Extracto
5-fluorouracilo (5-FU) y su profármaco capecitabina han sido ampliamente utilizados en el tratamiento del cáncer colorrectal. Sin embargo, no todos los pacientes responden a la droga, por lo tanto, hay una necesidad de desarrollar biomarcadores predictivos tempranos fiables para la respuesta de 5-FU. Aquí, se presenta un novedoso enfoque funcional potencialmente polimorfismo de nucleótido único (pfSNP) para identificar SNPs que pueden servir como biomarcadores predictivos de respuesta a 5-FU en cáncer colorrectal metastásico Chino (CRC) de los pacientes. 1547 pfSNPs y una repetición variable de número en tándem (VNTR) en 139 genes en 5-FU de drogas (tanto PK y la vía PD) y vías de la enfermedad del cáncer colorrectal se examinaron en 2 grupos de pacientes con CRC. La contracción de la metástasis hepática medida por los criterios RECIST se utilizó como el punto final clínico. Se encontraron cuatro pfSNPs no respondedor específicos para dar cuenta de un 37,5% de todos los no respondedores (P & lt; 0,0003). Cinco pfSNPs adicionales fueron identificados a partir de un modelo multivariado (AUC bajo ROC = 0,875) que se aplicó a todos los otros pfSNPs, con exclusión de los no respondedores pfSNPs-específica. Estos pfSNPs, que pueden diferenciarse de los demás no respondedores de respondedores, residen principalmente en los genes supresores tumorales o genes implicados en el riesgo de cáncer colorrectal. Por lo tanto, un total de 9 nuevos SNPs con potencial importancia funcional puede ser capaz de distinguir no respondedores de respuesta para 5-FU. Estos pfSNPs pueden ser biomarcadores útiles para predecir la respuesta a 5-FU
Visto:. Wang J, Wang X, Zhao M, Choo SP, Ong SJ, Ong SYK, et al. (2014) SNP potencialmente funcionales (pfSNPs) como nuevo genómicas predictores de respuesta de 5-FU en pacientes con cáncer colorrectal metastásico. PLoS ONE 9 (11): e111694. doi: 10.1371 /journal.pone.0111694
Editor: Anthony W I. Lo, Queen Mary Hospital, Hong Kong
Recibido: 22 Julio, 2014; Aceptado: September 29, 2014; Publicado: 5 Noviembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca (SERC 112 148 0008) del Consejo de Investigación Biomédica de Singapur - Ciencia e Ingeniería de Investigación (BMRC-SERC) a a /Profesores Caroline Lee, Simon Ong, Yik Ying Teo y Samuel Chong. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Cada año, más de un millón de personas en todo el mundo va a desarrollar cáncer colorrectal [1], que representa el 10% de la carga mundial del cáncer. El cáncer colorrectal (CCR) es el cáncer más frecuentemente diagnosticado en Singapur (7.909 nuevos casos entre 2005-2009) [2]. Más de la mitad de los pacientes con CCR metastásico desarrollan la enfermedad (fase 4), ya sea en el diagnóstico o en la recidiva tras el tratamiento con intención curativa inicial. Esto se traduce en una proporción sustancial de pacientes que pueden necesitar tratamiento para la metástasis o recidiva del cáncer colorrectal.
5-fluorouracilo (5-FU) y su profármaco, capecitabina, son ampliamente utilizados en el tratamiento de CRC. Se ha propuesto que hay dos modos distintos de acción para 5-FU. En primer lugar, actúa como anti-metabolito mediante el cual su forma activa, FdUMP, producido por la timidina fosforilasa (timpa), inhibe la timidilato sintasa (TYMS). En segundo lugar, se puede inducir la muerte celular, por lo que la incorporación de sus productos activos y FUTP FdUTP en ARN y ADN, respectivamente, conduce a la posterior apoptosis celular [3]. La uridina monofosfato sintetasa (UMPS, también conocidos como OPRT) es responsable de la conversión de 5-FU a FUMP, que es la primera etapa de producir FUTP y FdUTP. Sin embargo, las dos vías pueden superponerse, porque el producto intermedio en la vía de "toxicidad celular", FUDP, también se puede convertir en FdUDP y posteriormente FdUMP y participar en la vía de "anti-metabolito". 5-FU se catabolized en la forma inactiva de DHFU por dihidropirimidina deshidrogenasa (DPYD), y DPYD es la enzima limitante de la velocidad en la degradación de 5-FU.
