Extracto
Objetivo
La evidencia reciente sugiere que varios polifenoles de la dieta pueden ejercer su efecto quimiopreventivo a través de modificaciones epigenéticas. La curcumina es uno de los agentes quimiopreventivos dietéticos más ampliamente estudiados para la prevención del cáncer de colon, sin embargo, sus efectos en las alteraciones epigenéticas, especialmente la metilación del ADN, no están claros. El uso de enfoques sistemáticos de todo el genoma, que tuvo como objetivo determinar el efecto de la curcumina en las alteraciones de metilación del ADN en las células de cáncer colorrectal.
Materiales y Métodos
Para evaluar el efecto de la curcumina en la metilación del ADN, tres CRC líneas celulares, HCT116, HT29 y RKO, fueron tratados con curcumina. 5-aza-2 'desoxicitidina (5-aza-CDR) y tricostatina A las células tratadas se utilizaron como controles positivos y negativos para los cambios de metilación del ADN, respectivamente. estado de metilación de LINE-1 elementos de repetición, los microarrays de metilación del ADN del promotor y arrays de expresión génica se utilizaron para evaluar los cambios globales de metilación y de expresión génica. La validación se realizó utilizando microarrays independientes, bisulfito de pirosecuenciación cuantitativa y qPCR.
Resultados
Como era de esperar, los microarrays de metilación de todo el genoma revelaron significativa hipometilación del ADN en 5-aza-CDR tratados con células (media ß-valores de 0,12), sin embargo, los cambios no significativos en la media de β-valores se observaron en las células tratadas con curcumina. En comparación con las células tratadas de forma simulada, alteraciones de metilación del ADN inducida por la curcumina se produjeron de una manera dependiente del tiempo. En contraste con la hipometilación generalizada global, no específica observada con 5-aza-CDR, el tratamiento de cúrcuma resultó en cambios en la metilación en loci seleccionado, parcialmente metilada, en lugar de sitios CpG metilados totalmente. alteraciones de metilación del ADN fueron apoyados por los cambios en la expresión de genes correspondientes en ambos genes arriba y hacia abajo regulada en diversas líneas celulares de CRC.
Conclusiones
Nuestros datos proporcionan pruebas de ADN previamente no reconocido por la curcumina mediada alteraciones de metilación como un mecanismo potencial de la quimioprevención del cáncer de colon. En contraste con la hipometilación mundial no específica inducida por la 5-aza-CDR, los cambios de metilación curcumina inducida se produjo sólo en un subconjunto de genes metilados parcialmente, que proporciona conocimientos mecánicos adicionales en el efecto quimiopreventivo potente de este nutracéutico dietética.
Visto: Enlace A, F Balaguer, Shen Y, Lozano JJ, Leung H-CE, CR Boland, et al. (2013) La curcumina modula la metilación del ADN en células de cáncer colorrectal. PLoS ONE 8 (2): e57709. doi: 10.1371 /journal.pone.0057709
Editor: Wei-Guo Zhu, la Universidad de Pekín Centro de Ciencias de la Salud, China
Recibido: 22 Agosto, 2012; Aceptado 25 de enero de 2013; Publicado: 27 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Link et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La presente trabajo fue apoyado por becas R01 CA72851 y CA129286 del Instituto Nacional del cáncer, de los Institutos nacionales de Salud, y los fondos del Instituto de Investigación de Baylor. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Ajay Goel actualmente se desempeña como miembro del consejo editorial de la revista PLoS One, sin embargo, esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es una de las principales causas de muerte en todo el mundo, siendo responsable de aproximadamente el 10% de la mortalidad total relacionada con el cáncer [1]. Alrededor de 3-5% del total de CRC se deben a defectos genéticos heredados y hasta 25% de los pacientes pueden tener un cierto grado de familiaridad para esta enfermedad, pero la mayoría de los CRC se produce de una manera esporádica en ausencia de una historia familiar documentado. El aumento de la evidencia indica que, además de fenotipos inestabilidad genética tales como cromosómico y inestabilidad de microsatélites, alteraciones epigenéticas que incluyen alteraciones de metilación de ADN, histonas modificaciones y alteraciones en la expresión de los genes miARN, puede jugar un papel importante en la iniciación y progresión de la CRC [2] - [ ,,,0],4].
