Extracto
La amigdalina diglucósido cianogénico, derivados de granos Rosaceae, es empleado por muchos pacientes como un tratamiento alternativo contra el cáncer. Sin embargo, si la amigdalina de hecho actúa como un agente anti-tumor no está claro. Metástasis propiedades de la amigdalina en líneas celulares de cáncer de vejiga de bloqueo se, por lo tanto, investigó. La amígdala (10 mg /ml) se aplicó a UMUC-3, TCCSUP o RT112 células de cáncer de vejiga durante 24 h o durante 2 semanas. Se examinó la adhesión de células tumorales al endotelio vascular o al colágeno inmovilizado, así como la migración de células tumorales. también se determinaron los efectos del tratamiento farmacológico sobre la integrina α y ß subtipos, en la integrina-quinasa vinculada (CIC) y total y activado quinasa de adhesión focal (FAK). Integrina derribo se llevó a cabo para evaluar la influencia de la integrina en la migración y adhesión. A 24 h o aplicación amigdalina 2 semanas claramente reducida adhesión de células tumorales y la migración de las células UMUC-3 y RT112. adhesión TCCSUP también se redujo, pero la migración fue elevado bajo la amigdalina. expresión subtipo integrina fue significativamente y específicamente alterado por la amigdalina dependiendo de la línea celular. De ILK fue moderadamente, y activado FAK fuertemente, pierde en todas las líneas de células tumorales en presencia de amigdalina. Golpear abajo de la integrina β1 causó una disminución significativa tanto en la adhesión y migración de UMUC-3 células, pero un aumento significativo en la adhesión TCCSUP. Golpear abajo de la integrina β4 causó una disminución significativa en la migración de las células RT112. Dado que las diferentes acciones de la amígdala en las diferentes líneas celulares fue reflejada por β1 o beta 4 derriban, se postula que las influencias amigdalina propiedades de adhesión y migración de las células del cáncer de vejiga mediante la modulación o β1 integrina β4 expresión. El aumento inducido por la amígdala en el comportamiento migratorio TCCSUP indica que los beneficios anti-tumorales de amigdalina (visto con las otras dos líneas celulares) pueden depender del tipo de células de cáncer
Visto:. Makarević J, J Rutz, Juengel E , Kaulfuss S, Tsaur I, Nelson K, et al. (2014) La amígdala influye en la adhesión celular y la invasión del cáncer de vejiga
in vitro
. PLoS ONE 9 (10): e110244. doi: 10.1371 /journal.pone.0110244
Editor: Zoran Culig, Universidad Médica de Innsbruck, Austria |
Recibido: 23 Junio, 2014; Aceptado: September 14, 2014; Publicado: 15 Octubre 2014
Derechos de Autor © 2014 Makarević et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el "Brigitta und Norbert Muth Stiftung" y el "Freunde und der Förderer Goethe-Universität Frankfurt" (financiación recibida por RAB). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El uso de la medicina complementaria y alternativa (CAM) ha aumentado de forma constante durante las últimas décadas. CAM incluye terapia no convencional, como la homeopatía, la terapia de vitaminas, phytomedicine y la medicina tradicional china, la acupuntura y el yoga [1]. El consumo de productos naturales se propaga más amplia. Hasta 80% de los pacientes de cáncer en los Estados Unidos [2], y más de 50% de los pacientes de cáncer en Europa utilizar CAM junto con o en lugar de la terapia convencional [3]. La insatisfacción con el tratamiento convencional y la reducción de los efectos secundarios de quimioterapia son las razones más comunes dadas para el uso de la CAM [4], [5].
En contraste con el amplio uso de compuestos naturales, información sobre su terapéutica efectividad es escasa. La discrepancia entre uso y beneficio de hecho es particularmente evidente con el amigdalina cianogénico diglucósido (D-mandelonitrilo-β-gentiobiósido), presente en los granos de los frutos de las especies Rosaceae tales como Prunus persica (melocotón), Prunus armeniaca (albaricoque) y Prunus amygdalus amara (almendra amarga). La amígdala primero fue aislado en 1873. Desde la década de 1920, la amígdala se ha aplicado por vía oral para tratar a pacientes de cáncer en los Estados Unidos. En la década de 1950, una forma intravenosa de la amígdala fue sintetizado y patentado como laetrilo [6]. Aunque laetrilo es químicamente diferente de la amigdalina, los términos se utilizan indistintamente, haciendo la interpretación de los datos clínicos difícil. El presente informe se refiere exclusivamente a "amígdala".