En la actualidad, no existen pruebas fiables para la predicción temprana de respuesta a 5-FU. El desarrollo de un biomarcador predictivo temprana fiable de la respuesta a la quimioterapia común, como 5-FU, en el cáncer colorrectal metastásico tiene el potencial de conducir a la adaptación adecuada de tratamiento para los pacientes individuales y nos ayudará a acercarse a una atención realmente personalizada. beneficios globales de costes económicos se realizan en ambos respondedores predichos y no respondedores. Respondedores reciben un tratamiento adecuado con la confianza de la respuesta esperada. Predicho no respondedores para evitar el tratamiento convencional desperdicia expensas de 3 ciclos de tratamiento fútil, toxicidades innecesarias que, ya que precisa recursos y pérdida de tiempo en términos de un tratamiento inútil y la pérdida de una ventana de oportunidad para un tratamiento eficaz. Estos pacientes pueden ser seleccionados como candidatos para las terapias innovadoras y quimioterapia de combinación.
Hasta el momento, solamente variantes en los genes "5-FU PD" se informó que se asoció significativamente con la eficacia de 5-FU medida por la reducción del tumor en algunos estudios [4] - [7]. Desafortunadamente, la réplica de dicha asociación descrita entre "5-FU PD" variantes de genes y la reducción del tumor sigue siendo un reto [4], [6], [8] - [13], lo que sugiere la posible presencia de otros loci en la determinación de 5-FU eficacia .
fue interesante observar que las variantes en los genes "5-FU PK" se investigaron principalmente por su asociación con la toxicidad 5-FU, no eficacia [14] - [17], a pesar de los niveles de expresión de estos genes de haber sido asociado previamente con 5-FU eficacia [18]. limitados esfuerzos [8], [19] intentaron explorar la posible asociación de la eficacia, pero fracasaron
.
Además, la mayoría de los estudios sobre la respuesta al tratamiento con 5-FU se centró principalmente en los SNP en unos pocos genes candidatos. Sólo un estudio examinó 21 variantes principalmente en la región de 11 genes implicados en el metabolismo /acción del 5-FU y otras vías farmacológicas relacionadas [19] de codificación. Sin embargo, este estudio todavía no interrogar exhaustivamente todas las posibles variantes que pueden estar implicados en la respuesta de 5-FU.
Otra limitación de los estudios actuales es que sólo los análisis univariados han, hasta ahora, ha empleado y esto puede no tener potencia suficiente para la detección de la asociación de respuesta a los fármacos con los SNP menos comunes /raras con el tamaño pequeño de la muestra. modelo multivariado se utilizó con éxito para estimar la dosis apropiada de warfarina basándose en datos clínicos y genéticos [20].
Por lo tanto, en este estudio, que emplean un enfoque novedoso interrogar SNP potencialmente funcionales (pfSNPs) en drogas y relevante vía de la enfermedad para identificar la asociación con la respuesta al fármaco. 1.547 SNP potencialmente funcionales + 1 VNTR (número variable de repeticiones en tándem) a partir de 139 genes en el fármaco (tanto PK y PD vía) y la enfermedad de las vías fueron examinados. Potencialmente se identificaron SNP funcionales utilizando el recurso pfSNP Web (http://pfs.nus.edu.sg/) [21] que incluía SNPs que se había informado anteriormente a ser funcional o asociada con la enfermedad de respuesta /drogas; SNPs que se infiere que es potencialmente funcional a partir de enfoques genéticos, así como los previstos para ser potencialmente funcional a partir de la secuencia de motivos.
Como se limitó el número de muestras, se empleó un diseño de estudio de dos pasos. En la primera etapa, se examinaron 62 pacientes que estaban sólo en capecitabina, un profármaco del 5-FU, para identificar SNPs interesantes que son marginalmente asociados con la respuesta al fármaco, medida por la reducción del tumor. Estos SNP fueron examinados en otro grupo de 27 pacientes que fueron tratados con 5-FU y oxaliplatino. Combinado de análisis multivariado y se hunde (CMC) se empleó para evaluar el menos común (≤5%), pfSNPs no respondedores-específica por su asociación con la respuesta al fármaco 5-FU, mientras que un modelo de regresión logística multivariante para cada parque basado Criterio de Información de Akaike (stepAIC ) procedimiento se utilizó para interrogar a los otros pfSNPs para su asociación con 5-FU respuesta a los fármacos en los pacientes que no cuenten con los pfSNPs no respondedores-específica.