en contraste con defectos genéticos, alteraciones epigenéticas son más dinámicas y pueden estar influidos por factores de envejecimiento, del medio ambiente, estilo de vida y en la dieta, que se cree que desempeñan un papel importante en el desarrollo de más de dos tercios de todos los cánceres humanos [5] - [7]. la metilación del ADN aberrante que consiste tanto focal
hipermetilación
de promotor islas CpG que resulta en el silenciamiento transcripcional de genes, y global
hipometilación
de ADN que facilita la inestabilidad cromosómica y aneuploidía, y es una de las más estudiadas eventos epigenéticos en el cáncer [8] - [11]. Por otra parte, dado que las alteraciones de metilación del ADN son potencialmente reversibles, y, a menudo preceden a los sucesos genéticos durante la carcinogénesis colorrectal de múltiples etapas, proporcionar una oportunidad excitante y prometedor para la prevención y el tratamiento [12] cáncer -. [17]
Sobre la base de este concepto , la terapia epigenética Actualmente se está estudiando, con el objetivo de impedir que las células cancerosas de la adquisición de la metilación aberrante del ADN y ayudando a restaurar los patrones "normales" de metilación del ADN y la expresión de genes a los genes cruciales relacionados con el cáncer. En consecuencia, los análogos de nucleósidos, tales como 5-azacitidina y 5-aza-2 'desoxicitidina (5-aza-CDR) han sido identificados como potentes inhibidores de metilo de ADN transferasa (DNMT). La incorporación de estos análogos de nucleósidos directamente en el ADN durante la replicación, así como proteosomal la degradación de la enzima que cataliza DNMT1
de novo
hipermetilación constituye dos mecanismos clave que son responsables de sus actividades demethylating [18] - [20]. Hay una conciencia creciente de que la inversión de los patrones de metilación aberrante del ADN en las células cancerosas puede ser eficaz para su tratamiento y prevención [21]. Varios de estos análogos de nucleósidos actualmente se están explorando para el tratamiento de neoplasias hematológicas y están en ensayos clínicos en fase inicial para otros tumores malignos sólidos; Desafortunadamente, la amplia utilidad de estos agentes se ha visto obstaculizada por la toxicidad y los efectos secundarios adversos. Además, la no especificidad que permite hipometilación global del genes incluso totalmente metilados y los resultados en la inestabilidad cromosómica limita el uso de estos compuestos como agentes quimiopreventivos potenciales [8], [10]. En una búsqueda para buscar estrategias alternativas quimiopreventivos, varios fitoquímicos han surgido opciones como potencialmente potentes en virtud de la falta de perfiles de toxicidad significativos [22]. Además, los datos sugieren que las perturbaciones en nutrientes de la dieta, tales como folato y selenio pueden afectar la metilación del ADN, tanto
in vitro
y
in vivo
, como resultado de una inhibición de la expresión de la proteína enzimática y DNMT1 actividad [23]. polifenoles en la dieta, tales como (-) - epigalocatequina-3-galato (EGCG) a partir de té verde y la genisteína de soja, también se ha demostrado que inhiben la actividad de DNMT en líneas celulares de cáncer [24], [25]. la actividad inhibidora de DNMT se asocia con la desmetilación y la reactivación de varios genes de metilación-silenciado como
p16, RARβ, MGMT, MLH1, BTG3
y
GSTP1
en células de cáncer humano, lo que sugiere un posible efecto quimiopreventivo debido a la modificación epigenética inducida por estos productos vegetales en la dieta [25], [26]. Sin embargo, la eficacia de desmetilación variable de los polifenoles sigue siendo poco conocida debido mayoría de estudios publicados han presentado los datos correspondientes únicamente puñado de genes, y muchos de estos efectos epigenéticos no han sido reproducible en estudios independientes [27], [28].
