Extracto
Este carcinoma (ACC) es un tumor endocrino muy raro, con pronóstico variable, dependiendo del tumor escenario y momento del diagnóstico. Sin embargo, generalmente es fatal, con una supervivencia global de 5 años a partir de la detección. utilidad de la radioterapia para el tratamiento del CAC ha sido ampliamente debatido y parece ser dependiente de las alteraciones moleculares, que a su vez conducen a un aumento de la radio-resistencia. Muchos estudios han demostrado que la pérdida de p53 es un factor de riesgo importante para la aparición del tumor adrenocortical maligno y se ha informado de que las mutaciones somáticas en
TP53
gen ocurren en 27-70% de los adultos esporádica ACC. En este estudio, se investigó el papel de las mutaciones somáticas del
TP53
génica en respuesta a la radiación (IR) ionizante. Se estudió el estado de p53 en dos líneas de células adrenocorticales, H295R y SW-13, la acogida formas que no funcionan de esta proteína, debido a la falta de los exones 8 y 9 y una mutación puntual en el exón 6, respectivamente. Por otra parte, estas líneas celulares muestran altos niveles de p-Akt y
IGF2
, especialmente H295R. Notamos que la restauración de la actividad de p53 llevó a la inhibición del crecimiento después de la transfección transitoria de células con p53 de tipo salvaje. Evaluación de su respuesta a IR en términos de proliferación celular y la viabilidad se determinó por medio de recuento de células y ensayo de TUNEL.
wtp53 también aumentó la sobre-expresión de la muerte celular por apoptosis después de la radiación en ambas líneas celulares. Además, RT-PCR y análisis de transferencia de Western de algunos genes diana de p53, como
BCL2
,
IGF2
y Akt demostraron que la activación de p53 después de IR dio lugar a una disminución de la
IGF2
expresión. Esto se asoció con una reducción en la forma activa de Akt. Tomados en conjunto, estos resultados ponen de manifiesto el papel de p53 en respuesta a la radiación de líneas celulares ACC, lo que sugiere su importancia como factor predictivo de la radioterapia en los casos de tumores suprarrenales malignos
Visto:. Sampaoli C, L Cerquetti, Gawhary RE , Bucci B, D Amendola, Marchese R, et al. (2012) La estabilización de p53 induce la inhibición del crecimiento y de la célula afecta a
IGF2
Camino en respuesta a la radioterapia en las células del cáncer de la corteza suprarrenal. PLoS ONE 7 (9): e45129. doi: 10.1371 /journal.pone.0045129
Editor: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesú, Italia |
Recibido: Abril 23, 2012; Aceptado: August 14, 2012; De publicación: septiembre 19 de, 2012
Copyright: © Sampaoli et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Ministerio italiano de Universidad e investigación (20085P5S49_005), por la Universidad de Roma la Sapienza (C26A1097KR), por la Fundación Guido Berlucchi per la Ricerca sul Cancro, proyecto de investigación: "Tumores del Sistema endocrino" Borgonato di Corte Franca - Brescia, Italia . Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Este carcinoma (ACC) es un tumor endocrino muy poco frecuente, con una incidencia estimada en aproximadamente 1 a 2 casos por
1 millón de personas cada año en la población adulta general [1], [ ,,,0],2], mientras que en la población infantil del sur de Brasil la frecuencia de este tipo de cáncer es relativamente alta, que van desde 3,4 a 4,2
por
millones de niños [3], [4]. distribución por edad estadístico sigue una tendencia bimodal, con un primer pico se produce en la primera infancia y una segunda en la cuarta y quinta década de la vida [2], [5].
ACC muestran pronóstico variable, dependiendo del tumor escenario y momento del diagnóstico, aunque generalmente son fatales, con una supervivencia global de 5 años a partir de la detección de [6]. La frecuencia de metástasis asociado con ACC varía en función del estudio, que van desde 30% a 85% de los pacientes con metástasis a distancia en el momento de la presentación [7].
Actualmente, la terapia que parece producir mejores resultados en ACC casos es la resección quirúrgica de la masa suprarrenal. Sin embargo, la supervivencia libre de enfermedad a los 5 años post-operatorio es sólo alrededor del 30% y las tasas de recurrencia son hasta un 85%. El tratamiento médico con O, p'DDD (orto, para ', dicloro, difenil-, dicloroetano, o mitotano) y otros fármacos citotóxicos está limitado por los efectos secundarios importantes. Por lo tanto, se necesitan otras opciones de tratamiento adyuvante después de la extirpación completa del tumor [8], [9].