Materiales y Métodos
las muestras de pacientes y parámetros clínicos
el encogimiento del tumor con metástasis al hígado CRC se utilizó como criterio de valoración clínico para medir la eficacia del tratamiento. Criterios de Evaluación de Respuesta en Tumores Sólidos (RECIST) [22] se utiliza para determinar la respuesta del tumor. En los pacientes reclutados, no hubo ningún paciente que pertenece a la categoría de "respuesta completa". Los pacientes con 'Respuesta Parcial' fueron considerados como respondedores '' y pacientes con Enfermedad progresiva "o" Enfermedad estable 'fueron clasificadas como "no respondedores" en el análisis de asociación.
Un total de 89 metastásico chino no relacionada CRC pacientes fueron reclutados. Todos los pacientes tenían metástasis en el hígado y se les dio la quimioterapia neoadyuvante antes de la operación para la lesión del hígado. La Tabla 1 muestra las características de los pacientes en cada estudio.
En el grupo 1, 62 pacientes chinos Etapa IV CRC no relacionados fueron reclutados. Estos pacientes fueron tratados sólo con capecitabina y que nunca han sido expuestos previamente a este medicamento. De estos 62 pacientes, 13 tuvieron una respuesta parcial, 31 tenían enfermedad estable, y 18 tenían enfermedad progresiva. Por lo tanto, la tasa de respuesta de este grupo de pacientes es solamente ~21%, lo cual es típico para el tratamiento de un solo agente [23]. ~79% De los pacientes eran varones y la edad media de la cohorte fue de 60 años.
En el grupo 2, 27 hepáticos chino pacientes con CCR metastásico no relacionados que fueron tratados con 5-FU (unos pocos tenían capecitabina) solo (algunos) o con el régimen de oxaliplatino (la mayoría) que se examinó su quimioterapia neoadyuvante. Algunos de estos pacientes también habían sido previamente expuestos a estos fármacos. De estos 27 pacientes, 12 tuvieron una respuesta parcial, siete tenían enfermedad estable, y ocho tenían enfermedad progresiva. Por lo tanto, la tasa de respuesta fue del ~ 45%, que es típico de los pacientes sometidos a terapia de combinación de 2 fármacos [24]. Dos tercios de estos pacientes son varones, y tenía una edad media de 62 años
Ética declaración
Este estudio ha sido aprobado por la Junta de Revisión Institucional SingHealth Centralizado (CIRB) (NO.: NC05-22 y 2005/421 /B).
Selección de los SNP potencialmente funcionales (pfSNPs) para estudio de asociación
El recurso pfSNP (http://pfs.nus.edu.sg/) [21] se empleó para identificar SNPs en los genes asociados con 5-FU /capecitabina, oxaliplatino, así como el cáncer colorrectal. Aproximadamente se encontraron 2800 pfSNPs en 214 genes que se asocia con palabras clave como "fluorouracilo", "5-fluorouracilo", "capecitabina", "platino", "oxaliplatino", así como "cáncer colorrectal". Como sólo 1.536 SNPs pueden ser genotipo dentro de un único personalizado matriz GoldenGate Genotipado (Illumina, Inc.), se emplearon los siguientes criterios para seleccionar un subconjunto de estos 2800 pfSNPs: todos los SNPs en el promotor, codificación, traduce un-5 '/3' regiones que tiene una puntuación GoldenGate (SGG: medida de la calidad del ensayo mediante su plataforma) fueron seleccionados de más de 0,5. Para los intrones, pfSNP con un SGG & gt; 0,7 fueron seleccionados y fueron excluidos los monomorfas reportados en la población HapMap CHB, a excepción de aquellos previamente reportado como funcional. Para cualquier SNPs adyacentes que pueden interferir unos con otros en el ensayo, se seleccionaron los SNP de acuerdo con el siguiente orden: "Anteriormente informó → No sinónimo Sinónimo → → → UTR Intrón". Una lista de todos los SNPs incluido en la matriz de GoldenGate está disponible como la Tabla S1.