la curcumina (diferuloylmethane), un compuesto natural derivado de la cúrcuma (
Curcuma longa
), se ha utilizado para el tratamiento de diversas enfermedades inflamatorias en los sistemas tradicionales de India y china de la medicina. En las últimas décadas, una extensa y en profundidad cuerpo de literatura científica publicada, ha revelado que los efectos quimiopreventivos de la curcumina están mediados por una variedad de mecanismos moleculares, incluyendo su interacción directa o indirecta con diversos factores de transcripción, enzimas y proteínas reguladoras que juegan un papel central en los procesos clave relacionados con el cáncer tales como la inflamación, la proliferación, la supervivencia, la migración, la angiogénesis, la invasión y la metástasis [22]. La evidencia de la eficacia de la curcumina como un agente contra el cáncer o quimiopreventivo se ha elaborado a partir de cientos de estudios realizados en sistemas de cultivos celulares, modelos animales y seres humanos [29]. Estudios más recientes han comenzado a reconocer el efecto de la curcumina en la modulación de procesos epigenéticos en las células cancerosas, en el que la curcumina se ha demostrado que es un histona acetiltransferasa (HAT) inhibidor de [30], [31], así como un inhibidor potencial DNMT1, lo que resulta en la hipometilación de varios genes incluyendo RARβ2 en células de cáncer cervical [32] - [34]. Sin embargo, el papel de la curcumina como un compuesto de hipometilación de ADN no se ha evaluado de forma sistemática hasta el momento, y su potencial de desmetilación no se ha reproducido con éxito en su totalidad en otros estudios [32], [33].
De acuerdo con ello , en el presente estudio, se realizó un análisis exhaustivo y sistemático para investigar el efecto de la curcumina en la metilación del ADN en las células de cáncer de colon. Genoma en todo el análisis de la metilación del ADN y se realizaron estudios de perfiles de expresión génica simultánea en las líneas celulares de CRC tratados con curcumina tratamiento a corto y largo plazo. En esto, se demuestra que la curcumina modula alteraciones de metilación del ADN en las células cancerosas; Además, tales cambios son frecuentemente corroborados con los cambios correspondientes en la expresión génica. Finalmente, se proporcionan nuevos evidencia, que en contraste con la hipometilación global inducido por 5-aza-CDR, los cambios de metilación del ADN asociado con el tratamiento de cúrcuma se producen sólo en un subconjunto de genes principalmente metilados parcialmente, y de una manera dependiente del tiempo.
Materiales y Métodos
Cell Cultura y
Tres líneas celulares de CRC humanos, HCT116 (microsatélite inestable o MSI), RKO (isla CpG metilación fenotipo o CIMP) y HT29 (microsatélites estables o SMS ), se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Las células se cultivaron en medio IMDM (Invitrogen, Rockville MD) en condiciones estándar con suero bovino fetal al 10% y 5% de CO
2 a 37 ° C. La autenticidad línea celular se confirmó mediante el análisis de frecuencia diferentes marcadores genéticos y epigenéticos cada 6-8 meses.
Tratamiento curcumina
La curcumina (Sigma-Aldrich, MO, EE.UU.) las existencias se prepararon mediante su disolución en dimetilsulfóxido (DMSO) a 10 mM, y pequeñas partes alícuotas se almacenaron a -20 ° C hasta su uso. Para determinar el efecto de la curcumina en la metilación del ADN, las tres líneas celulares de CRC se expusieron a 7,5-10 M curcumina para el corto plazo (6 días; STC) o largo plazo (240 días; LTC) de tratamiento. medio de cultivo que contiene curcumina-Fresh se reemplazó cada segundo día durante el curso del tratamiento. líneas de células de control sin tratamiento con curcumina fueron cultivadas con cada conjunto de tratamientos para la misma duración.
5-aza-CDR y tratamiento TSA
tratamiento con 5-aza-CDR se llevó a cabo como se describe anteriormente [ ,,,0],35]. Brevemente, 5-aza-CDR se disolvió en PBS (pH 7,5) a 5 mM y pequeñas alícuotas se mantuvieron congeladas a -20 ° C. Veinticuatro horas después de la siembra, las células de CRC se trataron con 2,5 M 5-aza-CdR (Sigma-Aldrich, MO, EE.UU.) durante 24 h, y las células se recogieron después de 48 h. La tricostatina A (TSA) se disolvió en etanol a 0,3 M. Las células se sembraron por igual y después del crecimiento durante la noche se trataron con TSA durante 24 h. Las células se sedimentaron y se almacenaron a -80 ° C hasta su análisis.