La radioterapia a menudo se ha considerado ineficaz para el tratamiento del CAC. De hecho, hasta el 58% de los pacientes no muestran una respuesta significativa. Aunque los datos recogidos de los pacientes tratados con irradiación lecho tumoral adyuvante demostraron que la radioterapia puede ser eficaz en la reducción de la alta tasa de recurrencia local del CAC, la alta variabilidad en los efectos observados sugieren que se necesitan más estudios para comprender plenamente la función terapéutica eficaz de la radioterapia [8], [10]. En la actualidad, se cree que la radioterapia debe ser individualizada, teniendo en cuenta parámetros tales como el tamaño del tumor, estado de la resección, Ki-67 y el índice de propagación del tumor [11].
Por otra parte, la variabilidad de las respuestas observadas puesto de relieve la importancia de la identificación de alteraciones genéticas y moleculares implicados en la resistencia de algunos tumores a la radioterapia [2], [12]. En la actualidad, el conocimiento de las alteraciones genéticas que conducen a la predisposición del CAC es bastante pobre. Sin embargo, muchos estudios han demostrado que la pérdida de p53 es un factor de riesgo importante para la aparición del tumor adrenocortical maligno. Los pacientes afectados por el síndrome de Li-Fraumeni, que heredan mutaciones en la línea germinal de
TP53
, son más propensos a desarrollar tumores suprarrenales malignos. Por otra parte, una mutación específica en el codón 337 (R337H) parece ser responsable de la mayoría de los casos de ACC en la población infantil del sur de Brasil. Además, se ha informado también de que las mutaciones somáticas en
ocurren TP53
gen en el 25 al 70% de los adultos esporádica ACC [2], [9].
En este estudio, se determinó la papel de p53 en respuesta a la radiación ionizante (IR) en el CAC
in vitro y modelos. En concreto, se analizó el estado de
TP53
gen en dos líneas celulares humanas ACC, H295R y SW-13, y hemos encontrado que este gen está mutado en ambas líneas celulares, que son parcialmente resistentes a IR a una dosis de 6 Gy, como se ha demostrado previamente [13]. La sobre-expresión de
IGF2
ARNm es otra característica típica de la ACC encontrado en la línea celular H295R. Aquí, demostramos que la restauración de la actividad p53, por transfección de p53 de tipo salvaje (
wtp53), condujo a la inhibición del crecimiento y la muerte celular inducida por apoptosis después de la administración IR en ambas líneas celulares. También hay que destacar una disminución fiable en
IGF2
la expresión génica y una reducción de la activación de Akt después del tratamiento con IR en las células que sobre-expresan p53 de tipo salvaje.
En conjunto, estos resultados ponen de manifiesto la importancia de p53 en la respuesta celular a IR en líneas celulares de ACC. También indican un mecanismo molecular que implica IGF-2, fortaleciendo así la eficacia de la radioterapia como tratamiento adyuvante en el CAC.
Resultados
TP53
análisis de ARNm
un trabajo previo por nuestro grupo [13], una gran deleción en
TP53
gen, que afecta a los exones 8 y 9, fue descubierto en la línea celular H295R. Se realizó el análisis de secuenciación de
TP53
ha secuencia de codificación en estas células para evaluar el efecto de esta deleción en la producción de mRNA. Se encontró que un ARNm se transcribe más corto, donde el exón 7 se une directamente al exón 10 (Figura 1, panel A, arriba). En consonancia con ello, el análisis de RT-PCR de
TP53
, se llevó a cabo usando cebadores que flanquean los exones 8 y 9 región. Esto reveló un producto de ARNm más corta, que carece de 211 pares de bases (Figura 1, panel B).