Entre los marcadores que eran inadecuados para ser genotipados mediante ensayo GoldenGate, se seleccionaron 14 marcadores importantes en 5-FU predicción de respuesta para ser genotipo por otros métodos (listados en la Tabla S2). Los 14 marcadores incluyen el VNTR previamente bien estudiado con SNP incrustado [25], así como la 6bps 3 'UTR indel en el gen TYMS porque la tecnología GoldenGate sólo podía determinar el genotipo de SNPs. Otros marcadores son SNPs con puntuaciones bajas GoldenGate en los genes TYMS, timpa y DPYD. Un panel MassARRAY de Sequenom personalizado se utilizó para determinar el genotipo de 11 de los 14 marcadores y 1 SNP se genotipo por ABI TaqMan. Además, hemos desarrollado un nuevo método para determinar el genotipo de la VNTR (rs2853542) y embebidos SNP (rs34743033) en el gen TYMS. Este VNTR puede tener 2 o 3 repeticiones, y el SNP puede ocurrir tanto en la segunda y tercera repetición [26]. Hemos desarrollado un método robusto utilizando Sanger de secuenciación para este propósito. Un fragmento de 486 pb se amplificó usando los cebadores (F- CTGCTGGCTTAGAGAAGGCG y R- AGCGGAGGATGTGTTGGATC) y el amplicón se secuenció en ambas direcciones usando la cebadores directo e inverso. Diferentes genotipos cederían patrones distintos en el avance y retroceso de secuenciación lee (Como se muestra en la Figura S1), lo que permite el genotipo que se deduce fácilmente.
En resumen, había 1.536 marcadores (enumerados en la Tabla S1) con genotipo un único conjunto personalizado de genotipificación de Illumina GoldenGate SNP, 11 (listados en la Tabla S2) por MassARRAY de Sequenom, 1 (rs11479) por ABI TaqMan y el VNTR (rs2853542), con el SNP incorporado (rs34743033) se genotipo mediante secuenciación de Sanger.
la distribución de los SNPs y los genes seleccionados en las tres categorías (CRC, fluorouracilo y Platino relacionada) se representa en la figura S2. Más de la mitad de los SNPs (863) son de los genes relacionados con fluorouracilo y 702 SNPs son de genes relacionados con platino. Una parte considerable de los SNPs (656) son de genes relacionados con CRC, aunque 40% (32 de 80) de estos genes y 88% (579 de 656) de los SNPs están relacionados con fluorouracilo y /o platino, así .
El número de SNPs en cada región génica y la función categoría comprendida en este estudio se muestran en la Figura S3. Cada una de las cuatro regiones de genes, es decir, promotor, codificación, y el intrón 3 'UTR, están adecuadamente cubiertas en general. Por promotor y 3'UTR, la mayoría de los SNPs genotipo son los que cambian TF sitios de unión. En la región de codificación, los SNP que cambian ESE sitios /ESS son los SNPs más abundantes, y no sinónimos que causan efectos nocivos son el segundo más abundante. Los SNPs región intrón se enriquecen con los que tienen una firma de selección positiva reciente.
La distribución de los SNP alelo menor frecuencia para la intrónica frente región intrónica no se muestra en la Tabla S3. Para la codificación, 3'UTR, y regiones promotoras, un número de SNPs no genotipo previamente por HapMap ha sido genotipo en este estudio. A medida que el estudio tiene como objetivo explorar también las variantes raras, también se genotipo de un número de SNPs HapMap reportados por ser monomórficos. Para la región de intrón, ya que la mayoría de los SNPs son aquellos con una firma de selección positiva reciente, tienen MAF más de 5%. No nos genotipo de los muchos monomorfas dentro de intrones. Se analizaron
análisis individual marcador asociación
Hardy-Weinberg y la frecuencia del alelo menor usando la Calculadora de Estadística SNP basada en Microsoft Excel desarrollado internamente. El análisis individual marcador asociación se realizó mediante PLINK [27]. El valor P se calculó por el método basado en la permutación, y el odds ratio (OR) y sus correspondientes intervalos de confianza del 95% se determinó a través de asociación habitual a base de alelo análisis, debido a que el método basado en la permutación no proporciona dicha información. El genotipo de la VNTR (rs2853542) y embebidos SNP (rs34743033) en el gen TYMS se re-codificado como un SNP bi-alélica que comprende el alelo de alta expresión y el alelo de baja expresión de acuerdo con Kawakami et al [26].