MTT Viabilidad Ensayo
Los efectos de la curcumina sobre la viabilidad celular se determinaron en un ensayo MTT, que se basa en 3- (4 , 5-dimetiltiazol-2-il) captación -2,5-difeniltetrazolio. Las células (2 × 10
3 /pocillo) se sembraron en placas de 96 pocillos 24 h antes del tratamiento curcumina. Después de 72 h de tratamiento de cúrcuma, se añadió solución de MTT a cada pocillo y se incubó durante 2 horas a 37 ° C. Se incubaron las células con SDS Buffer (10%) con HCl 0,01 M durante la noche y se midió la absorbancia a 570 nm usando un espectrofotómetro. experimentos independientes se realizaron tres veces por triplicado.
bromodesoxiuridina (BrdU) Ensayo de proliferación
análisis de proliferación celular se realizaron con la proliferación de células colorimétrico ELISA, kit de BrdU (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) siguiente Instrucciones del fabricante. Brevemente, 2 × 10
3 Las células se cultivaron en placas de 96 pocillos y se trata con la curcumina para 72 h. índice de proliferación se midió mediante incorporación de BrdU siguiendo las instrucciones del fabricante. Los experimentos se realizaron por triplicado en 3 experimentos independientes.
Plating eficiencia
Para probar la eficiencia para el recubrimiento, las células se sembraron a una densidad baja en placas de 6 pocillos y se trataron con el protocolo de tratamiento descritos anteriormente durante 12-16 días hasta que las células individuales formaron colonias claramente visibles. A partir de entonces las células se fijaron con formalina al 10% y se tiñeron con 0,1% de cristal violeta. Después del lavado, las placas se y se tomaron imágenes digitales se secó al aire. experimentos independientes se realizaron tres veces por triplicado
Extracción de ADN, bisulfito de modificación y perfiles de metilación (Infinium La metilación de ensayo)
La extracción de ADN se realizó con el DNeasy Blood & amp.; kit Tissue (Qiagen, Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante. El ADN genómico fue modificada por bisulfito (Kit de Oro EZ metilación del ADN, Zymo Investigación, por favor agregue ciudad /estado) como se ha descrito anteriormente [35]. Para analizar el efecto de la curcumina en la metilación del ADN, se realizó ADN perfiles de metilación utilizando el ensayo de metilación Infinium con microarrays HumanMethylation27 BeadChip (Illumina, San Diego, CA), que son capaces de analizar simultáneamente el estado de metilación de 27.578 sitios CpG que abarca más de 14.000 genes [36]. la amplificación del genoma completo, el etiquetado, la hibridación y la digitalización se realizaron de acuerdo a las instrucciones del fabricante en las instalaciones de la genómica en el núcleo L. Duncan Dan Centro del Cáncer, Baylor College of Medicine, Houston, TX. El estado de metilación se midió como la relación de señal a partir de una sonda metilada en relación con ambas señales de la sonda metilados y no metilados. ratios de metilación se obtuvieron mediante los módulos de metilación en el Illumina Bead Estudio tras la normalización media, y el β-valor cuantitativo fueron de 0 (0% de metilación) al 1 (100% de metilación). El p-valor de corte para las señales de sonda detectable se fijó en 0,05. Para los análisis de metilación, un Δβ-valor de ≥0.1 (10% de metilación) se definió como significativa [37].
Los análisis de metilación cuantitativos
Hemos validado los datos de microarrays de metilación de un gen único independiente /promotor de los ensayos de metilación cuantitativos. Dependiendo de las características de diseño de ensayo de metilación, se utilizó ya sea pirosecuenciación bisulfito (sistema de pirosecuenciación PSQ SA 96A, Qiagen, Valencia, CA) o en tiempo real basado qMSP para la metilación análisis cuantitativos como se describe anteriormente [37], [38]. Primer secuencias utilizadas para ambos métodos se proporcionan en el cuadro complementario S1.
Los análisis de microarrays de expresión de genes
En paralelo con perfiles de metilación, se realizó un análisis de microarrays de expresión génica, siguiendo las instrucciones del fabricante y un protocolo previamente establecido [39]. El ARN total fue aislado utilizando el RNeasy mini-kit (QIAGEN, Valencia, CA) y se amplificó utilizando el kit de amplificación del ARN TotalPrep de Illumina. La integridad del ARN se evaluó mediante el Agilent 2100 Bioanalyzer. CRNA marcado se hibridó durante la noche a los chips humano HT12 V3, se lava, y escaneado en un Illumina BeadStation-500. BeadStudio versión de Illumina 3.1 se utilizó para generar los valores de intensidad de señal de las exploraciones, restar el fondo, y la escala de cada uno de microarrays para la intensidad media mediana para todas las muestras (de normalización por chip). La normalización se realiza utilizando cuantiles con la Lumi-R paquete. Los factores de cambio se calculan en relación con sus respectivos controles como se describe en otro lugar [35]. la vía de análisis Ingenuity (IPA, Ingenuity Systems, Inc. CA, EE.UU.) se realizó para evaluar und categorizar los genes expresados diferencialmente en diversas vías funcionales.