(A) Representación de
TP53
mutaciones identificadas en H295R y 13 SW-líneas celulares, que muestra una gran deleción que afecta a 211 pares de bases de células H295R (arriba) y un punto de mutación homocigota en el exón 6 (
r.577c & gt; T) en
la línea celular SW-13 (parte inferior). SW-13 células exhiben también un sitio polimórfico ubicada en el exón 4 (
r.215c & gt; g
). (B) Imagen invertida en relación con el análisis de RT-PCR de los exones 7 a 10 de
TP53
gen. La electroforesis en un gel de agarosa al 2% reveló una banda principal de ~575 pb, correspondiente a SW-13 transcripción, y una banda menor de ~364 pb, correspondiente a H295R transcripción (escalera de ADN, 1 Kb plus). (C) la secuencia predicha de aminoácidos de p53 en H295R y SW-13 líneas celulares. La deleción de los exones 8 y 9 en H295R determina un desplazamiento del marco de comenzar en el codón 261, la creación de un codón de parada posterior en la posición 274 (la parte superior). En las células SW-13, un punto de mutación homocigota en el codón 193 determina una sustitución de amino-ácido (histidina a tirosina) en el DBD de la proteína (abajo). (D) Análisis de transferencia Western de p53 en H295R y las células SW-13, que muestra la presencia de una proteína más corta en la línea celular H295R, que peso molecular es ~44 kDa.
La deleción de los exones 8 y 9 determina un cambio de secuencia de aminoácidos a partir de codón 261, que también introduce un codón de parada prematuro en la posición de aminoácido 274 (Figura 1, panel C, arriba). De acuerdo con nuestros datos anteriores, este ARNm se demostró que traducirse en una proteína más corta, cuyo peso molecular es de aproximadamente 44 kDa (Figura 1, panel D).
El análisis de secuenciación de
TP53
de codificación secuencia en células SW-13 confirmó la presencia de una mutación puntual en el exón 6 homocigotos (
r.577c & gt; u
)., que fue descrito por primera vez por Reincke
et al
[ ,,,0],14] (Figura 1, panel A, abajo). Esto da lugar a cambio de aminoácido en el codón 193 (histidina a tirosina) (Figura 1, panel C, abajo). Además, hemos identificado un polimorfismo en el codón 72 (CCC a CGC) (Figura 1, panel A, parte inferior) en esta línea celular, lo que resulta en una sustitución de aminoácido en esta posición (arginina en lugar de prolina) (Figura 1, panel C, fondo). Resultando proteína p53 en estas células tiene un peso estándar molecular (Figura 1, panel D) y es altamente expresado en comparación con la línea celular LNCaP, que alberga la forma de tipo salvaje de p53, como se demostró por análisis de transferencia Western (Figura S1).
Efecto del tipo salvaje
TP53
sobre la proliferación y la respuesta de las células a las radiaciones ionizantes
para evaluar la importancia de
TP53
mutaciones sobre la proliferación celular, se transfectaron transitoriamente H295R células y SW-13 con el vector vacío (mock) o un vector que expresa la forma de tipo salvaje de
TP53 gratis (WT) y se evaluó el efecto sobre el crecimiento celular 24, 48 y 72 horas después de la transfección. También se evaluó el efecto de
TP53
restauración en respuesta a la irradiación a dosis de 6 Gy.
El mismo análisis se realizó en adenocarcinoma de ovario de radio-resistentes células SK-OV-3, que hacen no expresar ya sea proteína p53 o ARNm [15].
en las células H295R (Figura 2, panel a, izquierda), no se observó inhibición significativa del crecimiento en células que expresan p53 de tipo salvaje en comparación con las células transfectadas con el vector vacío ( -11% después de 48 h y -9% a las 72 h). Esto indica que p53 sola no es capaz de inducir una detención del crecimiento estable en estas células. IR no alteró significativamente la proliferación celular en las células transfectadas con el vector vacío (-4% después de 72 h), mientras que el efecto de la irradiación sobre el crecimiento celular era evidente en células que expresan
wtp53. Este efecto fue evidente a las 48 h después de la transfección (-18% con respecto a burlarse células irradiadas; p & lt; 0,05) y reforzó a las 72 h después de la transfección (48 h después de la irradiación), cuando la inhibición del crecimiento alcanzó -25% (p & lt; 0,01).
