaje y
PSA-Cre; PTEN-loxP /loxP
ratones a 4-5w, 2m y 4-5m. (B) tinción pAkt de focos /células hiperplásicas en la capa celular epitelial luminal de una próstata de un 4-5w edad
PSA-Cre; PTEN-loxP /loxP
ratón. Aumentos de tres regiones indicadas se muestran en B1, B2 y B3. puntas de flecha en B1 y B2 indican
+ células individuales pAkt. tinción de fosfo-Akt de próstatas de 2m (C) y 4-5m (D) de edad
PSA-Cre; PTEN-loxP /loxP
ratones muestra que respectivamente ~ 70% y el 100% de las células epiteliales luminales eran pAkt
+. (E) diapositivas consecutivas de una próstata de un 4-5w edad
PSA-Cre; PTEN-loxP /loxP
ratón manchado de Clu, Tacstd2 y Sca-1 muestra la co-expresión de estos marcadores en un pequeño foco hiperplásico. tinciones de doble inmunofluorescencia confirmaron co-localización de (F) y Tacstd2 pAkt, (G) y Clu pAkt y CK8 (I) y pAkt. (H) pAkt
+ células no se observaron en el p63
+ capa basal de células epiteliales.
expresión de fosfo-Akt se utiliza como marcador de
PTEN
inactivación para visualizar las primeras células negativas PTEN. En 4-5w, dispersos en todos los lóbulos de la próstata, individuales pAkt
+ células hiperplásicas y pequeña pAkt
+ focos fueron detectados (Figura 2B). Es importante destacar que todos pAkt
+ células eran exclusivamente presente en la capa de células epiteliales luminales y no en la capa de células epiteliales basales. En 2m y al 4-5m ~ 70% y casi 100% de las células epiteliales luminales mostró tinción de membrana pAkt, respectivamente (Figura 2C y 2D). las células epiteliales basales permanecieron pAkt negativo. marcadores Sca-1 y la nueva célula hiperplásica Clu y Tacstd2 también se expresaron en los focos hiperplásico inicial (Figura 2E), pero la expresión Ppp1r1b aún no se pudieron detectar en las células hiperplásicas en 4-5w (datos no mostrados).
Para permitir la caracterización precisa de iniciales hiperplásicas pAkt
+, la doble tinción de inmunofluorescencia se llevó a cabo (Figura 2F-2I). Es importante destacar que todos los
+ células pAkt mostraron expresión de Clu y Tacstd2. Por otra parte, todos los pAkt
+ células sobreexpresa CK8 y fueron negativos para el marcador p63 basal de células epiteliales. Este hallazgo sugiere fuertemente que la primera pAkt
+ células, que se observó exclusivamente en la capa epitelial luminal, son idénticas a la mayoría de la acumulación de células hiperplásicas con un fenotipo de células progenitoras epiteliales en 4-5m.
PSA-Cre; PTEN-loxP /+ ratones desarrollan focos hiperplásicos con el mismo perfil marcador como focos hiperplásicos en próstatas de PSA-Cre; ratones PTEN-loxP /loxP
Anteriormente, se informó de que heterocigóticos
PSA -Cre; PTEN-loxP /+
ratones no desarrollan tumores de próstata, pero que puedan desarrollar focos hiperplásicos en la edad avanzada [13]. La disponibilidad de nuevos marcadores de células hiperplásicas permitió un estudio más preciso de desarrollo hiperplasia en estos ratones. Clu tinción de próstatas de
PSA-Cre; PTEN-loxP /+
ratones mostraron que ya en 4-5m algunos pequeños focos hiperplásicos podría ser detectado (Figura S3). En 7-8m el número de focos hiperplásicos era aún muy baja, pero se detectó un claro aumento de focos hiperplásicos en ratones de edad avanzada (& gt; 11 m). Clu
+ focos hiperplásicos no fueron observados en las próstatas de los compañeros de camada de control (datos no mostrados)
Curiosamente, al igual que en próstatas de jóvenes
PSA-Cre;. LoxP
ratones PTEN-loxP /hiperplásico Clu
+ focos de
PSA-Cre; PTEN-loxP /+
ratones (Figura 3A) mostró sobreexpresión pAkt (Figura 3B). En consonancia con esta observación PTEN tinción fue negativa en estos focos (datos no mostrados), lo que indica que el segundo
PTEN
alelo se inactiva en el pAkt
+ células hiperplásicas. células hiperplásicas en
PSA-Cre; PTEN-loxP /+
ratones eran también Tacstd2 y Sca-1 positivo (Figura 3C y 3D). Por lo tanto, las células hiperplásicas en próstatas de
PSA-Cre; PTEN-loxP /+
ratones tenían un perfil de expresión idéntica como focos hiperplásicos en la edad
PSA-Cre; ratones loxP
PTEN-loxP /.