La amígdala fue uno de los más populares, los tratamientos no convencionales contra el cáncer en la década de 1970 y en 1978, 70.000 pacientes con cáncer de Estados Unidos habían utilizado la amígdala [7]. Aún así, la investigación basada en la evidencia en la amígdala era y es escasa y su beneficio controvertido. Los defensores consideran que la amígdala una cura natural del cáncer, mientras que los opositores advierten que la amígdala es ineficaz e incluso tóxicos. ensayos clínicos aleatorizados y estudios de seguimiento nunca se han llevado a cabo. Un estudio clínico patrocinado por el Instituto Nacional del Cáncer hace 30 años no reveló signos de regresión del tumor [8], mientras que un análisis retrospectivo de 67 pacientes con tumores que tienen la amigdalina informó completa 2 y 4 respuestas parciales [9]. La ambivalencia también se ha reflejado en los informes de casos, en los que la amígdala era ineficaz en cinco y efectiva en cuatro casos [6].
El presente estudio fue diseñado para evaluar si la amígdala altera la progresión metastásica de las células tumorales in vitro desde la invasión y la metástasis son pasos críticos en la progresión del tumor maligno y la principal causa de fracaso del tratamiento. Por lo tanto, interfiriendo con la cascada de invasión de células tumorales podría ser una opción innovadora para contrarrestar la difusión tumor metastásico. El empleo de un panel de líneas celulares de cáncer de vejiga, se evaluó la eficacia de la amigdalina para bloquear la interacción tumor-matriz y endotelial del tumor. Además, la capacidad de la amigdalina para prevenir la propagación de motilidad se evaluó. Una cohorte de moléculas de adhesión está implicado en el complejo proceso de difusión de las células tumorales. Dado que los receptores de adhesión de las integrinas α y β de la familia están estrechamente implicados en la penetración de células tumorales de unión y transendotelial, estos eran los objetos de investigación. El perfil de expresión del receptor de integrina membranosa, así como el contenido de proteína intracelular de cada subtipo, se comparó en amigdalina células tratadas y no tratadas. siRNA derribar estudios también se llevaron a cabo para investigar los parámetros alterados por la amígdala, que pueden tener relevancia clínica. Los datos in vitro presentados aquí apuntan a la adhesión y la invasión de los efectos de la amigdalina bloqueo significativa, probablemente inducidos por la alteración o β1 integrina β4 expresión.
Materiales y Métodos
Cultivo de células
RT112, UMUC-3 (ATCC /LGC Promochem GmbH, Wesel, Alemania) y TCCSUP (DSMZ, Braunschweig, Alemania) células de carcinoma de vejiga se cultivaron y se subcultivaron en medio RPMI 1640, 10% de suero de ternera fetal (FCS), mM tampón HEPES 20 , 1% glutamax y 1% de penicilina /estreptomicina (todos: Gibco /Invitrogen; Karlsruhe, Alemania). Se seleccionaron las subculturas de pasajes 7-24 para uso experimental. células endoteliales humanas (HUVEC) fueron aisladas de las venas umbilicales humanos y se recogieron por tratamiento enzimático con dispasa (Gibco /Invitrogen). HUVEC se cultivaron en medio 199 (M199; Biozol, Munich, Alemania), suplementado con 10% de FCS, 10% de suero humano agrupado, 20 mg /ml de factor de crecimiento de células endoteliales (Boehringer, Mannheim, Alemania), 0,1% de heparina, 100 ng /ml de gentamicina y mM tampón HEPES 20 (pH 7,4). Se seleccionaron las subculturas de pasajes 2-6 para uso experimental. HUVEC fueron utilizados en el estudio. El comité de ética institucional del Hospital de la Universidad Goethe, Frankfurt, Alemania, aprobó la investigación y renunció a la necesidad del consentimiento, ya que HUVEC se utiliza de forma anónima para ensayos in vitro sin ningún vínculo con los datos del paciente.
tratamiento amígdala
amigdalina de huesos de albaricoque (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania) estaba recién disuelto en medio de cultivo de células tumorales y luego se añadió a las células tumorales a una concentración de 10 mg /ml, ya sea para 24 h o durante 2 semanas [10 ] para evaluar aguda frente a tratamiento crónico. Los controles recibieron medio de cultivo de las células tumorales solas. En todos los experimentos, los cultivos de células tumorales tratadas se compararon con los no tratados queridos. Para excluir efectos tóxicos de la amígdala, la viabilidad celular se determinó por el azul de tripano (Gibco /Invitrogen).