Análisis estadísticos
Todos los datos fueron analizados utilizando Graph Pad Prism 4.0 (San Diego, CA, EE.UU.) software estadístico. Las diferencias entre los dos grupos se analizaron mediante la prueba t de Student. Las diferencias entre más de dos grupos fueron analizados mediante medidas repetidas ANOVA y comparaciones múltiples de Bonferroni como un
post hoc
prueba. Dos valores de p lados de & lt; 0,05 se considera significativo
Resultados
La curcumina Inhibe la viabilidad celular y la proliferación de líneas celulares de CRC
Los estudios anteriores han proporcionado múltiples niveles de evidencia. para los efectos anticancerígenos de la curcumina por influir en la proliferación celular, la apoptosis, la migración y la invasión. Para determinar las concentraciones eficaces y no tóxicos curcumina en nuestro panel de líneas celulares de CRC (Figura 1A) primero realizó ensayos de proliferación y viabilidad celular en líneas celulares de CRC expuestas a diferentes concentraciones de este polifenol dietético. Se utilizaron tres líneas celulares humanas que representan distintas CRC epigenotypes de cánceres de colon humano: HCT116 (microsatélite inestable - MSI - línea celular de cáncer debido a la mutación de línea germinal en el
MLH1, España desajuste gen de reparación), RKO (células de cáncer de MSI la línea asociada con
MLH1
promotor hipermetilación en el contexto del fenotipo de la isla CpG metilación del promotor o CIMP) y HT29 (microsatélites estables o SMS, línea celular mutante con
KRAS-
y
p53
genes) [40]. ensayos de MTT y BrdU se realizaron después de tratamiento con curcumina (0-20 mM) o DMSO durante 72 h (Figura 1B & amp; 1C, respectivamente). Proliferación de las líneas celulares de CRC se vio afectada de manera exponencial en una forma dependiente de la dosis. Mientras que las concentraciones de ≥15 M se asociaron con la toxicidad, la mitad aproximada concentraciones inhibitorias máximas (CI
50) de 7,5 M durante HCT116 y 10μM de HT29 y RKO fueron determinado con base en los índices de proliferación celular. Además, los ensayos de formación de colonias se realizaron durante un período de 12-14 días (Figura 1D), que confirmó aún más la dosis óptima de 7,5 M para HCT116, y 10 mu M para las líneas de células HT29 y RKO, para posteriores experimentos de metilación del ADN.
(A) estructura química de la curcumina: (1
E
, 6
E
) -1,7-bis (4-hidroxi-3-metoxifenil) -1 , 6-heptadieno-3,5-diona. Se llevaron a cabo (B) MTT y (C) ensayos de BrdU para determinar la mejor concentración efectiva sub-tóxico de la curcumina. células CRC fueron tratados con curcumina a diversas concentraciones de 72 h (datos representan la media de experimentos independientes realizados por triplicado). Se evaluaron (D) A largo plazo, efectos antiproliferativos en un ensayo de formación de colonias. Las células fueron tratadas con la curcumina durante 12 a 16 días hasta que las colonias eran distintas visible. Imágenes representativas de de un experimento que ilustran los resultados de formación de colonias en los controles (DMSO tratada) y HCT116, RKO células cancerosas HT29 y la curcumina tratada.