secciones consecutivas de un enfoque hiperplasia de la próstata de un
PSA-Cre; PTEN-loxP /+
ratón se tiñeron para pAkt (B) y los marcadores de células hiperplásicas (a) Clu, (C) Tacstd2 y (D) Sca-1 por inmunohistoquímica.
individual Clu
+ Tacstd2
+ Sca-1
+ células progenitoras epiteliales están presentes en el epitelio luminal capa de células de próstata normales
a continuación, se investigó si los marcadores de células hiperplásicas se expresaron en próstatas normales a diferentes edades. Curiosamente, en 4-5w sola Clu
+ se detectaron Tacstd2
+ Sca-1
+ células en la capa de células epiteliales luminales de próstatas normales (Figura 4A-4C). sin embargo, algunas células epiteliales basales tiñeron positivo para Tacstd2 y Sca-1, nunca se observaron Clu
+ células en la capa basal del epitelio. La presencia de Clu
+ Tacstd2
+ Sca-1
+ células en la capa de células epiteliales luminal de la próstata normal de ratón sugiere que estas células están aún no identificadas previamente las células progenitoras de linaje específico de las células epiteliales luminales . Es tentador especular que en
PTEN
ratones knockout células prostáticas hiperplásicas con características similares a estas células progenitoras se originan en estas células. Esta hipótesis está de acuerdo con la observación de que pAkt
+ células hiperplásicas se encuentra exclusivamente en la capa de células epiteliales luminales (Figura 2B, 2H, 2I y).
tinción (A) Clu de una próstata normal de un ratón viejo 4-5w. Esparcidos por todo el lóbulo de la próstata, se observaron individuales Clu
+ células en la capa de células epiteliales luminales. se muestra una vista general de un lóbulo de la próstata entera y aumentos superiores, de tres regiones indicadas. Las flechas indican las células positivas. (B) Tacstd2
+ y (C) Sca-1
+ células en la capa celular epitelial luminal de la próstata en desarrollo (4-5w). (D) Clu tinción de una próstata normal adulto (4-5m) mostró raras Clu
+ células en la capa celular epitelial luminal. (D1) mayor aumento de la región indicada en (D). (E-J) Inmunofluorescencia doble tinción de Clu
+ y Tacstd2
+ células en la capa celular epitelial luminal de la próstata normal. En próstatas normales Clu
+ y + Tacstd2 fueron negativos para pAkt (E, F), CK8 sobreexpresada (G, H) y no expresan p63 (I, J).
Para estimar la frecuencia de Clu
+ Tacstd2
+ Sca-1
+ células progenitoras epiteliales de diferentes edades, desde el desarrollo de la próstata (4-5w) y de ratones adultos (4-5m) se tiñeron para la expresión Clu. En 4-5w 1/250, y al 4-5m 1 /25.000 células epiteliales luminales eran Clu
+, respectivamente (Figura 4A y 4D), indicando que en el desarrollo de próstatas el número de células progenitoras de linaje específico es mucho mayor que en próstatas totalmente maduros. La presencia de Clu
+ Tacstd2
+ Sca-1
+ células progenitoras luminales en próstatas adulto normal hace que estas células candidatos entre los cuales focos hiperplásicos se desarrollan en
PSA-Cre; PTEN-loxP /+
ratones, debido a la inactivación de la segunda
PTEN
alelo.