Tumor adhesión celular
Para analizar la adhesión de células tumorales, HUVEC fueron transferidos a multiplacas de 6 pocillos ( Sarstedt, Nürnbrecht, Alemania) en HUVEC completa mediano. Cuando confluentes, RT112, las células UMUC-3 o TCCSUP se separaron de los matraces de cultivo por accutase tratamiento (PAA Laboratories, Cölbe, Alemania) y 0,5 × 10
6 células se añaden a la monocapa de HUVEC para 30, 60 o 120 min. Posteriormente, las células tumorales no adherentes se lavan usando calentado (37 ° C) Medio 199. Las células restantes se fijaron con glutaraldehído al 1%. las células tumorales adherentes fueron contados en cinco campos diferentes de un tamaño definido (5 x 0,25 mm
2) el uso de un microscopio de contraste de fase y la tasa media la adhesión celular se calculó.
Adjunto al colágeno inmovilizada
placas de 6 pocillos se recubrieron con colágeno G (extraído de piel de ternera, que consiste en 90% de colágeno de tipo I y 10% de colágeno de tipo III; Biochrom, Berlín, Alemania; diluido a 400 g /ml en PBS) durante la noche. platos de plástico sirvió como control de fondo. Las placas se lavaron con 1% de BSA (albúmina de suero bovino) en PBS para bloquear la adhesión celular no específica. 0,5 × 10
6 células tumorales se añade a cada pocillo y se dejó durante 60 minutos de incubación. Posteriormente, las células tumorales no adherentes se lavaron, las células adherentes restantes se fijaron con glutaraldehído al 1% y se contaron microscópicamente. La tasa media de adhesión celular, que se define por las células adherentes
pozo cubierto - Las células adherentes
fondo, se calculó a partir de cinco campos de observación diferentes
Medición del tumor migración celular
inducida por suero. movimiento quimiotáctico se examinó el uso de 6 pocillos Transwell cámaras (Greiner, Frickenhausen, Alemania) con 8- micras poros. 0,5 × 10
6 RT112, UMUC-3 o TCCsup células se colocan /ml en la cámara superior en un medio libre de suero, ya sea libres de la amigdalina (terminada "amigdalina A") o que contienen amigdalina (terminada "amigdalina B") . Medio libre de suero en la cámara superior y 10% de suero en la cámara inferior siempre que el gradiente de suero necesario para la migración de células tumorales en este modelo. Después de 20 h de incubación, la superficie superior de la membrana Transwell se limpió suavemente con un hisopo de algodón para eliminar las células que no habían migrado. Las células que se habían movido hacia el gradiente de suero a la superficie inferior de la membrana se tiñeron utilizando hematoxilina y se contaron microscópicamente. La tasa de migración media se calculó a partir de cinco campos de observación diferentes.