La curcumina induce la desmetilación de CpG específico loci en células CRC
Para analizar las alteraciones de metilación de todo el genoma asociadas con el tratamiento de cúrcuma, hemos utilizado microarrays de Infinium con más de 27.000 CpG loci. En primer lugar, se trataron RKO (una línea celular de CRC positivo y altamente metilado CIMP) con 5-aza-CDR (un inhibidor de DNMT) y TSA (un inhibidor de HDAC potente) como controles positivos y negativos, respectivamente. Como se muestra en la Figura 2A, un solo día de tratamiento con 2,5 M 5-aza-CDR resultado en desmetilación generalizada de miles de CpG loci en células RKO. En contraste, el tratamiento TSA tuvo un efecto mínimo en la desmetilación de sitios CpG. Los ß-valores medios en células RKO se redujo de 0,39 a la 0,26 después del tratamiento con 5-aza-CDR, mientras que no hubo cambios en los valores de ß se observaron con TSA tratamiento, lo que confirma la especificidad de la desmetilación de todo el genoma de diversos sitios CpG después del tratamiento con un inhibidor de DNMT en esta condición experimental.
(a) Para el control positivo de hipometilación, se trataron células RKO con 2,5 M 5-aza-CDR. Para el control negativo, las células RKO se trataron con 0,3 mM tricostatina A (TSA). (B) Tres líneas celulares de CRC de diferentes fenotipos epigenéticos se trataron con concentraciones eficaces anti-proliferativos de la curcumina (HCT116 7,5 M, RKO y HT29 10 mM) para 6 y 240 días. El tratamiento a corto se asoció con pocos cambios en la metilación del ADN, mientras que el tratamiento a largo plazo con la curcumina dio lugar a cambios extensos en CpG de metilación. Para comparar el efecto directo del tratamiento en el estado de metilación valores Δβ
(βcontrol-βtreatment) se calcularon en consecuencia para cada locus CpG. La línea blanca representa el orden ascendente de metilación de CpG loci en líneas celulares de control /parentales. Los puntos representan la comparación directa de hacer coincidir CpG loci (& gt; 27.500) en las células tratadas
Para evaluar el efecto de la curcumina en la metilación del ADN se utilizaron dos modelos diferentes de tratamiento:. En primer lugar, hemos adoptado un uso común el tratamiento a corto plazo de las células de CRC con la curcumina en un período de 6 días [24]. En segundo lugar, se utilizó el tratamiento de cúrcuma a largo plazo durante 240 días, un modelo que probablemente mejor imita el uso de la curcumina en un entorno quimiopreventivo en los seres humanos, y uno que se supone para representar mejor las alteraciones epigenéticas curcumina inducida en clones de células que han sufrido y mantenido CpG desmetilación, dada la menor actividad de la curcumina en comparación con los inhibidores de la Dnmt disponibles en el mercado. Para examinar los efectos de la curcumina en la metilación CpG (Figura 2B), se realizó comparaciones paralelas entre corto y largo plazo curcumina tratada líneas celulares de CRC. En primer lugar, nos lo solucionaron todos los loci 27.000 CpG con el fin de metilación basado en el estado de metilación en líneas celulares de sus padres (puntos blancos que aparecen de forma acumulativa como una línea en la Figura 2) ascendente, mientras correspondientes cambios en la metilación del ADN tras la curcumina, tanto a corto como a largo plazo tratamientos se representan como puntos rojos y azules, respectivamente. Las distancias verticales de cada punto de la "línea que representa los resultados de las células de control" representan el nivel de cualquiera de hipertensión (por encima de la línea blanca) o hipo-metilación (por debajo de la línea blanca). Como se muestra en la Figura 2B, la curcumina tratamiento a corto plazo se asoció con cambios en la metilación relativamente menores en todas las líneas celulares 3, con los correspondientes cambios β-valor medio de la siguiente manera; 0,389 vs 0,393 para HCT116, 0,388 vs 0,396 para la RKO y 0,294 vs 0,291 para HT29. Por el contrario, el tratamiento de cúrcuma a largo plazo se asocia con cambios en la metilación más pronunciada en comparación con las células control (Figura 2B), aunque el cambio neto β-valor no fue significativamente diferente (0.399 para HCT116, 0,398 para la RKO y 0,275 para HT29).