Combinado multivariado y el colapso (CMC) análisis de SNPs que no responden específica
método que se derrumba (CMC) combinada multivariado y se propuso por primera vez como un método para el análisis de SNPs raras [28]. CMC utiliza la prueba t de Hotelling
2 para analizar más de 2 grupos de variantes colapsadas. Cuando se analizan sólo 2 grupos de esas variantes, la prueba exacta de Fisher se puede utilizar. En este estudio, se utilizó la prueba exacta de Fisher para evaluar si el alelo menor derrumbado de no respondedores SNPs específicos que son menos comunes (≤5% menor frecuencia de los alelos) sería un buen indicador de la capacidad de respuesta a 5-FU.
logística modelo multivariado de regresión con base utilizando el procedimiento Criterio de Información de Akaike (stepAIC) para predecir la respuesta al fármaco en los pacientes que no tienen SNPs no respondedores específica
los pacientes, que no tienen ninguno de los no respondedores SNPs específicos, se dividieron en 2 grupos. Los datos del primer grupo que comprende el 80% de los pacientes se utilizó para entrenar un modelo multivariable basado regresión logística utilizando el Criterio de Información de la Akaike (AIC) en un algoritmo por pasos (usando R paquete "stepAIC"), mientras que los datos del otro 20% de los pacientes se utilizaron para validar el modelo. El modelo seleccionado fue evaluada por el área bajo la curva (AUC) de las curvas características operativas del receptor (ROC). El punto de corte óptimo para la regresión logística se eligió la que se obtiene la suma máxima de sensibilidad y especificidad [29], [30].
Resultados y Discusión
Una alta concordancia (R se observó
2 = 0,9494) entre las frecuencias de alelos de SNPs en nuestro estudio y los de la CHB (chino en Pekín) en la población HapMap (Release 27) (figura S4) afirmando la calidad de nuestro genotipo. Una gran proporción de los SNPs examinados en este estudio eran o monomórfica (36%) o tenían una alta frecuencia del alelo menor (MAF≥0.1, 46%) (Figura S5). Setenta y dos y 66 SNPs en los grupos 1 y 2, respectivamente, se encontraron que se desvía significativamente de equilibrio de Hardy-Weinberg y se excluyeron del análisis adicional.
El genotipo fue exitosa (97-100%) asignados en 9 de 11 SNPs genotipo utilizando el MassARRAY de Sequenom. secuenciación de Sanger asignado correctamente genotipo de los SNPs 2 para todas las muestras, mientras que el ensayo TaqMan asignado correctamente genotipos a 96% de las muestras. Todos los SNPs genotipo con éxito por estos métodos se comprobó que estaban en equilibrio de Hardy-Weinberg.
Análisis individual SNP asociación identificó tres no respondedores SNPs específicos en el gen UMPS que puede representar el potencial biomarcador predictivo de la falta de respuesta a 5-FU
a medida que el número de muestras en este estudio fue pequeño, se empleó un método de validación cruzada, donde las muestras fueron separados en 2 grupos distintos para el descubrimiento y validación para mejorar la robustez de nuestros resultados.
se encontró un total de 36 SNPs en 12 genes están asociados con la respuesta al fármaco antes de la corrección de pruebas múltiple en pacientes del Grupo 1 (tabla 2). A medida que el tamaño de la muestra fue pequeño (n = 62), ninguno de estos marcadores fueron estadísticamente significativas después de la corrección de Bonferroni.
Sin embargo, había 68 pfSNPs de baja frecuencia en el grupo 1 que se encontraron sólo en forma única no -responders (no respondedor específica pfSNP). Para evaluar si cualquiera de estos pfSNPs no respondedores específicos pueden representar potencial biomarcador predictivo de la falta de respuesta a 5-FU, se analizó un segundo grupo de 27 pacientes. De estos 68 pfSNPs específicos no respondedores, 24 permanecieron-no respondedor específica, incluso en el Grupo 2 y éstas se presentan en la Tabla 3. Sin embargo, sólo 3 de los SNPs no respondedores-específica en el gen uridina monofosfato sintetasa (UMPS), a saber, rs2291078 (e /4 /T1050A C350 *), rs3772809 (e /6 /A1336G H446Y) y rs3772810 (E6 /3UTR /A28G) (Tabla 2, SNPs 42-44) (Tabla 3, SNPs 1-3) se encontraron para ser estadísticamente significativa (p = 0,036 antes de la corrección de pruebas múltiple) en el Grupo 2. Cuando los 2 grupos de pacientes se combinaron y analizaron, estos 3 SNP se mantuvo estadísticamente significativa (p = 0,032 antes de la corrección de pruebas múltiple). La observación de que, de un total de 89 pacientes en el grupo combinado, no se encontraron respuesta para llevar este alelo sugiere que este alelo puede ser un alelo "causal" para determinar la respuesta a 5-FU. Los datos no estadísticos significativos obtenidos (después de la corrección de pruebas múltiples) sugiere que esto puede no ser el único alelos "causales" de respuesta de 5-FU y probablemente hay otros alelos que también juegan un papel en la respuesta de 5-FU que sugieren "heterogeneidad locus "de respuesta a 5-FU.