expresión superficial de integrina
Las células tumorales se lavaron en solución de bloqueo (PBS, BSA al 0,5%) y después se incubaron durante 60 min a 4 C con ficoeritrina (PE) conjugado con anticuerpos monoclonales dirigidos contra los siguientes subtipos de integrina: anti-a1 (IgG1; SR84 clon), anti-a2 (IgG2a; clon 12F1-H6), anti-a3 (IgG1; clon C3II.1), anti-α4 (IgG1; clon 9F10), anti-α5 (IgG1; clon IIA1), anti-α6 (IgG2a; clon GoH3), anti-β1 (IgG1; clon MAR4), anti-β3 (IgG1; clon VI-PL2 ) o anti-β4 (IgG2a; clon 439-9B; todo: BD Pharmingen, Heidelberg, Alemania). Integrina expresión de células tumorales fue entonces medido usando un FACScan (BD Biosciences, Heidelberg, FL-2H (log) de análisis del canal histograma; 1 × 10
4 células /scan) y se expresó como unidades de fluorescencia media. Un ratón IgG1-PE (MOPC-21) o IgG2a-PE (G155-178; todo: BD Biosciences). Se utilizó como un control de isotipo
Western Blot
Para investigar el contenido de la integrina, lisados de células tumorales se aplicaron a un gel de poliacrilamida al 7% y a electroforesis durante 90 min a 100 V. a continuación, la proteína se transfirió a membranas de nitrocelulosa. Después del bloqueo con leche en polvo no grasa durante 1 h, las membranas se incubaron durante la noche con los anticuerpos monoclonales mencionados anteriormente. Además, la señalización relacionada con la integrina fue explorada por anti-integrina ligada quinasa (la ILK; clon 3, dilución 1:1000), anti-quinasa de adhesión focal (FAK; clon 77, la dilución 1:1000) y anti-fosfo-específico FAK (pY397; clon 18, dilución 1:1000) anticuerpos (todos: BD Biosciences). HRP-conjugado de cabra anti-IgG de ratón (Upstate Biotechnology, Lake Placid, Nueva York, EE.UU., dilución 1:5.000) sirvieron como anticuerpo secundario. Las membranas se incubaron brevemente con reactivo de detección ECL (ECL ™, Amersham /GE Healthcare, München, Alemania) para visualizar las proteínas y luego analizadas por el sistema de fusión FX7 (Peqlab, Erlangen, Alemania). β-actina (1:1.000; Sigma, Taufenkirchen, Alemania). sirvió como control interno
software de Gimp 2.8 se utilizó para realizar el análisis de densidad de píxeles de las bandas de proteínas. Se calculó la relación de la intensidad de la intensidad de proteína /β-actina, y se expresa en porcentaje, en relación con los controles establecidos en el 100%.
siRNA derribar los estudios
Las células tumorales (3 × 10
5/6 pocillos) fueron transfectadas con ARN de interferencia pequeño (siRNA) dirigidos contra β1 integrina (2 M, secuencia diana: AAAAGTCTTGGAACAGATCTG, HS_ITGB1_5, Qiagen, Hilden, Alemania) o β4 integrina (2 M, secuencia diana: GTGGATGAGTTCCGGAATAAA; Hs_ITGB4_5 , Qiagen) con un reactivo de siRNA /transfección (reactivo de transfección HiPerFect; Qiagen) relación de 01:06. las células y las células tratadas con 5 nM siRNA control de la no tratada (Todas las estrellas siRNA control negativo; Qiagen) sirvieron como controles. Posteriormente, se analizó la adhesión de células tumorales al colágeno inmovilizada, así como la migración de células tumorales como se indicó anteriormente.
Estadísticas
Se realizó todos los experimentos 3-6 veces. La significación estadística se determinó por el-Mann-Whitney-U-test de Wilcoxon. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a un valor de p inferior a 0,05.
Resultados
La amígdala disminuye la interacción tumor-endotelio y la matriz tumoral
La amígdala reducido significativamente la unión de todas las células del cáncer de vejiga tres líneas a HUVEC en comparación con células no tratadas (fig. 1). La adhesión celular de TCCSUP y RT112 fue más fuertemente alterado por la amigdalina que la de UMUC-3 células. No hay diferencia entre el corto plazo (24 h) y largo plazo (2 semanas) de tratamiento amígdala era evidente. La capacidad de unión de UMUC-3, las células TCCSUP y RT112 a colágeno inmovilizado era también significativamente reducido regulado, en comparación con los controles (Fig. 2). La ampliación del período de tratamiento de 24 h a 2 semanas no aumentó aún más el potencial de bloqueo de la amígdala. No hay signos de toxicidad debida a la amígdala fue detectado por el ensayo de exclusión de azul de tripano.
Las células tumorales fueron tratados con 10 mg amigdalina /ml durante 24 h o durante 2 semanas. Los controles recibieron medio de cultivo celular solo. 0,5 × 10 células
6 tumorales /pocillo se añadieron a las monocapas de HUVEC para 0,5, 1 y 2 h. La media de las células tumorales adherentes de cinco campos se calculan y se representan como porcentaje del control del 100% (línea de puntos). Se muestra un representante de seis experimentos. * Indica diferencias significativas con los controles.
Las células tumorales se trataron con 10 mg amigdalina /ml durante 24 h o durante 2 semanas. Las células no tratadas con amigdalina servían como los controles. 0,5 × 10
6 células /pocillo se añadieron al colágeno inmovilizada durante 60 minutos. Se calculó el número medio de células tumorales adherentes de los cinco campos. Se muestra un representante de seis experimentos. * Indica una diferencia significativa con los controles.