El crecimiento celular se evaluó en H295R, líneas SW-13 y SK-OV-3 de células transfectadas con el vector vacío (mock) o p53-vector (WT), ya sea o no irradiadas. (A) En las líneas celulares H295R (izquierda), la radiación ionizante tratamiento (IR) induce una inhibición significativa del crecimiento celular en células que expresan p53 de tipo salvaje, a partir de 48 h después de la transfección (-18% en comparación con burlarse células irradiadas; p & lt; 0,05 ) y llegar a -25% después de 72 h (p & lt; 0,01). La irradiación no induce un efecto estable en 13-SW células (derecha) transfectadas con el vector vacío, mientras que las células que expresan p53 de tipo salvaje se inhiben de manera significativa a las 48 h después de la transfección (-28%, p & lt; 0,05) hasta el final del experimento ( -31%; p & lt; 0,01). En SK-OV-3 células (parte inferior), la restauración p53 induce un fuerte efecto sobre el crecimiento celular, lo cual es evidente desde 48 a partir de la transfección (-20% de inhibición del crecimiento en la muestra de WT + IR en comparación con mock + IR; p & lt; 0,01) y soporta hasta 72 h (-28%, p & lt; 0,01). Los datos son la media ± S. D. de al menos tres experimentos independientes realizados por duplicado. (B) Análisis de transferencia de Western de la ciclina E y la ciclina D1 expresión en células H295R a las 72 h después de la transfección reveló una baja regulación de estas proteínas en células que expresan
wtp53 tratados con IR a una dosis de 6 Gy. (C) Análisis de la ciclina E y la expresión de ciclina D1 en SW-13 línea celular por transferencia Western muestra una disminución en los niveles de proteína en las muestras transfectadas con p53-vector después de la irradiación. intensidades de las bandas 'se cuantificó con el software ImageJ, utilizando vinculina para la normalización. (*, P & lt; 0,05).
A diferencia de nuestro informe anterior [13], en este trabajo hemos mejorado la eficacia de transfección mediante el uso de vectores pBABE-neo-p53, que contiene la repetición de MMLV Terminal Larga. Morgenstern y Land [16] apoyar la capacidad de este vector para mejorar en gran medida la expresión de genes en muchas líneas celulares.
Resultados similares fueron observados en la línea celular SW-13 (Figura 2, panel A, derecha). Las células transfectadas con vector vacío o p53-vector mostraron una tendencia proliferación muy similar. Por otra parte, la irradiación no afectó significativamente la proliferación celular en las células transfectadas con el vector vacío. Por el contrario, un fuerte efecto del tratamiento con IR en células que expresan
wtp53 fue evidente a las 24 h después de la irradiación (48 h después de la transfección), con 28% de inhibición del crecimiento celular (p & lt; 0,05) en comparación con células irradiadas transfectadas con vacío vector. El efecto fue aún mayor a las 72 h después de la transfección, cuando se observó 31% de inhibición del crecimiento en WT células irradiadas comparación con el control (p & lt; 0,01).
En SK-OV-3 células (Figura 2, panel a, parte inferior), la restauración de
wtp53 indujo una ligera inhibición del crecimiento celular, que sin embargo no exceda de 17% después de 72 h. También se observó que el tratamiento IR a una dosis de 6 Gy induce una inhibición del crecimiento de -27% (p & lt; 0,05) después de 24 h en las células transfectadas con el vector vacío, que llegaron a -35% (p & lt; 0,01) después de 48 h. Sin embargo, la presencia de
wtp53 fortaleció el efecto del tratamiento con IR. De hecho, se observó una inhibición del crecimiento celular de -20% (p & lt; 0,01) 24 h después de la irradiación en células que expresan p53 en comparación con las transfectadas con el vector vacío. Este efecto aumentó después de 48 h (-28%, p & lt; 0,01).
La importancia de p53 en SK-OV-3 células respuesta a la irradiación se confirmó por la observación de que las células transfectadas con el vector vacío comenzaron a recuperar 72 h después del tratamiento IR, mientras que las que expresan
wtp53 continuó ser inhibida (datos no mostrados).
en H295R y líneas SW-13 de células, el efecto de estabilización de p53 en ciclina e y la ciclina D1 se evaluó, ya que estas proteínas contribuyen a la proliferación celular mediante la aceleración de la fase G1 del ciclo celular [17], [18]. A las 72 h después de la transfección con el vector vacío (mock) o vector p53 (WT), se observó una disminución en los niveles de ciclina E y la expresión de ciclina D1 en las muestras que expresan
wtp53 se irradia con una dosis de 6 Gy, en tanto H295R (Figura 2, panel B) y SW-13 (Figura 2, panel C) células. Este resultado, por tanto, indica que el tratamiento IR es capaz de frenar la tasa de proliferación de nuestras líneas de células de una manera dependiente de p53.