el gen UMPS es importante en la determinación de la respuesta 5-FU, ya que convierte 5-FU en su metabolito activo, FUMP, que puede participar tanto en la toxicidad celular vía, así como en la vía de "anti-metabolito". En la vía de la toxicidad celular, FUMP se puede convertir adicionalmente en FUTP y FdUTP que se incorpora a continuación en el ARN y el ADN, respectivamente. En la vía "anti-metabolito", FUMP se puede convertir en FdUMP e inhibe TYMS.
Estos 3 alelos en el gen UMPS están en ocurrirá juntos todo el tiempo perfecto desequilibrio de ligamiento (LD) y por lo tanto. Las funciones moleculares predichos de los tres alelos únicos para los no respondedores están todos asociados con la alteración de la función génica UMPS y apoyan su presencia única en los no respondedores (Figura 1).
La un alelo de rs2291078 (UMPS E /4 /T1050A C350 *) se predijo para crear un codón de parada en el exón 4 del ARNm UMPS. mRNA UMPS que contiene este codón de parada se puede degradar rápidamente desde codón de parada que aparece más de 50 bps de la última unión exón-exón induciría mediada la decadencia no sentido de ARNm [31]. Por lo tanto, los pacientes portadores de este alelo pueden tener menor ARNm y proteínas UMPS abundancia.
La co-ocurrencia de rs3772810 3'UTR pfSNP (UMPS E6 /3UTR /A28G) con este rs2291078 pfSNP sugiere que la expresión de esta gen puede ser atenuado más allá. El alelo G del SNP rs3772810 3'UTR (UMPS E6 /3UTR /A28G) se predice para crear sitios de unión para miARN 23a, 23b y 130 A *. La 23a miARN se muestra para estar regulado bajo condiciones hipóxicas se encuentran comúnmente en los tumores [32]. En particular, una publicación reciente informó que 23a miRNA está regulado en el cáncer colorrectal metastásico [33] lo que sugiere que los pacientes con el alelo G pueden ser no sensible a 5-FU desde 23a miARN puede suprimir la expresión de UMPS mRNA que contiene el alelo G .
también co-produciendo con estos 2 pfSNPs, es la no sinónimo rs3772809 pfSNP (UMPS E /6 /A1336G H446Y) que tienen el potencial de alterar la función del gen UMPS. Por lo tanto, estos 3 pfSNPs concurrentes, que representaron el 17,2% del total de los no respondedores tienen el potencial de ser las variantes causales que afectan a la función de UMPS y por lo tanto la respuesta a 5-FU aunque se requieren más experimentos para validar la funcionalidad potencial de estos pfSNPs.
Combinado multivariado y el colapso (CMC) análisis revelaron que un mínimo de cuatro pfSNPs específicos no respondedores que no están en equilibrio de ligamiento puede distinguir de manera significativa de los no respondedores respondedores
procedió a determinar si la combinación de pfSNPs específicos no respondedores (Tabla 3) puede dar cuenta de un mayor porcentaje de 5-FU no respondedores a los anteriormente citados 3 no respondedores pfSNPs Umps específicos en perfecto LD que muestran significación estadística (antes de múltiples correcciones de pruebas ). Desde los Umps pfSNPs específicas 3 no respondedores están en perfecto LD, sólo uno fue seleccionado para otros análisis. a continuación, identificamos el número mínimo de pfSNPs específicos no respondedores adicionales a partir de la Tabla 3 que se pueden tener en cuenta el porcentaje máximo de 5-FU no respondedores y empleado multivariable combinada y se hunde (CMC) análisis [28] para determinar su significación estadística.