La amígdala altera el comportamiento migratorio de las células tumorales
La exposición de las células tumorales a la amígdala durante 24 h no cambió su actividad migratoria (fig. 3) . Sin embargo, después de un periodo de pretratamiento de 2 semanas se redujo el número de células UMUC-3 y RT112 debajo de la membrana cámara Transwell, en comparación con las células de control no tratadas. El efecto inhibidor en UMUC-3 células fue más pronunciado cuando la amigdalina se mantuvo en el medio de cultivo celular durante la 20 h de incubación migratoria ( "amigdalina B"), en comparación con medio libre de amigdalina ( "amigdalina A"). Esta diferencia en la 20 h de incubación con o sin migratorio amigdalina no se detectó en las células RT112, donde la migración se bloqueó en un grado similar. En contraste con RT112 y UMUC-3 células, un aumento masivo de la migración celular TCCsup después se observó la amigdalina 2 semanas de tratamiento previo.
Las células tumorales tratadas con la amígdala durante 24 h o durante 2 semanas fueron sembradas en la cámara superior con una quimio-atrayente en el pozo inferior. Las células se les permite moverse durante 20 h, ya sea en la amigdalina libre medio (amigdalina-A) o en medio que contiene amigdalina-(amigdalina-B). Se contaron las células que migran a la superficie de la membrana inferior. Los controles se fijaron a 100%. Se muestra un representante de seis experimentos. * = Diferencia significativa con los controles.#= Diferencia significativa entre la amígdala y la amígdala-A-B.
La amígdala actúa sobre la integrina α y β expresión superficial
La integrina subtipos α2, α3, α5, α6, y β1 β3 se expresa fuertemente en UMUC-3 células, α4 se expresó de forma muy moderada y α1 y β4 no se expresaron (fig. 4, izquierda). La amígdala elevado α3 pero redujo α5, α6, β1 y β3, independiente del tiempo de exposición. Ninguna modificación inducida por la amigdalina se observó en la integrina α4. El receptor α2 se había reducido regulado después de 24 h, pero hasta reguladas después de 2 semanas de exposición amigdalina (fig. 4, derecha). TCCSUP células expresan claramente la α2, α3, α5, α6, y β1 integrina beta 4 miembros (fig. 5, izquierda). El tipo β3 fue moderadamente presente en la superficie celular. Ambos subtipos a1 y a4 no eran detectables. La amígdala dio lugar a un aumento significativo de la integrina α5, α6, β1 y β4 en TCCSUP, por lo que la aplicación de 2 semanas indujo efectos más fuertes que el 24 h de incubación (Fig. 5, a la derecha). Los subtipos a2 y beta 3 se han mejorado después de 2 semanas, pero no después de 24 h. α3 no fue alterada por la amígdala. RT112 células se caracterizan por un alto α2, α3, α6, β1 y β3 nivel de expresión (fig. 6, izquierda). α5 integrina se expresa moderadamente, y β3 fue sólo ligeramente elevado sobre el fondo. Las integrinas α1 y α4 no se expresaron en células RT112. El integrinas α3, α6, β3 y β4 fueron suprimidos por la amigdalina (fig. 6, derecha). Los efectos sobre α3 y β3 no dependen de si la amígdala se había aplicado durante 24 h o 2 semanas, mientras que α6 y β4 disminuyeron en mayor medida después de 2 semanas, en comparación con 24 h. α2 claramente aumentó después de 2 semanas, pero no después de 24 h, y α5 y β1 se mantuvo sin cambios por la amígdala.
El panel de la izquierda representa la expresión de la integrina como histogramas con una línea de puntos que indica la fluorescencia de fondo y una línea continua indica la fluorescencia específica en células no tratadas. El panel derecho muestra la expresión de subtipo de integrina después de 24 h y 2 semanas de exposición amigdalina, en comparación con los controles fijados en 100%. Carolina del Norte. = No calculado. * Indica una diferencia significativa con los controles.
El panel izquierdo representa la expresión de la integrina como histogramas con una línea de puntos que indica la fluorescencia de fondo y una línea continua indica la fluorescencia específica. El panel derecho muestra la expresión de subtipo de integrina después de 24 h y 2 semanas de exposición amigdalina, en comparación con los controles fijados en 100%. Carolina del Norte. = No calculado. * Indica una diferencia significativa con los controles.