la curcumina no indujo Global de metilación del ADN Cambios
Para evaluar el efecto de la curcumina en las alteraciones globales de metilación del ADN, que desplegó dos enfoques independientes. En primer lugar, se analizó el estado de metilación de elementos LINE-1, que sirven como marcadores indirectos de la metilación global, el uso de bisulfito de pirosecuenciación cuantitativa [41]. Se encontró que después de tratamiento a corto y largo plazo con LINE-1 los niveles de metilación de curcumina fueron comparables a los controles no tratados, mientras que los de 5-aza-CDR tratar líneas celulares mostraron disminuciones significativas en LINE-1 metilación (Figura 3A). En segundo lugar, el uso de la matriz de datos de metilación Infinium, visualizamos los patrones de densidad loci globales CpG utilizando los gráficos de densidad. Como era de esperar, 5-aza-CDR tratamiento se asoció con un claro desplazamiento de la línea de densidad de metilación hacia el estado no metilado, mientras que no hay cambios evidentes en los patrones de densidad global de metilación se encontraron en las líneas celulares de CRC tratados con curcumina - una observación que es coherente con nuestros LINE-1 metilación resultados que muestran una ausencia de cambios en la metilación global inducido por la curcumina (Figura 3B).
(A) HCT116, RKO y HT29 fueron tratados con 5-aza-CDR y la curcumina y LINE-1 metilación el estado se determinó mediante pirosecuenciación bisulfito. (B) Para evaluar los cambios en los patrones de metilación globales, gráficos de densidad se calcularon para los controles, líneas 5-aza-CDR y tratados con curcumina celulares utilizando microarrays de Infinium mundial de metilación. Mientras que 5-aza-CDR fue responsable de un cambio en la metilación CpG hacia hipometilación, patrón de metilación de las células después del tratamiento curcumina se mantuvo sin cambios. Abreviaturas: 5-aza-desoxicitidina (5-aza-CDR), a corto plazo el tratamiento de cúrcuma (STC), el tratamiento a largo con curcumina (LTC) guía empresas
Validación de la curcumina inducida por la metilación del ADN Las alteraciones en. líneas celulares de CRC
Como se describió anteriormente, la exposición a largo plazo a la curcumina se asocia con alteraciones de metilación más significativos en comparación con líneas celulares de CRC tratados a corto plazo. Por lo tanto, para fines de validación, redujimos nuestro enfoque sobre los efectos de la curcumina tratamiento a largo plazo utilizando dos estrategias diferentes. En primer lugar, se realizó un análisis independiente de todo el genoma de microarrays de metilación (Infinium®) usando muestras de ADN modificados bisulfito independiente coincidentes de las líneas celulares de curcumina y control. Como se describió anteriormente, se utilizó un Δβ-valor de 0,1 (equivalente a 10% de metilación), como umbral de corte para loci diferencialmente metilado. La Figura 4A ilustra el número de loci diferencialmente metiladas después del tratamiento curcumina a largo plazo que se comparte entre los dos conjuntos de microarrays de metilación. En general hemos encontrado un alto grado de correlación entre los dos experimentos (HCT116-LTC: R
2 = 0.9669, p & lt; 0,0001; RKO-LTC: R
2 = 0.9508, p & lt; 0,0001; HT29-LTC: R
2 = 0,9089; p & lt; 0,0001; RKO 5-aza-CDR: R
2 = 0,9569; p & lt; 0,0001; RKO-TSA: R
2 = 0,9484; p & lt; 0,0001). En consecuencia, confirmamos que la curcumina tratamiento a largo plazo se asocia con alteraciones de metilación del ADN en 1436 loci para HCT116, 814 para la RKO y 3051 para HT29 (Figura 4A). En segundo lugar, hemos validado con éxito los cambios de metilación en varios loci seleccionados al azar entre ellos
KM-HN-1, PTPRO, WT1
y
GATA4, España utilizando un ensayo qMSP tanto en la curcumina y 5-aza-CDR líneas celulares de cáncer de colon tratados (Figura 4B). Con la excepción de UCHL-1 (β-valor de 0-9), todos los loci validado tenía β-valor entre 0,3-0,8.
(A) Para validar los cambios en la metilación del DNA, las muestras se re -analyzed con un microarray de ADN genómico utilizando Infinium independientemente de bisulfito modificado. La cifra representa el número de CpG loci que mostraron cambios en la metilación de CpG con un valor de Δβ-≥0.1 en ambos experimentos. células tratadas 5-aza-CDR y de la TSA se utilizaron como controles positivos y negativos de validación. (B) Cuantitativo MSP (qMSP) se llevó a cabo para validar los cambios de metilación en HCT116. metilación relativa se calculó por la normalización del estado de metilación de la curcumina y 5-aza-CDR células tratadas con los controles. (C) El diagrama de Venn que muestra cambios en la metilación CpG se solapan entre HCT116, RKO y HT29 después del tratamiento con curcumina.