en particular, otros tres pfSNPs específicos no respondedores junto con uno cualquiera de los no respondedores pfSNPs específicos Umps se encontraron para dar cuenta de un 37,5% de todos los no respondedores a partir de los 2 grupos de pacientes (Tabla 4). Los análisis de CMC reveló significación estadística (p = 0,0003) de estos pfSNPs 4 no respondedores específicos (3 UMPS no más uno cualquiera de los 3 Umps pfSNPs) que sugieren una asociación significativa de estos pfSNPs con la falta de respuesta.
rs3218592 SNP provoca un cambio de aminoácido no conservadora en el gen REV3L que codifica la subunidad catalítica de la ADN polimerasa Zeta. ADN polimerasa Zeta se informó a ser significativamente las reguladas en el cáncer colorrectal humano [34] y se sugirió a ser un gen supresor tumoral [35]. El alelo T del rs3218592 (E /26 /C8285T, R2762Q) que se encuentra únicamente en no respondedor en nuestro estudio se prevé que sea perjudicial para la función de las proteínas por tanto Polyphen [36] y SIFT [37]. por lo tanto la hipótesis de que los pacientes portadores de este alelo deletéreo tendrían una enfermedad más agresiva y por lo tanto son más propensos a ser no sensible al tratamiento
.
pfSNP (rs8071253) reside en la región promotora de TK1 y se prevé que crear un xenobiótico estrés activa la transcripción sitio de unión TGA1a.
el tercer SNP (rs501415) se encuentra dentro del primer intrón del WDR7 y se prevé que interrumpir AML1 (RUNX) factor de transcripción sitio de enlace. Ya que toda la familia comparten RUNX el mismo sitio de unión (TGt /CGGT) [19], se postula que este SNP también puede afectar a la unión de RUNX3. RUNX3 había sido aclamado como un gen supresor tumoral y la expresión de RUNX3 reducida ha sido previamente asociado con una peor supervivencia en pacientes con cáncer de colon [38]. No obstante, el papel de WDR7 en la resistencia a 5-FU sigue siendo poco clara. Se informó de que se asocia con 5-FU por PharmGKB [39], pero la publicación [39] fue recientemente retraída [40].
El modelo multivariado basada en regresión logística identificó un 5 pfSNPs adicionales que no son no -responder específicos que pueden distinguir los respondedores de los no respondedores
Además de los pfSNPs específicos no respondedores que están asociados con los pacientes que no responden al 5-FU, se procedió a identificar pfSNPs adicionales que pueden estar asociado con 5-FU respuesta a los fármacos mediante la formación de un modelo multivariado de regresión logística basada en el método stepAIC utilizando datos de los otros pfSNPs. El modelo multivariado identificó 5 pfSNPs adicionales, a saber, rs2289310 (DLG5, E /23 /G4442T, P1481Q), rs1047840 (EXO1, E /12 /G1765A, E589K), rs17431184 (PTEN, I /7 /T-400C), rs2236722 (CYP19A1, e /2 /A115G, W39R) y rs17160359 (ABCB1, 5UR //G-4254T) (Tabla 5) que pueden distinguir los respondedores de los no respondedores. El AUC (área bajo la curva) de la República de China (Receiver Operating Characteristic) Curva de estos SNPs 5 es 0,875 (Figura 2). Un valor predicho de 0.794 fue identificado como el punto de corte óptimo para predecir la respuesta al fármaco, con una sensibilidad del 62,5% y una especificidad de 100%. Con este umbral, el modelo multivariable basado en la logística puede identificar correctamente el 39,1% (25/64) de los no respondedores. Junto con el 37,5% de los no respondedores predichos por los SNPs no respondedores-específica, un total de 76,6% (49/64) de los no respondedores puede ser identificado correctamente por ambos modelos.
El ABC de la curva ROC es 0.875. El punto de máxima suma de sensibilidad y especificidad se destaca por el círculo verde en la curva ROC. La sensibilidad y la especificidad correspondiente es del 62,5% y 100% respectivamente.
Es de destacar que los SNPs en el modelo multivariado se localizan principalmente dentro gen supresor de tumores (PTEN) o en los genes que son principalmente asociado con cáncer colorrectal (DLG5, EXO1, CYP19A1 y ABCB1) (Tabla 5). En particular, uno de la no-respuesta específica SNP (rs3218592, REV3L E /26 /C8285T, R2762Q) (Tabla 4) que reside en el gen, Rev3L, también se ha implicado a ser un gen supresor de tumores [41].