El panel izquierdo representa la expresión de la integrina como histogramas con una línea de puntos que indica la fluorescencia de fondo y una línea continua indica la fluorescencia específica. El panel derecho muestra la expresión de subtipo de integrina después de 24 h y 2 semanas de exposición amigdalina, en comparación con los controles fijados en 100%. Carolina del Norte. = No calculado. * Indica una diferencia significativa con los controles.
Modificaciones de proteínas integrinas por la amigdalina
Las alteraciones del contenido de proteína integrina inducida por la amigdalina se muestra en la Figura 7 (a la izquierda) y la cuantificación se expresa como porcentaje de diferencia entre las células tumorales de control y las células tumorales tratadas con la amigdalina (derecha). En UMUC-3 células, α6 y β3 fueron suprimidos por tanto la aplicación como la amígdala 24 horas y 2 semanas, mientras que α2 y β1 fueron reguladas. Un aumento inducido amigdalina en α5 era evidente, pero este efecto se limita a la aplicación amigdalina 2 semanas. integrina α3 fue ligeramente mayor respecto a los controles después de 24 h, pero no después de 2 semanas. El integrinas α1, α4 y β4 no eran detectables por Western Blot. La integrina relacionados con las proteínas de señalización y İlk pFAK disminuyeron después de la aplicación 2 semanas amigdalina. Una acción similar se ejerce sobre las células TCCSUP, ya α2, α5 y β1 aumentaron y β3 disminuyeron bajo la amigdalina (2 semanas & gt; 24 h). En contraste con UMUC-3, α6 se mejoró después de 24 h, pero redujo después de 2 semanas. β4, no se expresa en UMUC-3, se redujo reguladas por la amigdalina (2 semanas & gt; 24 h). La aplicación amigdalina 2 semanas condujo a una pérdida de pFAK y ligeramente disminuido de ILK. Evaluación de RT112 indicó incremento de la integrina α2 causada por las 24 h de tratamiento o amigdalina de 2 semanas. a6 y beta 4 integrinas se redujeron regulado con 2 semanas & gt; 24 h. También había un ligero aumento de α3 después de 24 h, pero no después de 2 semanas, un fenómeno también se observa en UMUC-3 células. Opuesto a UMUC-3 y TCCSUP, el subtipo α5 en RT112 fue sólo moderadamente detectable en las células control y se redujo aún más después del tratamiento de drogas. La amígdala influenciada adicionalmente relacionados con la señalización de la integrina en RT112, evidenciado por una disminución de la FAK y pFAK.
Los controles se mantuvieron sin tratar. ß-actina sirvió como control interno. La figura muestra un representante de tres experimentos separados. Dakota del Norte. indica "no detectable". La cuantificación de la expresión de la integrina subtipo se muestra a la derecha. densidad de píxeles se da en porcentaje en comparación con los controles no tratados con la amígdala. * Indica un aumento significativo después de tanto 24 horas y 2 semanas de tratamiento amigdalina, #indicates disminución significativa después de tanto 24 horas y 2 semanas de tratamiento amigdalina, en comparación con los controles.
β1 integrina β4 y desmontables
la amígdala se altera claramente el perfil de expresión de la integrina de todas las líneas celulares de cáncer de vejiga tres. Para investigar si las modificaciones de integrinas son relevantes para la progresión metastásica, tumbar los estudios fueron llevados a cabo con los miembros de la integrina beta-sirviendo como representantes. Desde β1 (pero no β3 y β4) fue altamente expresado en el control UMUC-3 y TCCSUP y disminuido de manera significativa por la amigdalina, β1 fue derribado en estas células y experimentos de adhesión y migración repetidas (Fig. 8). La integrina β1 también fue altamente expresado en RT112 pero no modificado por la amígdala, en contraste con beta 4, que cumple ambos criterios, es decir, de alta expresión inicial y de modulación significativa por la amígdala. Por lo tanto, β4 fue derribado en la línea celular RT112 antes de sometimiento al ensayo de adhesión y migración (fig. 8, abajo a la derecha). La pérdida de β1 fue acompañada por una reducción significativa en UMUC-3 de unión (fig. 8) y la migración (fig. 9). Por otra parte, la unión a colágeno TCCSUP se mejoró (fig. 8), mientras que la migración TCCSUP no fue influenciado por β1 derribar (fig. 9). Abajo-regulación de la integrina β4 en células RT112 no alteró las propiedades de adhesión (Fig. 8), pero la migración masiva bloqueado (fig. 9).