Estos datos indican que la restauración de
wtp53 expresión en H295R y 13 SW-líneas celulares no es suficiente para ejercer un efecto sobre la proliferación celular. La presencia de la forma de tipo salvaje de p53 parece ser fundamental para la inhibición del crecimiento de estas células en respuesta a la irradiación, como células transfectadas con el vector vacío apenas se ven afectados por este tratamiento. Sin embargo,
wtp53 células que expresan se inhiben de manera significativa.
En SK-OV-3 células, el efecto de IR es más fuerte que en H295R y las células SW-13, incluso en las muestras transfectadas con el vector vacío, lo que sugiere que esta línea celular es más sensible a la radiación de las líneas celulares de ACC. Sin embargo, la inhibición del crecimiento máximo se alcanza cuando se expresa la forma de tipo salvaje de p53, lo que indica que esta proteína está implicada en la respuesta a IR en SK-OV-3 células también.
estabilización de p53 en respuesta a las radiaciones ionizantes
Wild tipo de expresión de p53 se evaluó mediante RT-PCR y Western Blot. los niveles de p53 aumentaron significativamente en H295R y SW-13 líneas celulares a las 24 h después de la transfección con el vector pBABE-neo-p53 y estaban máximo a las 48 h. En 72 h de transfección, se observó una disminución en los niveles de p53, lo que parecía ser debido a una reducción en
TP53
ARNm, probablemente debido a la pérdida de vectores transfectadas (Figura S2).
Sin embargo, en las células transfectadas con p53 de tipo salvaje se somete a tratamiento con IR, el efecto sobre la proliferación celular fue más fuerte después de 72 horas después de la transfección (48 h después de la irradiación). Por lo tanto, los niveles de expresión de p53 se evaluaron mediante RT-PCR e inmunotransferencia de tipo Western en H295R, SW-13 y SK-OV-3 células en el mismo punto de tiempo
.
tiempo real RT-PCR análisis confirmó que
TP53
gen se sobreexpresa en todas las muestras transfectadas con el vector pBABE-neo-p53 (Figura 3, paneles a, C, E), ya sea irradiado o no. En comparación con el simulacro,
TP53
ARNm fue de 5 y 3 veces más expresada en H295R y las células SW-13, respectivamente. Según Yaginuma y Westphal [15], en SK-OV-3 células, no hay
TP53
mRNA fue detectable en las muestras simuladas, contrariamente a las células transfectadas con p53-vector.
Niveles
de expresión de
TP53
y proteína p53 evaluada por tiempo real RT-PCR e inmunotransferencia de tipo Western en H295R, SW-13 y SK-OV-3 células 72 h después de la transfección con el vector vacío (mock) o p53-vector (WT) . Las muestras fueron tratadas con IR a una dosis de 6 Gy donde se indica. (A) RT-PCR (arriba) y en tiempo real de RT-PCR (abajo) el análisis de
TP53
expresión en células H295R. Las muestras transfectadas con pBABE-neo-p53 espectáculo vector de un aumento de 5 veces en
TP53
ARNm en comparación con el simulacro. (B) análisis de transferencia Western de p53 en las células H295R (arriba) reveló una banda principal de ~53 kDa (
wtp53) y una banda menor de ~44 kDa, correspondiente a la forma truncada de p53 (p53
Δ8 -9). densitometría muestra que
wtp53 se estabiliza mediante tratamiento con IR (parte inferior). análisis (C) RT-PCR de
TP53
mRNA en células SW-13 muestra la sobre-expresión del gen en las muestras transfectadas con el vector pBABE-neo-p53 (parte superior). Real de análisis Time RT-PCR reveló un aumento de 3 veces en
TP53
transcripción en las muestras transfectadas con el vector de p53. La expresión de
TP53
no está modulada por la irradiación (parte inferior). (D) Los niveles de proteína p53 en las células SW-13 aumentan significativamente después del tratamiento IR en las células transfectadas con el vector pBABE-neo-p53, mientras que ningún cambio es detectable en las muestras transfectadas con el vector vacío. (E) en células SK-OV-3 células, no
TP53
transcripción fue detectable por RT-PCR en las muestras transfectadas con el vector vacío, mientras que en las células transfectadas con el vector pBABE-neo-p53 una señal fuerte, correspondiente a
TP53
ARNm, es observable (la parte superior). El tiempo real de análisis RT-PCR muestra ninguna modulación de
TP53
expresión después de la irradiación (parte inferior). (F) Análisis de transferencia de Western de p53 en células SK-OV-3 células reveló una banda detectable sólo en las muestras transfectadas con el vector pBABE-neo-p53 (arriba). Densitometría muestra que los niveles de p53 aumentan después de la irradiación, lo que indica la estabilización de la proteína (abajo). Los resultados representan al menos tres experimentos independientes.