La curcumina inducida por metilación alteraciones producen en un medio génicas y teléfono de línea específico
a continuación preguntamos si las alteraciones de metilación del ADN curcumina inducida observados en nuestros experimentos son gene- o línea celular específica. Teniendo en cuenta las diferencias genéticas y epigenéticas entre varias líneas celulares de CRC analizados en este estudio, encontramos en las comparaciones de uno-a-uno que las 3 líneas celulares comparten en hasta un 30% CpG loci cierto grado de metilación cambios después del tratamiento con curcumina. Sin embargo, se observó que sólo 68 loci CpG se hypomethylated en todas las líneas celulares 3, lo que sugiere diferencias celulares específicos de la línea en la metilación del ADN inducido por la curcumina (Figura 4C). A continuación, queríamos ver si las alteraciones de metilación inducida por curcumina son al azar, o si hay un patrón específico para esta modificación epigenética. Para responder a esta pregunta una vez más consiguieron resultados de metilación de todos los sitios CpG 27.000 en orden ascendente, el cual cubrió de estos resultados con la media del cambio Δβ-valor en las células tratadas con curcumina (Figura 5). Además de los dos hipo e hiper-metilación de varios sitios CpG asociados con el tratamiento de cúrcuma, se observó un patrón único de cambios en la metilación de curcumina inducida claramente que diferían de la 5-aza-CDR uno en todas las líneas celulares 3. Como se muestra en la Figura 5, mientras que 5-aza-CDR inducida por hipometilación se detectó en todos los loci CpG, el tratamiento de cúrcuma se asoció principalmente con alteraciones de metilación en sitios CpG que estaban parcialmente metilada, una observación que apoya una desmetilación de genes específicos de dinámicamente metilado CpG loci que son objetivos de la modificación epigenética curcumina inducida.
los loci CpG validado de las líneas celulares fueron ordenados en orden ascendente. La figura representa la magnitud y la localización de loci CpG curcumina afectadas en relación con el control de líneas celulares. La curva gris representa la distribución de los loci CpG en orden ascendente. Las líneas negras representan los valores Δβ
(βcontrol-βtreatment) que coinciden con las células control. El tratamiento con curcumina se asoció con cambios tanto hiper e hipometilación, predominantemente en parcialmente metilado loci CpG, mientras que el 5-azaCdR tratamiento fue responsable de hipometilación no selectivo.
La curcumina inducida por alteraciones de metilación del ADN asociado con los correspondientes cambios en la expresión génica
Para comprender mejor el significado biológico de los cambios de metilación del ADN inducidas por cúrcuma, hemos analizado los perfiles de expresión génica en líneas celulares de CRC antes y después del tratamiento con curcumina a largo plazo. Para este análisis, se realizó un análisis correlativo entre los resultados de metilación de todo el genoma y los datos de expresión génica. En esto, se seleccionaron todos los loci CpG que tuvo un cambio de metilación de al menos el 10% (o un valor Δβ ± 0,1) y un cambio de expresión de al menos 1,5 veces entre el control y células tratadas con curcumina. Utilizando estos criterios, se identificaron 235 genes en HCT116, 108 genes en RKO y 543 en las células HT29 (Figura 6). Los análisis Ingenuity Pathway (IPA) revelaron que los genes con metilación del ADN de genes simultánea y alteraciones de expresión están implicados con frecuencia en múltiples procesos de regulación celular importantes, como las drogas o el metabolismo de lípidos, el transporte molecular, la biología del cáncer, la señalización celular, la respuesta inflamatoria y el ciclo celular. categorías detalladas de estos genes en las células HCT116 se presentan en la Tabla 1. Por lo tanto, nuestros datos sugieren que los cambios en la metilación inducidas por cúrcuma tienen un impacto directo sobre la transcripción de varios genes que participan en los procesos biológicos importantes que pueden ser instrumentales en la curcumina contra el cáncer mediada efectos.
Para evaluar si los cambios curcumina mediada en la metilación del ADN en correlación con la variación de la expresión génica, se realizó la expresión de genes en todo el genoma análisis.