Las células tumorales fueron transfectadas con β1 integrina beta 4 o siRNA. las células no tratadas (control) y células tratadas con siRNA (siRNA control) revueltos sirvieron como controles. La eficacia de la caída del receptor se evaluó mediante Western Blot (inferior derecha). Se muestra un representante de seis experimentos. * Indica una diferencia significativa con los controles.
Las células tumorales fueron transfectadas con β1 integrina beta 4 o siRNA o siRNA revueltos (siRNA control). Controles permaneció sin tratar (control). Los valores se muestran como células migraron por 0,25 mm
2. Se muestra un representante de seis experimentos. * Indica diferencia significativa con el control sin tratar. La pieza de inserción tomada de la figura 8.
Discusión
Dado que la interacción de las células tumorales con el endotelio vascular es necesaria para que las células tumorales dejan el torrente sanguíneo para el establecimiento en los sitios secundarios, lo que interfiere con este proceso es crucial para impedir la metástasis. El presente informe muestra que la amígdala inhibe significativamente la unión de las células de cáncer de vejiga a las células endoteliales. Desde amigdalina reduce el número de células tumorales, menos células pueden arrastrarse debajo de la capa endotelial de establecer contacto con proteínas de la matriz a la metástasis. El siguiente paso en la metástasis implica la matriz de colágeno. La interacción de las células tumorales con colágeno no sólo debe ocurrir para escapar del tumor primario, sino también para permitir la difusión invasivo en el órgano diana, una vez que las células tumorales han atravesado la barrera endotelial en la sangre [11]. En presencia de la amigdalina, las células tumorales utilizadas en la presente investigación perdieron su capacidad de unión a colágeno inmovilizado. Por lo tanto, la amigdalina puede retardar la progresión metastásica mediante la prevención de contactos mecánicos de células tumorales circulantes a la pared del vaso y la matriz subendotelial. diseminación del tumor, sin embargo, no se limita a la unión. Las células también deben desprenderse de proteínas de la matriz de invadir los tejidos. La amígdala influyó en la capacidad de migración de todas las líneas celulares de cáncer de vejiga después de 2 semanas, pero no después de 24 h, lo que indica que el tratamiento a largo plazo puede ser necesario alterar la motilidad de células tumorales.
acción de amígdala en la célula tumoral diferente líneas no eran idénticos. La migración de UMUC-3 y RT112 fue bloqueado, mientras que el número de células que migran TCCSUP aumentó con la amigdalina. Esto significa que aunque la amigdalina disminuye la tasa de unión en todas las líneas celulares de cáncer, existe el riesgo de que la exposición crónica a la amigdalina unas pocas células restantes de un subtipo de tumor particular como TCCSUP puede dar lugar a aumento de la actividad locomotora. Ya sea debido a una resistencia adquirida o intrínseca o debido al desarrollo de los bucles de realimentación no deseada no está claro, pero esto indica que no todos los pacientes con cáncer de vejiga pueden beneficiarse igualmente bien a partir de la amigdalina. En línea con esta especulación, recientemente se ha demostrado que el desarrollo de resistencia se acompaña de un interruptor funcional de los receptores de integrina, conduciendo las células tumorales a alta motilidad [12].
Chen et al. Recientemente especularon que las células tumorales con una alta velocidad de migración son mucho más propensos a sufrir metástasis que aquellas con una velocidad baja migración [13]. Esto, sin embargo, no pudo ser confirmado por otra investigación en la que el número de células tumorales que migran y la distancia y la velocidad de la migración no se correlacionaron con el potencial maligno de las células tumorales [14]. Más bien, la dirección de la motilidad celular indica el potencial maligno de las células del cáncer [14]. Para lograr una mejor comprensión, apenas se han iniciado estudios en animales para explorar la progresión tumoral in vivo en tratamiento en la amígdala.