Clu
+ Tacstd2
+ células progenitoras epiteliales luminales en próstatas normales jóvenes (4-5w) eran más caracterizado por estudios de co-localización. pAkt sobreexpresión en Clu
+ Tacstd2
+ células en la capa de células epiteliales luminales de próstatas normales no se observó (Figura 4E-4F). Sin embargo, al igual que las células hiperplásicas en
PSA-Cre; PTEN-loxP /loxP ratones
, Clu
+ Tacstd2
+ células en la capa de células epiteliales luminales de próstatas normales CK8 sobreexpresada (Figura 4 G-4H ). Clu
+ células se encontraron exclusivamente en la capa celular epitelial luminal, mientras que Tacstd2
+ células estaban presentes tanto en el luminal y la capa de células epiteliales basales (Figura 4G-4J, y la figura S4). Recientemente, la alta expresión de Tacstd2 se ha identificado en las células epiteliales basales de la próstata proximal, pero no en las células epiteliales basales en la próstata más distal [38].
focos hiperplásicos no desarrollan a partir de células epiteliales en el proximal próstata
la región proximal de la próstata del ratón ha sido propuesta como un nicho de células madre /progenitoras [28] - [30]. Una vista esquemática de las partes proximal y distal de un lóbulo de la próstata de ratón se muestra en la Figura 5A. Se estudiaron las propiedades de las células epiteliales de la próstata proximal con más detalle en
PSA-Cre;. PTEN-loxP /loxP
ratones y hermanos de camada normales
(A) Imagen esquemática de un lóbulo de la próstata de ratón que indica la uretra, el proximal y la región de la próstata distal. eosina (B) Heamatoxylin de un lóbulo de la próstata del ratón longitudinal posicionado. Aumentos de la distal (B1) y la próstata proximal (B2), como se indica en B, mostraron una diferencia en la morfología de las células epiteliales luminales en los extremos proximal y distal de la próstata. análisis (C-E) inmunohistoquímica de las células epiteliales luminales en la región proximal de una próstata normal de ratón. (C) p63; (D) CK8 y (E) Sca-1 tinción. Las líneas discontinuas indican la transición brusca del epitelio de la proximal a la próstata distal.
como se visualiza en las secciones longitudinales de lóbulos normales de la próstata, células epiteliales luminales en la próstata proximal son más compactos con menos de citoplasma luminal las células en las partes distales de la próstata (Figura 5B). Al igual que en la próstata distal, en la próstata proximal una p63
+ capa de células epiteliales basales estaba presente por debajo de las células epiteliales luminales (Figura 5C). Curiosamente, todas las células epiteliales luminales en la CK8 de próstata proximal sobreexpresado (Figura 5D), como se observa en las células progenitoras luminal de linaje específico raros en la próstata distal y en las células hiperplásicas en
PSA-Cre; PTEN-loxP /loxP
ratones. Sca-1 también se expresa en las células de alta proximales (Figura 5E), lo que confirma que las células epiteliales luminales en la próstata proximal tienen un fenotipo progenitor luminal. Como se indica por la línea interrumpida (Figura 5C-5E), hay una transición brusca de las células epiteliales con características proximal a células con propiedades de las células epiteliales luminales más distales.