GAPDH Opiniones y vinculina se utilizaron para la normalización. (*, P & lt; 0,05; #, p & lt; 0,01).
A pesar de
TP53
niveles de mRNA fueron más altos en las células transfectadas con p53, que no varió entre el TE y no irradiadas -irradiated células. Por el contrario, los niveles de proteína p53 parece ser significativamente mayor en las células p53 transfectadas sometidas a tratamiento IR comparación con los no irradiados. De hecho, en las células H295R los niveles de p53 de tipo salvaje aumentaron 3 veces en las células WT irradiados en comparación con las células p53 transfectadas, no irradiadas (Figura 3, panel B). Sin embargo, la forma endógena de p53 (p53
Δ8-9) no fue modulada por tratamiento de radiación. células SW-13 mostraron un aumento de 1,3 veces en la p53 en muestras WT irradiados en comparación con WT (Figura 3, panel D), mientras que p53 era 1,5 veces mayor en las células irradiadas SK-OV-3 en comparación con las células no tratadas (Figura 3, panel F).
El tratamiento de H295R y SW-13 células con diferentes dosis de radiación (4, 6 y 8 Gy) confirmaron que
TP53
los niveles de expresión de ARNm no fueron influenciados por IR (Figura S3, los grupos A, C). La administración de una dosis de radiación de 4 Gy no indujo una variación significativa en la proteína p53 tampoco. Por el contrario, p53 se upregulated después de la administración de dosis de radiación de 6 y 8 Gy; sin embargo, no se observaron cambios significativos entre estos dos dosis (Figura S3, paneles B, D), lo que indica que el tratamiento IR a una dosis de 6 Gy es suficiente para inducir una estabilización de p53 en líneas celulares de ACC
.
El aumento en los niveles de proteína p53 observados en muestras irradiadas no se debe a un aumento en
TP53
expresión, ya que los niveles de ARNm no se vieron afectados por la radiación. Esto puede explicarse por una activación de p53 por IR, lo que se traduce en una estabilización de esta proteína sólo en células sometidas a este tratamiento. La estabilización de p53 puede ser considerado predictivo de su activación, lo que explica el efecto sobre la proliferación celular sólo se observa en las muestras que recibieron irradiación.
TUNEL análisis de la muerte celular
Como p53 es un bien inductor del proceso apoptótico conocida en respuesta a las tensiones genotóxicos [19], [20], se realizó un ensayo de TUNEL con el fin de analizar la presencia de apoptosis en H295R, 3 SK-OV-líneas celulares SW-13 y transfectadas con el vector vacío (mock) o p53-vector (WT), ya sea irradiado o no.
Como era de esperar, no hay signos de apoptosis fueron detectables en las muestras no sometidas a tratamiento con IR (datos no mostrados). La muerte celular apoptótica también estaba ausente en las células irradiadas transfectadas con el vector vacío, mientras que las muestras en las que se expresó la forma de tipo salvaje de p53 parecía ser positiva a la tinción de TUNEL en todas las líneas celulares (Figura 4, panel A), lo que indica que la presencia de un p53 funcional es necesaria para la inducción de la muerte celular en respuesta a la radioterapia
.