El papel de las integrinas en la formación de enlaces célula-célula y célula-matriz necesarias para la adhesión, la extravasación y la migración ha sido abordado [15], [16], por lo que la subunidad β1 integrina ha demostrado desempeñar un papel central en la línea celular de cáncer de vejiga T24. Sin embargo, no todas las líneas celulares de cáncer de vejiga se caracterizan por el mismo patrón de la integrina. En la presente investigación amigdalina modificado adhesión y migración y alterado los perfiles de expresión de integrinas de manera diferente en diferentes líneas celulares. β4 integrina no se expresó en UMUC-3, pero en RT112 y TCCsup, mientras que β3 fue sólo marginalmente detectable sobre RT112 pero fuertemente detectables en las células UMUC-3 y TCCSUP. Una investigación que implica la influencia de ácido valproico en la adhesión celular de la vejiga al colágeno [17], también ha revelado modificación del perfil de expresión de la integrina en función de la línea celular empleada. Otros investigadores han reportado diferentes subfamilias de integrinas en UMUC, T24, J82, RT-4, 253J y células Hu456 [18], [19]. Cada línea celular puede, por lo tanto, poseen un receptor configurado característica y tratamiento de drogas puede influir en la integrina subfamilias de manera diferente.
Las investigaciones sobre las células del cáncer de próstata han puesto de manifiesto que el perfil de la integrina inicial de un clon tumoral en particular puede determinar su respuesta molecular para tratamiento de drogas [20]. De hecho, la amigdalina influyó en la composición de la integrina de las células tumorales de vejiga evaluadas de manera diferente. En las células UMUC-3 β1 y β3 superficie expresión se ve disminuida por la amígdala, pero ha mejorado en las células TCCSUP. En las células RT112 β4 en lugar de β1 fue alterada por la amígdala. Intracelular y los niveles de membrana integrina también fueron afectados de manera diferente por la amigdalina en células UMUC-3 y TCCSUP. En UMUC-3 células intracelular integrina β1 se elevó y la expresión en superficie fue disminuida, lo que indica que la amígdala induce la translocación de β1 integrina lejos de la membrana de la superficie. En TCCSUP células beta 1 integrina expresión se incrementó tanto intracelularmente y en la membrana de la superficie. La amígdala induce una disminución de la integrina β3 intracelular en las células UMUC-3 y TCCSUP. expresión de superficie, sin embargo, no era el mismo, con UMUC-3 células que muestra una disminución inducida por la amigdalina en la integrina β3 y células TCCSUP que muestra un aumento. La translocación principal en las células TCCSUP desde el citoplasma a la membrana de la superficie parece, por lo tanto, a ser dirigido contra la integrina β3.
La eliminación de ciertos subtipos de integrina de la superficie celular no es el único mecanismo de regulación de la adhesión de las células cancerosas. el tráfico de integrina entre los compartimentos intracelulares y la superficie de la célula se ha demostrado que es un requisito previo necesario para la eliminación del receptor en la base de los salientes de células. El reciclaje de la integrina de nuevo al borde de la celda que conduce apoya la adhesión [21]. Un estudio preclínico sobre las células de cáncer renal ha demostrado que tanto el receptor de integrina arriba y abajo de la regulación puede conducir células cancerosas hacia la malignidad. En consecuencia, la intervención terapéutica dirigida a "re-translocación 'ciertas moléculas de integrina podría proporcionar una opción para prevenir la malignidad [22].
La importancia de las integrinas para la adhesión y migración fue demostrado por knock-down estudios sobre las integrinas beta con ya sea expresión de la superficie inicial alto o fuerte alteración inducida por la amígdala. Estos criterios se cumplieron para β1 en las células UMUC-3 y TCCSUP y para β4 en las células RT112. Supresión de β1 correlaciona bien con la reducción de la actividad de unión y la migración de UMUC-3, que es conforme a estudios in vitro con células T24 y 5637 [23], [24]. Por lo tanto, la pérdida de β1 puede ser un mecanismo por el que la amigdalina ralentiza la difusión tumor UMUC-3. TCCSUP células, sin embargo, se comportaron de manera diferente bajo un bloqueo β1. eventos a colágeno en realidad unión aumentada, lo que indica que este receptor en estos contactos células bloques de célula-célula o célula-matriz. integrina diferencial guiada comportamiento adhesivo de diferentes sublíneas tumorales se ha observado anteriormente. El bloqueo de la subunidad α3 se ha demostrado que inhiben la unión de las células del cáncer de vejiga HCV29 a la laminina y la fibronectina proteínas de la matriz, pero tiene un efecto opuesto sobre la adhesión celular T24 y Hu456.