A continuación, el perfil de expresión de las regiones proximal y distal próstatas de adultos normales se realizó (Figura 6A). Sorprendentemente,
Ppp1r1b
,
Clu
,
WFDC2
y
Tacstd2
fueron algunos de los genes con la más alta expresión en la próstata proximal. expresión serie de datos fueron confirmados por QPCR (Figura 6B). Como se describió anteriormente, estos marcadores también se sobreexpresa en células de la próstata hiperplásica acumulados de
PSA-Cre; PTEN-loxP /loxP ratones
(Figura 1) y en las células progenitoras luminales raras en la próstata distal (Figura 4). La inmunohistoquímica mostró alta expresión Clu, Tacstd2 y Ppp1r1b en las células epiteliales luminales de la próstata proximal (Figura 6C-6E). Los datos de la matriz de ADNc confirmaron alta expresión de la luminal progenitor marcadores de células CK8 y Sca-1 en la próstata proximal (datos no mostrados). En conclusión, se detectó una correlación entre el perfil de marcador en próstatas hiperplásicas de
PSA-Cre;. PTEN-loxP /loxP ratones
, las células progenitoras de linaje específico raras en la próstata distal y las células epiteliales luminales proximales
(a) Expresión de perfiles de la región proximal y distal de próstata de una próstata normal de ratón (4-5m) muestra que los genes expresados en alta próstatas hiperplásicas de
PSA-Cre; PTEN-loxP /loxP
ratones se encuentran entre las diez genes con la expresión más alta en dos próstatas proximal en comparación con dos próstatas distales. (B) análisis de los marcadores de QPCR hiperplasia con alta expresión en la próstata proximal. (C-E) El análisis inmunohistoquímico confirma la alta expresión de marcadores de células hiperplásicas en la capa celular epitelial luminal de la región proximal de la próstata normal. tinción (C) Clu de un lóbulo de la próstata normal (C1) de aumento de la transición de la proximal a la región distal como se indica en C. La tinción para (D) Ppp1r1b y (E) Tacstd2. el desarrollo de la hiperplasia no se produjo en la próstata proximal de
PSA-Cre; /loxP
ratones PTEN-loxP (4-5m). Proximales células epiteliales luminales de las próstatas hiperplásicas fueron negativos para pAkt (F, magnificación de transición proximal /distal de próstata en la F1), aunque estas células sobreexpresan (G, G1) Clu, (H) y Ppp1r1b (I) Tacstd2.
Hemos investigado en
PSA-Cre; PTEN-loxP /loxP
ratones (4-5m) si focos hiperplásicos desarrolló a partir de las células epiteliales luminales en la próstata proximal. Secciones longitudinales de próstatas mostraron que, a pesar de la próstata distal estaba completamente hiperplásico, el epitelio de la próstata proximal no se vio afectada (Figura 6F-6I). La inmunohistoquímica mostró que, a diferencia de la próstata distal, pAkt no se sobreexpresa en la próstata proximal (Figura 6F), lo que indica que
Pten
no se inactiva en esta región de la próstata.
Además , se determinó el perfil de marcador de las células epiteliales en el epitelio uretral adyacentes a la próstata proximal. En la capa superficial diferenciada del urotelio, las células paraguas, se observó expresión de alto CK8. La más alta expresión de p63, Clu, Tacstd2 y Sca-1 se encontró en las capas de células epiteliales intermedias /basal (Figura S5). Los datos de la uretra se extienden los datos de expresión de próstata que indican que Clu, Tacstd2 y Sca-1 muestran una alta expresión en el epitelio menos diferenciadas.
Discusión
En este estudio se definieron las primeras etapas de desarrollo en la hiperplasia
PSA-Cre; PTEN-loxP /loxP
modelo de ratón de cáncer de próstata. Se abordaron secuencialmente aspectos importantes del desarrollo de la hiperplasia temprana y el desarrollo normal de la próstata. Hemos demostrado que: (i) La acumulación de hiperplásicas pAkt
+ células en próstatas de
PSA-Cre; PTEN-loxP /loxP
ratones tienen un fenotipo luminal de las células epiteliales con expresión de marcadores conocidos y nuevos identificados de epitelio células progenitoras. (Ii) El primer sencillo pAkt
+ (PTEN
-) células hiperplásicas en la próstata de jóvenes en cuestión
PTEN
ratones knockout son exclusivamente presente en la capa de células epiteliales luminales. (Iii) a baja frecuencia, en la próstata normal, las células similares, pero sin la sobreexpresión pAkt, pudieron ser identificados. (Iv) Nuestros datos indican además que
Pten
inactivación inhibe la diferenciación de las células progenitoras epiteliales luminales para madurar células. (V) Se observó que la capa de células epiteliales de la próstata luminal proximal se compone de células que expresan los mismos marcadores como las células progenitoras raras en las regiones de la próstata más distales. Sin embargo, los focos hiperplásico no se desarrolló a partir de la próstata proximal.