El PTEN (fosfatasa y homólogo de tensina) gen es un conocido gen supresor de tumores que se informó recientemente para controlar la reparación del ADN y la sensibilidad al estrés genotóxico [42]. La mayor frecuencia del alelo C en los respondedores (26% en los respondedores vs. 12% en los no respondedores) sugiere que los pacientes con este alelo pueden exhibir menor tolerancia a estrés genotóxico causado por agentes que dañan el ADN como 5-FU.
el DLG5 (discos grandes homólogo 5) gen codifica un miembro de la familia asociada a la membrana guanilato quinasa (MAGUK) de las proteínas de andamiaje que está implicado en el mantenimiento de la integridad epitelial [43]. El alelo T de rs2289310 (DLG5, E /23 /G4442T, P1481Q) provoca un cambio no conservadas de aminoácidos en la proximidad de uno de los dominios PDZ en este gen (aa 1391-1472; Prosite puntuación de 13.531). Esta variante se postuló para afectar las funciones de andamiaje de DLG5 [44] y mejorar la estrecha unión mediada intestino permeabilidad [45]. Este polimorfismo también se ha asociado con un mayor riesgo de enfermedad inflamatoria intestinal [45], que puede conducir a un mayor riesgo de cáncer colorrectal [46]. Dado que una mayor permeabilidad intestinal se informó a conducir a una mayor absorción de 5-FU en ratas [47], que postula que el alelo T llevaría a una mejor absorción de la droga y por lo tanto una mejor respuesta. De acuerdo con nuestra hipótesis, más respondedores tienen el alelo T (MAF de 34% en respondedor vs 17% en los no-respuesta) en este estudio.
El EXO1 (exonucleasa 1) de genes se ha implicado a desempeñar funciones en la replicación del ADN, la recombinación, la reparación, la integridad de los telómeros [48], así como la señalización de daño decisiones [49]. El alelo A de rs1047840 (EXO1, E /12 /G1765A o E /13 /G1765A, E589K) provoca un amino cambio no conservada ácido y se prevé que residen dentro de una región que está altamente conservada entre el ADN XP-G /RAD2 Reparación endonucleasa Familia (HMMPanther PTHR11081). En el análisis de Kin-cohorte, el alelo A se ha asociado con un mayor riesgo de cáncer colorrectal en una población del Reino Unido [50]. Este SNP también se ha asociado con un mayor riesgo de varios otros tipos de cáncer en la población china [51] - [57]. Se postula que el aumento del riesgo de cáncer asociado a este SNP podría ser debido a una reparación menos eficiente de daño del ADN en individuos portadores del alelo A-. Como los metabolitos de 5-FU se incorpora en el ADN daños en el ADN del huésped, los mecanismos de reparación ineficientes de individuos portadores del alelo A-de este SNP pueden resultar en una mayor muerte de las células por lo tanto mejorar la eficacia del tratamiento con 5-FU. Esto es consistente con nuestras observaciones de que una mayor porcentaje de respondedores lleva el A-alelo de este SNP en comparación con los no respondedores (30% versus 16%).
CYP19A1 (citocromo P450, familia 19, subfamilia A, polipéptido 1) o de la aromatasa es un miembro de la superfamilia de citocromo P450 de enzimas y desempeña un papel importante en el metabolismo de los estrógenos. Los estrógenos se ha asociado con un menor riesgo de cáncer colorrectal [58] - [60]. Aunque se han reportado varios SNPs en el gen CYP19A1 estar asociado con riesgo de cáncer colorrectal en una población caucásica [61], SNP rs2236722 (E /2 /A115G o E /3 /A115G, W39R) no fue examinado en este estudio como es monomórfica en la población HapMap CEU. No obstante, este SNP (rs2236722), que se produce a una frecuencia de 3.3% en la población HapMap CHB y el 9,5% en nuestro estudio, provoca un amino cambio ácido no conservada a partir del triptófano hidrófobo para arginina cargada en el dominio de la familia CYP_P450 y está en relación con Polyphen [36] sea una alteración perjudicial. Por lo tanto, es posible que este cambio deletéreo en CYP19A1 puede llevar a niveles más bajos de estrógeno que conducen a un mayor riesgo de cáncer colorrectal.