H295R, SW-13 y SK-OV-3 líneas de células fueron transfectadas con el vector vacío (mock) o p53-vector (WT) y se irradia a una dosis de 6 Gy. ensayo (A) TUNEL se realizó a los 48 y 72 después de la transfección. En todas las líneas celulares, células TUNEL-positivas son detectables sólo en muestras irradiadas que expresan la forma de tipo salvaje de
TP53
. Las células también se tiñeron con Hoechst 33342 y después se visualizaron con un microscopio de fluorescencia con una ampliación de 40 aumentos. La figura que se muestra es representativa de tres experimentos realizados por duplicado. (B) Porcentaje de apoptosis en H295R, SW-13 y SK-OV-3 se calculó mediante la comparación de células TUNEL positivas con células totales, teñidas con Hoechst 33342. Apoptosis aumentos en las células transfectadas con el vector de p53 en comparación con las muestras de forma simulada irradiado, a partir de 48 h desde la transfección y se refuerza el efecto después de 72 h. (*, P & lt; 0,05; #, p & lt; 0,01). (C)
BCL2
expresión se evaluó en la línea celular H295R por RT-PCR. restauración p53 induce una reducción significativa en
BCL2
expresión a las 48 y 72 h después de la irradiación. (D) imágenes invertidas con relación al semi-cuantitativa análisis RT-PCR de
expresión BCL2
gen realizado sobre células SW-13, que muestra una reducción significativa en
BCL2
señal en las células transfectadas con p53 vector después de un tratamiento de radiaciones ionizantes. (E) El efecto de la restauración de p53 en
BCL2
niveles de mRNA en respuesta a la irradiación se evaluó en líneas de células SK-OV-3. p53 inhibe
BCL2
expresión y el efecto es más fuerte a las 72 h después de la transfección. Las imágenes son representativas de al menos tres experimentos independientes.
GAPDH
se utilizó para la normalización.
La apoptosis fue detectable a las 48 h después de la transfección de
wtp53 y el aumento a las 72 h después de la transfección (48 h después de la irradiación) en toda la célula líneas (Figura 4, los grupos A, B, Tabla S1). La muerte celular apoptótica se incrementó en 2,6 veces a las 48 h en células H295R irradiadas transfectadas con p53-vector en comparación con las células transfectadas con el vector vacío (10,3%
vs
3,9%) (p & lt; 0,05) y por 4,4 veces a las 72 h (15,1%
vs
3,4%) (p & lt; 0,01) (Figura 4, panel B, Tabla S1). diferenciadas menos células SW-13 también mostraron un aumento de 2 veces en la apoptosis a las 48 h (8,4%
vs
4,3%) (p & lt; 0,05) y un aumento de 3,7 veces a las 72 h después de la transfección (16,3 %
vs
4,4%) (p & lt; 0,01) en la muestra irradiada WT en comparación con las células irradiadas simuladas (Figura 4, panel B, Tabla S1). Del mismo modo, la transfección de vector vacío no afectó en gran medida la muerte celular en la línea celular SK-OV-3 o bien, mientras que la transfección de
wtp53 aumentó significativamente el porcentaje de células apoptóticas en respuesta a tratamiento de radiación por 2 veces a las 48 h (8,7%
vs
4,2%) y fue de 3.5 veces a las 72 h (17,1%
vs
4,9%) (p & lt; 0,05) (Figura 4, panel B;. Tabla S1)
Debido a que muchos informes han demostrado que la p53 es capaz de reprimir
BCL2
expresión en respuesta a un estímulo de apoptosis [21] - [23], se analizaron
BCL2
niveles de mRNA en las células tratadas con IR , ya sea expresando la forma de tipo salvaje de
TP53 gratis (WT) o no (simulada), a las 48 hy 72 h después de la transfección. RT-PCR análisis reveló que
BCL2
niveles de expresión disminuida en las células irradiadas sólo cuando
wtp53 estaba presente, mientras que se mantuvieron estables en muestras transfectadas con el vector vacío. De acuerdo con los resultados del ensayo de TUNEL,
niveles BCL2
comenzaron a disminuir a partir de 48 h y niveles mínimos se observaron a las 72 h después de la transfección (Figura 4, panel C, D, E).
estos datos confirman que se requiere p53 de tipo salvaje para la inducción de la muerte celular por apoptosis y la regulación a la baja de
BCL2 Hoteles en respuesta a la irradiación en H295R y las células SW-13. Por otra parte, la ausencia de estos efectos en las células irradiadas que expresan sólo la p53 mutante endógena parece indicar que estos mutantes son no funcionan las proteínas son de ninguna manera influido por tratamiento con IR.
Efecto en
IGF2
expresión
IGF-II representa el principal marcador de la ACC [24], [25] y su expresión está estrechamente regulada por p53 [26], [27]. Desde hemos demostrado que
wtp53 es capaz de reducir la proliferación celular e inducir la apoptosis en líneas celulares de ACC en respuesta a IR, también se investigó el efecto de la activación de p53 en
IGF2
expresión. análisis RT-PCR de
IGF2
la expresión de ARNm en las células H295R (Figura 5, panel A) reveló que la irradiación no alteró
IGF2
niveles en las muestras transfectadas con el vector vacío. Sin embargo,
IGF2
expresión se redujo en 48 h después de la transfección (24 h después de la irradiación) y disminuyendo drásticamente a las 72 h después de la transfección (-42%, p & lt; 0,01) en células que expresan p53 de tipo salvaje
.
(a) imágenes invertido en relación con semi-cuantitativos RT-PCR análisis de
IGF2
expresión génica realizó en células H295R, mostrando una pérdida masiva de
IGF2
señales en las células irradiadas a 72 h después de la transfección de p53-vector (WT). (B) Análisis de RT-PCR de
IGF2
niveles de mRNA realiza en SW-13 células. Una reducción significativa en
IGF2
expresión es detectable en las células transfectadas con p53-vector (WT) después del tratamiento de radiaciones ionizantes. Las imágenes son representativos de tres experimentos independientes.
GAPDH
expresión se utilizó para la normalización y la intensidad de las bandas 'se cuantificaron utilizando ImageJ. densitometría de la banda se muestra en los paneles de la derecha. (*, P & lt; 0,05; #, p & lt; 0,01).
Se observaron resultados similares en la línea de SW-13 de células (Figura 5, panel B), aunque estas células expresan niveles muy bajos de
IGF2
ARNm. Incluso en este caso, ningún efecto sobre
se observó IGF2
expresión después de la administración IR en células que expresan p53 mutante endógeno, mientras que una fuerte disminución en
IGF2
niveles de mRNA se observó en las células transfectadas con
wtp53 vectorial. Esta disminución fue máxima a las 72 h después de la transfección (-35%, p & lt; 0,05).
Efecto sobre la activación de Akt
Finalmente, se investigó el efecto de IR sobre la activación de Akt en H295R y SW -13 líneas celulares o bien transfectadas con el vector p53 (WT) o no (mock). Esta proteína, de hecho, es un principal efector aguas abajo de la vía de señalización de IGF-II y un regulador negativo clave del proceso apoptótico
.
análisis de transferencia de Western de Akt total y de su forma activa fosforilada en H295R (Figura 6 , panel a) y SW-13 (Figura 6, panel B) células revelaron que Akt estaba presente en todas las muestras y no fue influenciada por
wtp53 expresión (datos no mostrados). Por el contrario, el análisis densitométrico de p-Akt normalizado a Akt total mostró que las células transfectadas con el vector de p53 muestran una marcada disminución en la fosforilación de Akt en respuesta a IR en comparación con los controles, lo que significa que la activación de p53 puede ser capaz de reprimir la actividad de los anti proteína -apoptotic Akt.
(a) análisis de transferencia de Western de los niveles de Akt total de Akt y fosforilados, realizado en células H295R irradiadas transfectadas con el vector vacío (mock) y p53-vector (WT) a las 48 y 72 h después de transfección. El análisis densitométrico de Akt normalizado a vinculina y p-Akt
frente
Akt muestra que la expresión de Akt no está influenciada por el estado de p53, mientras que la forma activada de la proteína se reduce significativamente en las células
wtp53 expresan. (B) Total lisados de células obtenidas a partir de SW-13 línea celular se sometieron a anticuerpos utilizando el Western Blot análisis de segmentación de Akt y Akt-pSer473. los niveles de fosforilación de Akt se reducen de manera significativa por la estabilización de p53 en respuesta a tratamiento con radiación ionizante. Los resultados mostrados son representativos de al menos tres experimentos. Bandas 'intensidades fueron cuantificados usando ImageJ y bandas' densitometría se muestra en los paneles de la derecha. (*, P & lt; 0,05; #, p & lt; 0,01).
De acuerdo con nuestros datos sobre la proliferación celular y la apoptosis, el efecto sobre la fosforilación de Akt fue evidente a las 48 h después de la transfección (-16% en H295R y -17% en las células SW-13, respectivamente) y era máximo a las 72 h después de la transfección (-53% en H295R y -51% en las células SW-13; p & lt;. 0.01)
Discusión
ACC es una neoplasia agresiva y heterogénea y la mayoría de las opciones terapéuticas son a menudo sin éxito, lo que indica que se necesitan estrategias terapéuticas alternativas para el CAC [8], [9].